續(xù)斷煮散顆粒煎煮工藝正交試驗(yàn)與溶出曲線的研究

唐安玲， 宋 英 ， 李圓圓， 王聰穎， 賀寶瑩

(1. 成都中醫(yī)藥大學(xué)，四川 成都610075;2. 成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，四川 成都610072)

續(xù)斷為川續(xù)斷科植物川續(xù)斷Dipsacus asper Wall. ex Henry 的干燥根，其味苦、性微溫，歸肝、腎經(jīng)，具有補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨、續(xù)折傷、止崩漏、安胎等功效，臨床上主要用于腰背酸痛，肢節(jié)瘓痹，損筋折骨，胎動(dòng)漏紅，血崩下血，以及遺精、帶下、癰疽瘡腫［1］。續(xù)斷的有效成分有皂苷、生物堿、揮發(fā)油、多糖及其他生物活性成分［2］，川續(xù)斷皂苷Ⅵ為續(xù)斷藥材及其制劑中的主要有效成分。中藥煮散是指將中藥飲片粉碎成顆粒與水共同煎煮后，去渣取汁而制成，它保持了傳統(tǒng)湯劑的煎煮過(guò)程和療效，能夠很好的適應(yīng)病情需要、隨證加減，具有傳統(tǒng)湯劑吸收快、療效高的優(yōu)點(diǎn)［3-4］。續(xù)斷煮散顆粒是續(xù)斷傳統(tǒng)飲片經(jīng)粉碎、加水?dāng)D出制粒、干燥等工序制成的單味中藥煮散顆粒劑，是根據(jù)中藥煮散機(jī)理而研制的新型中藥飲片，其目的是保留其藥性藥效的同時(shí)，減少續(xù)斷的用量和煎煮時(shí)間，提高續(xù)斷的利用率［5-6］。本實(shí)驗(yàn)以干膏率和川續(xù)斷皂苷Ⅵ量［7-8］為評(píng)價(jià)指標(biāo)，通過(guò)正交試驗(yàn)和溶出曲線考察續(xù)斷煮散顆粒的煎煮工藝，對(duì)續(xù)斷煮散顆粒進(jìn)行煎煮質(zhì)量評(píng)價(jià)。

1 儀器與試藥

HP-1100 高效液相色譜儀(美國(guó)惠普公司):惠普四元梯度泵，惠普自動(dòng)進(jìn)樣器，惠普柱溫箱;Hypersil BDS 色譜柱(150 mm×4.6 mm，5 μm，大連依利特分析儀器有限公司);BP211D 電子分析天平(德國(guó)Sartorius 公司);XFB-400B 小型中藥粉碎機(jī)(吉首市中誠(chéng)制藥機(jī)械廠);電熱恒溫水浴鍋(雙列八孔，北京市永光明醫(yī)療儀器廠);超聲清洗器(AS10200，天津奧特賽恩斯儀器有限公司)。

續(xù)斷飲片(四川新荷花中藥飲片股份有限公司，產(chǎn)地四川，批號(hào)1107292)，續(xù)斷煮散顆粒(實(shí)驗(yàn)室自制)，川續(xù)斷皂苷Ⅵ對(duì)照品(批號(hào)110724-200513，中國(guó)藥品生物制品檢定所，純度為93.5%)。乙腈為色譜純;水為超純水(實(shí)驗(yàn)室自制);其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 正交設(shè)計(jì)考察樣品處理的煎煮條件

2.1.1 因素水平的確定 根據(jù)中藥傳統(tǒng)的煎煮方法和預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，確定煎煮次數(shù)為2 次。選擇加水量、浸泡時(shí)間、煎煮時(shí)間為主要的3 個(gè)考察因素，并制定每個(gè)因素下面的3 個(gè)水平。按L9(34)進(jìn)行正交試驗(yàn)，以篩選出續(xù)斷煮散顆粒的最佳煎煮工藝，因素水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 續(xù)斷煮散顆粒煎煮工藝的因素與水平

2.1.2 川續(xù)斷皂苷Ⅵ的測(cè)定

2.1.2.1 色譜條件 Hypersil BDS C18色譜柱(5 μm，4.6 mm×150 mm);流動(dòng)相為乙腈-水(30:70);體積流量1.0 mL/min;柱溫25 ℃;進(jìn)樣量20 μL;檢測(cè)波長(zhǎng)為212 nm;理論塔板數(shù)按川續(xù)斷皂苷Ⅵ峰計(jì)算應(yīng)不低于3 000。

