復(fù)方穿心蓮片的薄層鑒別研究

張慧曄， 潘雪峰，2， 徐小飛， 鄧喬華， 王德勤*

(1. 廣州白云山和記黃埔中藥有限公司，廣東廣州510515;2. 廣東藥學(xué)院中藥學(xué)院，廣東廣州510006)

復(fù)方穿心蓮片為OTC 藥，清熱解毒，利濕;常用于風(fēng)熱感冒、咽喉疼痛，濕熱泄瀉;處方由穿心蓮、路邊青二味藥材組成。復(fù)方穿心蓮片收載于《衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)》中藥成方制劑第十九冊(cè)［1］，原標(biāo)準(zhǔn)鑒別項(xiàng)下(1)和(2)分別是為了檢驗(yàn)制劑中是否含有穿心蓮和路邊青，選用的對(duì)照化合物或?qū)φ账幉姆謩e是脫水穿心蓮內(nèi)酯和路邊青對(duì)照藥材。針對(duì)路邊青的鑒別項(xiàng)，操作時(shí)候?qū)o(wú)水條件的要求嚴(yán)格，得到的結(jié)果中黃色斑點(diǎn)不清晰，不利于觀察和鑒別;另外，在《中國(guó)藥典》2010 年版、2015 年版的編寫(xiě)中，均主張薄層鑒別中不再使用例如“苯”、“三氯甲烷”這樣的有毒試劑。因此，本研究對(duì)提取方法、展開(kāi)系統(tǒng)及顯色方法進(jìn)行了新的探索，擯棄了存在于原薄層鑒別方法中不利于操作者安全的試劑“三氯甲烷”，得到了一個(gè)安全、便利和專(zhuān)屬性強(qiáng)的薄層鑒別方法。

1 儀器與試藥

穿心蓮內(nèi)酯(批號(hào)110797-200307)、脫水穿心蓮內(nèi)酯(批號(hào)110854-201007)、路邊青對(duì)照藥材 (批號(hào)121227-200804)，穿心蓮對(duì)照藥材(批號(hào)121082-201004)購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院，新穿心蓮內(nèi)酯(批號(hào)120106)，購(gòu)于上海融禾醫(yī)藥科技有限公司。硅膠G (批號(hào)051007)青島海洋化工廠生產(chǎn)，自制板規(guī)格10 mm ×20 mm，厚度0.5 mm;預(yù)制板為青島海洋化工廠生產(chǎn)，規(guī)格為10 mm ×20 mm，厚度0.2 ～0.25 mm。其他所用試劑為分析純。

復(fù)方穿心蓮片5 批，F(xiàn)2D001、F2D002、F2D003 為廣州白云山和記黃埔中藥有限公司生產(chǎn);L11I111、L11K232為廣東羅浮山國(guó)藥股份有限公司生產(chǎn)。

2 方法與結(jié)果

2.1 供試品溶液的制備 取復(fù)方穿心蓮片15 片，除去糖衣，研細(xì)，加石油醚30 mL，超聲30 min，棄去石油醚液，殘?jiān)尤胍宜嵋阴?0 mL，超聲30 min，乙酸乙酯部分濃縮至1 mL，作為供試品溶液。

2.2 對(duì)照品及對(duì)照藥材溶液的制備 取路邊青藥材10 g，加200 mL 水，超聲30 min，濾過(guò)，用等體積乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯部分濃縮至2 mL，作為路邊青對(duì)照品溶液。取穿心蓮內(nèi)酯、新穿心蓮內(nèi)酯、脫水穿心蓮內(nèi)酯對(duì)照品，加甲醇制成每1 mL 含1 mg 的溶液，作為對(duì)照品溶液。

2.3 陰性對(duì)照藥材溶液的制備 穿心蓮600 g，照復(fù)方穿心蓮片的制法，制成不含路邊青藥材的陰性對(duì)照品;路邊青1 400 g，照復(fù)方穿心蓮片的制法，制成不含穿心蓮藥材的陰性對(duì)照品;再照供試品溶液的制備方法，分別制備成不含穿心蓮的陰性供試品溶液和不含路邊青的陰性供試品溶液。

2.4 薄層層析 參照《中國(guó)藥典》2010 年版一部附錄VIB 薄層色譜法，吸取供試品溶液、對(duì)照品與對(duì)照藥材溶液及陰性溶液各8 μL，分別點(diǎn)樣于同一普通硅膠G 薄層板上。以展開(kāi)劑乙酸乙酯-甲醇(95 ∶5)上行展開(kāi)，取出，晾干，噴以1% ～2.5%香草醛的60% ～70%硫酸溶液。供試品色譜中，在與穿心蓮內(nèi)酯與脫水穿心蓮內(nèi)酯對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同的斑點(diǎn);再用電熱吹風(fēng)機(jī)或電熱板加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，自然光下觀察，在與路邊青對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯一個(gè)相同斑點(diǎn)，其中的藍(lán)青斑點(diǎn)為路邊青主要專(zhuān)屬性斑點(diǎn)。環(huán)境溫度為室溫，濕度為70%。見(jiàn)圖1。