2.1.2.2 溶液制備 對(duì)照品溶液制備:精密稱取川續(xù)斷皂苷Ⅵ對(duì)照品3.75 mg，置25 mL 量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得。供試品溶液制備:精密稱取續(xù)斷煮散顆粒5 g，按正交表方案進(jìn)行試驗(yàn)，煎煮2 次，濾過(guò)，濃縮定容至200 mL。精密吸取正交藥液2 mL，置25 mL 量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，經(jīng)微孔濾膜(0.45 μm)濾過(guò)，取續(xù)濾液作為供試溶液。陰性供試品溶液制備:吸取缺續(xù)斷藥液2 mL，同法制備陰性供試品溶液。

2.1.2.3 線性關(guān)系考察 分別取川續(xù)斷皂苷Ⅵ對(duì)照品溶液1、3、5、7、15 μL 進(jìn)樣，分別按“2.1.2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，記錄峰面積，以川續(xù)斷皂苷Ⅵ色譜峰峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣量(X)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程Y=2 156.04X -8.896 26 (r =0.999 96)。計(jì)算得出，在0.037 29 ～2.610 3 μg 范圍內(nèi)，川續(xù)斷皂苷Ⅵ的進(jìn)樣量與峰面積呈良好線性關(guān)系。

2.1.2.4 精密度試驗(yàn) 取川續(xù)斷皂苷Ⅵ對(duì)照品溶液20 μL連續(xù)進(jìn)樣6 次，結(jié)果得到川續(xù)斷皂苷Ⅵ對(duì)照品峰面積均值為606.1，RSD 為0.7%，表明儀器精密度良好。

2.1.2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取同一份供試品溶液，按照“2.1.2.1”項(xiàng)下相應(yīng)色譜條件，分別于制樣后0、2、4、6、8、10 h 進(jìn)樣20 μL，記錄峰面積，計(jì)算，結(jié)果樣品中川續(xù)斷皂苷Ⅵ峰面積均值為510.8，RSD 為0.6%，表明供試品溶液在10 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 對(duì)同一批樣品溶液，按照“2.1”項(xiàng)下相應(yīng)方法分別制備供試品溶液6 份，精密吸取各供試品溶液20 μL，按上述相應(yīng)色譜條件測(cè)定，記錄峰面積，計(jì)算得到川續(xù)斷皂苷Ⅵ均值為1.437 mg/mL，RSD 為1.6%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.1.2.7 加樣回收率試驗(yàn) 精密量取已得含有量的樣品制備溶液1 mL (川續(xù)斷皂苷Ⅵ為1.437 mg/mL)于25 mL 的棕色量瓶中，共6 份，分別精密加入川續(xù)斷皂苷Ⅵ對(duì)照品溶液(0.518 mg/mL)3 mL，按照“2.1”項(xiàng)下相應(yīng)方法制備供試品溶液，按“2.1.2.1”項(xiàng)下相應(yīng)色譜條件測(cè)定，通過(guò)計(jì)算，得出川續(xù)斷皂苷Ⅵ的加樣回收率平均值為99.3%，回收率在95% ～105%之間，RSD 為2.8%，表明該方法的準(zhǔn)確度較好。

2.1.2.8 樣品測(cè)定 分別精密吸取“2.1.2.2”項(xiàng)下制備的川續(xù)斷皂苷Ⅵ對(duì)照品溶液、續(xù)斷煮散顆粒和傳統(tǒng)飲片的供試品溶液各20 μL 進(jìn)樣，按“2.1.2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定。對(duì)照品及樣品的色譜圖如圖1 所示。

圖1 對(duì)照品及樣品溶液色譜圖

2.1.3 干膏收率的測(cè)定 精密吸取“2.1”項(xiàng)下各供試品溶液20 mL，分別置已恒定質(zhì)量的蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，于105 ℃干燥3 h，置干燥器中冷卻30 min，迅速精密稱定質(zhì)量，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

2.2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果 根據(jù)續(xù)斷煮散顆粒性質(zhì)和臨床療效，選擇川續(xù)斷皂苷Ⅵ量和干膏收率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，進(jìn)行綜合加權(quán)評(píng)分。綜合評(píng)分結(jié)果見(jiàn)表2。