圖1 復(fù)方穿心蓮片薄層鑒別圖譜

3 討論

薄層色譜法(thin layer chromatography，TLC)是一種常用的微量分離方法，20 世紀(jì)50 年代開(kāi)始得到廣泛使用，可用于樣品分離和分析［2］。傳統(tǒng)TLC 技術(shù)由于精密度和重現(xiàn)性均較差，曾被其他快速發(fā)展起來(lái)的分離分析技術(shù)所取代，80 年代后，隨著薄層在色譜板、點(diǎn)樣技術(shù)、展開(kāi)技術(shù)方面的發(fā)展，薄層色譜的規(guī)范化和儀器化程度大大提高。加之直觀、經(jīng)濟(jì)、簡(jiǎn)便的特點(diǎn)，仍然在中藥多樣品的分析中發(fā)揮作用［3］。

常規(guī)薄層色譜的固定相為未改性的硅膠、氧化鋁、硅藻土、纖維素和聚酰胺等，其中最常用的為硅膠正相色譜，其優(yōu)點(diǎn)是設(shè)備簡(jiǎn)單，易于操作，成本小;高效薄層色譜(HPTLC)采用更細(xì)、更均勻的改性硅膠和纖維素為固定相，對(duì)吸附劑進(jìn)行疏水和親水改性，可以實(shí)現(xiàn)正相和反相薄層色譜分離，提高了色譜的選擇性［4］，如棒狀薄層色譜(TLC-FID)、加壓薄層色譜 (OPLC)、離心薄層色譜(CTLC)、膠束薄層色譜 (M-TLC)［5］、包合薄層色譜(ICC)［6］、二維薄層(2D TLC)［7］等。薄層色譜檢測(cè)方法根據(jù)吸收原理有吸收測(cè)定法、熒光測(cè)定法和熒光猝滅法，如薄層掃描法［8］;另外薄層色譜法還能與紅外光譜［9］、質(zhì)譜［10］、拉曼光譜［11］等檢測(cè)方法聯(lián)用，與生物信息學(xué)結(jié)合發(fā)展為全息薄層色譜鑒別［12］和薄層指紋圖譜鑒別［13］，與生理生化結(jié)合，出現(xiàn)了薄層生物自顯影技術(shù)［14］。本實(shí)驗(yàn)使用常規(guī)的薄層色譜進(jìn)行鑒別復(fù)方穿心蓮片。經(jīng)多批樣品試驗(yàn)，該方法主斑點(diǎn)清晰，易于檢出，重現(xiàn)性好，可以準(zhǔn)確、有效地鑒別出路邊青和穿心蓮。

3.1 與《衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)》中藥成方制劑第十九冊(cè)復(fù)方穿心蓮片薄層色譜方法相比，修訂后的方法增加了薄層鑒別的專(zhuān)屬性?，F(xiàn)有方法中［1，15-16］，針對(duì)路邊青的顯色斑點(diǎn)為黃色，此點(diǎn)常常為黃色條帶，較模糊，經(jīng)過(guò)改變顯色試劑的濃度與顯色方式，發(fā)現(xiàn)噴以1% ～2.5%香草醛的60%～70%硫酸溶液后加熱，能較好地對(duì)路邊青藥材中一藍(lán)青色特異斑點(diǎn)進(jìn)行顯色，可見(jiàn)光下觀察，斑點(diǎn)清晰，重現(xiàn)性好且不易受潮濕環(huán)境影響;另外，本實(shí)驗(yàn)改變了原有方法中的顯色步驟，可同時(shí)鑒別穿心蓮和路邊青兩種藥材，在噴了顯色劑后，針對(duì)穿心蓮使用了在不加熱的方法，使得穿心蓮顯色的斑點(diǎn)雜質(zhì)較少，更能凸顯出穿心蓮內(nèi)酯、新穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯主斑點(diǎn)的特征性。針對(duì)路邊青使用了加熱方法，使得路邊青的鑒別更加有特征性。

3.2 本方法直接用石油醚、乙酸乙酯等有機(jī)試劑對(duì)藥材進(jìn)行超聲萃取，比現(xiàn)有技術(shù)方法［1，15-16］更加安全、簡(jiǎn)便。在對(duì)路邊青分部萃取中發(fā)現(xiàn)，藍(lán)青色特異斑點(diǎn)存在于乙酸乙酯部分和正丁醇部分，在石油醚部分不存在，在正丁醇萃取后余下的部分少量存在，可能是正丁醇萃取不完全的原因造成的。穿心蓮內(nèi)酯，新穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯也同樣在穿心蓮乙酸乙酯和正丁醇萃取部分中存在。另外，對(duì)薄層條件進(jìn)行摸索中，試驗(yàn)了石油醚-乙酸乙酯-甲醇系統(tǒng)，石油醚-丙酮-甲醇系統(tǒng)，得到的效果均不如乙酸乙酯-甲醇系統(tǒng)的效果好。

3.3 對(duì)影響薄層鑒別的主要因素如不同薄層板的比較、展開(kāi)溫度、濕度等進(jìn)行考察，發(fā)現(xiàn)薄層板的種類(lèi)、溫度對(duì)分離效果影響都較小;本方法更適合南方濕度較大的環(huán)境，在高濕度條件下，原鑒別中針對(duì)路邊青的黃色斑點(diǎn)很容易暈染，本實(shí)驗(yàn)中所述的藍(lán)青色斑點(diǎn)則很清晰;對(duì)于濕度較低的環(huán)境，本實(shí)驗(yàn)中所述的藍(lán)青色斑點(diǎn)比較難以顯色，在展開(kāi)劑中滴加0.2% ～0.4%的水用于展開(kāi)即可。

［1］ 中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥典委員會(huì). 中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)中藥成方制劑［S］. 第十九冊(cè)，1996:115.

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