從直觀分析得出，綜合得分與加水量關(guān)系密切，為最主要因素，其次是煎煮時(shí)間、浸泡時(shí)間;從方差分析結(jié)果得出(表3)，因素A (加水量)P ＜0.05，具有顯著性，B(浸泡時(shí)間)、C (煎煮時(shí)間)不顯著。為降低成本，節(jié)約能源，優(yōu)選煎煮工藝為A3B2C3，即加20 倍量水，浸泡10 min，煎煮20 min。

2.3 驗(yàn)證試驗(yàn) 為考察所選因素水平中最佳工藝的穩(wěn)定性及可行性，按照最佳工藝條件進(jìn)行3 次驗(yàn)證試驗(yàn)，取同一批號(hào)續(xù)斷煮散顆粒25 g，共3 份，加20 倍量水，浸泡10 min，煎煮2 次，每次20 min，藥液定容至1 000 mL，按上述制備方法制備供試品溶液，并同法測(cè)定川續(xù)斷皂苷Ⅵ量和干膏收率，結(jié)果見(jiàn)表4。

表2 煎煮工藝條件正交試驗(yàn)結(jié)果

表3 方差分析

表4 煎煮工藝驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

結(jié)果:川續(xù)斷皂苷Ⅵ含有量均值為58.36 mg/g，RSD=2.25%，表明該工藝穩(wěn)定可行，故確定優(yōu)選的工藝為A3B2C3。

2.4 川續(xù)斷皂苷Ⅵ溶出曲線比較 分別取8 份同一批號(hào)的續(xù)斷傳統(tǒng)飲片，每份精密稱定5 g，用10 倍量水浸泡30 min 后，隨機(jī)取4 份進(jìn)行煎煮，分別在煮沸后5、10、20、30 min 時(shí)進(jìn)行濾過(guò)，濾液定容至200 mL，作為樣品溶液。剩下的4 份樣品根據(jù)同樣的方法分別在煮沸后30 min 時(shí)進(jìn)行濾過(guò)，收集濾液備用，再向每份濾渣中加入10 倍量水，分別在煮沸后5、10、20、30 min 時(shí)進(jìn)行濾過(guò)，合并兩次濾液，再定容至200 mL，作為樣品溶液。精密吸取上述溶液各2 mL 于25 mL 棕色量瓶中，用甲醇定容，搖勻，經(jīng)0.45 μm 微孔濾膜過(guò)濾后的續(xù)濾液作為供試品溶液。用同樣方法制備續(xù)斷煮散顆粒的供試品溶液。精密吸取各樣品溶液25 mL，分別置已恒定質(zhì)量的蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，于105℃干燥3 h，置干燥器中冷卻30 min，迅速精密稱定質(zhì)量。以川續(xù)斷皂苷Ⅵ煎出量和干膏收率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用綜合加權(quán)評(píng)分法，在不同煎煮時(shí)間點(diǎn)，對(duì)續(xù)斷煮散顆粒及其傳統(tǒng)飲片的煎出效率進(jìn)行評(píng)分，繪制煎出曲線。見(jiàn)圖2。

圖2 續(xù)斷煮散顆粒與傳統(tǒng)飲片溶出曲線

將測(cè)定結(jié)果輸入軟件SPSS 13.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，經(jīng)配對(duì)t 檢驗(yàn)處理后，得到P =0.000。即不同時(shí)間點(diǎn)續(xù)斷煮散顆粒煎液中指標(biāo)成分的溶出量都要高于續(xù)斷傳統(tǒng)飲片煎液，且差異具有極顯著性(P ＜0.01)。

3 討論

在優(yōu)化續(xù)斷煮散顆粒的煎煮工藝時(shí)采用正交試驗(yàn)法，確定方法為加20 倍量水，浸泡10 min，煎煮20 min。由于川續(xù)斷皂苷Ⅵ是續(xù)斷煮散顆粒的主要有效成分，其溶出量的高低對(duì)續(xù)斷經(jīng)配伍后的臨床療效影響較大，因此，選擇川續(xù)斷皂苷Ⅵ作為評(píng)價(jià)指標(biāo)之一，權(quán)重系數(shù)相應(yīng)較高，以0.6 為宜。干膏收率作為煎煮工藝的參考指標(biāo)，能部分反映出續(xù)斷煮散顆粒的干膏收率，但干膏收率與療效不成正比例關(guān)系，故綜合評(píng)價(jià)時(shí)權(quán)重系數(shù)相應(yīng)較小，以0.4 為宜。

本研究在預(yù)試驗(yàn)時(shí)，對(duì)不同顆粒粒度(最粗粉、粗粉、中粉和細(xì)粉)制得的續(xù)斷煮散顆粒進(jìn)行煎煮考察，結(jié)果表明當(dāng)續(xù)斷粉碎成中粉和細(xì)粉時(shí)較易制粒，且顆粒飽滿、色澤均勻，且容易濾過(guò);通過(guò)對(duì)中粉和細(xì)粉制成的續(xù)斷煮散顆粒煎煮過(guò)程中川續(xù)斷皂苷Ⅵ溶出率和干膏收率的考察，續(xù)斷飲片粉碎成中粉后進(jìn)行制粒，出粉率較高，川續(xù)斷皂苷Ⅵ含有量和干膏收率較高，具有較好的重復(fù)性和可操作性。故本研究選擇續(xù)斷中粉制得的煮散顆粒作為研究對(duì)象。

藥材粒度在很大程度上會(huì)影響中藥浸提過(guò)程中的滲透和擴(kuò)散階段，飲片粉碎后粒徑大幅度減小，溶劑易于滲入顆粒內(nèi)部，成分?jǐn)U散速率增大，浸提過(guò)程加快。此為煮散顆粒能顯著性提高飲片煎出效率的科學(xué)內(nèi)涵。研究發(fā)現(xiàn)，單味飲片制備成煮散顆粒之后，其浸提效果相較于傳統(tǒng)飲片有顯著提高，故煎煮質(zhì)量更高［11-13］。

［1］ 王家葵，王一濤. 續(xù)斷功效與臨床應(yīng)用歷史沿革考［J］.中醫(yī)雜志，1992，33 (6):49-50.

［2］ 丁 莉，李 慧，武 蕓，等. 藥材川續(xù)斷的研究進(jìn)展［J］. 湖北民族學(xué)院學(xué)報(bào):自然科學(xué)版，2010，28(3):321-322.

［3］ 穆蘭澄，曹京梅，李冀湘，等. 中藥煮散的歷史沿革與現(xiàn)代研究概述［J］. 中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2008，14(7):74.

［4］ 江 泳，馮 欣，楊殿新，等. 對(duì)中藥煮散劑現(xiàn)狀的認(rèn)識(shí)與思考［J］. 四川中醫(yī)，2010，28(5):69.

［5］ 徐海波. 中藥煮散源考［J］. 河北中醫(yī)藥學(xué)報(bào)，1999，14(4):11-15.

［6］ 黃禮之，宋民義，孫華山. 淺談中藥煮散的臨床應(yīng)用［J］.陜西中醫(yī)，2002，23(8):746-747.

［7］ 譚洪根，林 生，張啟偉，等. 高效液相色譜法測(cè)定續(xù)斷藥材中川續(xù)斷皂苷Ⅵ的含量［J］. 中國(guó)中藥雜志，2006，31(9):726-727.

［8］ 劉基柱，鄧小慧，李淑賢，等. 仙靈壯骨膠囊中川續(xù)斷皂苷Ⅵ的含量測(cè)定［J］. 河南中醫(yī)，2009，29(7):707-708.

［9］ 林俊芝，傅超美，毛 茜，等. 黃柏飲片與煮散顆粒在不同煎煮時(shí)間點(diǎn)鹽酸小檗堿含量和干膏收率的比較［J］. 中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2012，18(12):41-43.

［10］ 馬雪瑋，傅超美，劉 婧，等. 干姜煮散顆粒與傳統(tǒng)飲片在不同煎煮時(shí)間點(diǎn)干膏收率與6-姜辣素含量的對(duì)比研究［J］.成都大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版，2012，31(2):120-122.

［11］ 徐曉秋，傅超美，盧君蓉，等. 葛根芩連湯煮散顆粒與傳統(tǒng)湯劑煎煮效率比較研究［J］. 成都大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版，2013，32(1):24-26.