Box-Behnken 設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)選乳痛軟堅(jiān)片揮發(fā)油包合工藝

唐 林， 夏新華 ， 周莉莉， 杜 陽

(湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙410208)

乳痛軟堅(jiān)片系由柴胡、陳皮、延胡索、蛤殼粉等組成，臨床用于治療肝郁氣滯型［1］、痰瘀互結(jié)型［2］的乳腺增生病療效顯著。處方中柴胡、陳皮、當(dāng)歸、莪術(shù)含有大量揮發(fā)油，臨床應(yīng)用和現(xiàn)代藥理研究表明揮發(fā)油具有較強(qiáng)的生理活性［3-6］，但其成分容易揮發(fā)，給生產(chǎn)和儲(chǔ)存帶來了不便。為增加揮發(fā)油在該制劑中的穩(wěn)定性，保證制劑的質(zhì)量，本實(shí)驗(yàn)采用Box-Behnken 設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法對(duì)該制劑揮發(fā)油的β-環(huán)糊精包合工藝條件進(jìn)行了優(yōu)化。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 分析天平XB 220A (Precisa Balance series XB);集熱式恒溫加熱磁力攪拌器DF-101 (鞏義市予華儀器有限責(zé)任公港東科技發(fā)展股份有限公司)，揮發(fā)油測(cè)定器、真空干燥箱。

1.2 試藥 β-環(huán)糊精(天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所)，無水乙醇(分析純)，石油醚(分析純，成都市科龍化工試劑廠)等。柴胡、當(dāng)歸、陳皮、莪術(shù)中藥飲片均購(gòu)自湖南百佳中藥飲片廠，經(jīng)檢驗(yàn)以上中藥飲片均符合《中國(guó)藥典》2010 年版規(guī)定。

2 方法與結(jié)果

2.1 揮發(fā)油的提取 按處方比例稱取柴胡、陳皮、當(dāng)歸和莪術(shù)四味中藥飲片的最粗粉，加10 倍量的水，按《中國(guó)藥典》2010 年版一部附錄ⅩD 揮發(fā)油測(cè)定法(甲法)提取5 h，收集揮發(fā)油，加入無水硫酸鈉脫水，即得混合揮發(fā)油。

2.2 揮發(fā)油包合方法的選擇

2.2.1 飽和水溶液法 取β-環(huán)糊精6 g，精密稱定，置于錐形瓶中，加水150 mL，加熱溶解，放冷并于磁力攪拌器上恒溫于40 ℃，緩緩加入1 mL 揮發(fā)油(預(yù)先配成50%的無水乙醇溶液)，恒溫?cái)嚢?h，放冷至室溫，置冰箱冷藏24 h，抽濾，包合物用少量水洗滌，再用石油醚沖洗3 次(每次10 mL)，40 ℃真空干燥5 h，稱定質(zhì)量，計(jì)算包合物收率。

2.2.2 研磨法 取β-環(huán)糊精6 g，精密稱定，置于研缽中，加3 倍量水，研磨均勻。量取揮發(fā)油1 mL 配成50%的無水乙醇溶液，緩緩加入乳缽中，連續(xù)研磨3 h 至成糊狀，抽濾，包合物用少量水洗滌，再用石油醚沖洗3 次(每次10 mL)，40 ℃真空干燥5 h，稱定質(zhì)量，計(jì)算包合物收率。

2.2.3 兩種包合方法揮發(fā)油包合率的測(cè)定 按《中國(guó)藥典》2010 年版一部附錄XD 揮發(fā)油測(cè)定法(甲法)測(cè)定，精密量取混合揮發(fā)油1.00 mL，置圓底燒瓶中，放數(shù)粒沸石，加蒸餾水300 mL，連接揮發(fā)油提取器，加熱至沸，并保持微沸2 h 以上，至油量不再增加，記錄揮發(fā)油回收量，計(jì)算空白回收率。另取上述二種包合方法制備的揮發(fā)油包合物，同法操作，按下式計(jì)算揮發(fā)油包合率。結(jié)果表明，研磨法的揮發(fā)油包合率明顯高于飽和水溶液法，故選擇研磨法用于揮發(fā)油的的包合(見表1)。

表1 兩種包合方法的比較(n=3)

2.3 研磨法包合工藝影響因素的考察

2.3.1 研磨時(shí)間的影響 取β-環(huán)糊精6 g，共6 份，精密稱定，置于研缽中，加3 倍量水，研磨均勻。量取揮發(fā)油1 mL (預(yù)先配成50%的無水乙醇溶液)，緩緩加入研缽中，分別連續(xù)研磨0.5、1、1.5、2、2.5、3 h 至成糊狀，抽濾，包合物用少量水洗滌，再用石油醚沖洗3 次 (每次10 mL)，40 ℃真空干燥5 h，稱定質(zhì)量，計(jì)算包合物收率，并按“2.2.3”項(xiàng)下方法測(cè)定揮發(fā)油包合率。結(jié)果表明，包合時(shí)間對(duì)包合物收率的影響不大，但隨著時(shí)間延長(zhǎng)，揮發(fā)油包合率逐漸增大，研磨2 h 后，揮發(fā)油包合率趨于穩(wěn)定(見圖1)。

2.3.2 β-CD 用量的影響 分別稱取β-環(huán)糊精4、6、8、10 g，精密稱定，置于研缽中，加3 倍量水，研磨均勻。精密量取揮發(fā)油1 mL (預(yù)先配成50%的無水乙醇溶液)，緩緩加入研缽中，連續(xù)研磨2 h 至成糊狀，其余操作同“2.3.1”項(xiàng)。結(jié)果表明，β-CD 用量對(duì)對(duì)包合物收率影響基本不大，但對(duì)揮發(fā)油包合率影響顯著，揮發(fā)油包合率隨著β-CD 用量加大先增加后穩(wěn)定接著又有所增加(見圖2)。

圖1 研磨時(shí)間對(duì)包合工藝的影響

圖2 β-CD 用量對(duì)包合工藝的影響

2.3.3 加水量的影響 取β-環(huán)糊精6 g，共4 份，精密稱定，置于研缽中，分別加2、3、4、5 倍量的水，研磨均勻。精密量取揮發(fā)油1 mL (預(yù)先配成50%的無水乙醇溶液)，緩緩加入研缽中，連續(xù)研磨2 h 至成糊狀，其余操作同“2.3.1”項(xiàng)。結(jié)果表明，隨著加水量增加，包合物收率先增大后減小，3 倍量時(shí)包合物收率較大，揮發(fā)油包合率則從3 倍加水量時(shí)逐漸下降，4 倍量水后又逐漸趨于穩(wěn)定(見圖3)。

圖3 加水量對(duì)包合工藝的影響

2.3.4 乙醇用量的影響 取β-環(huán)糊精6 g，共4 份，精密稱定，置于研缽中，分別加3 倍量水，研磨均勻。精密量取揮發(fā)油1 mL，共4 份，分別加入無水乙醇1、2、3、4 mL 混勻，緩緩加入研缽中，連續(xù)研磨2 h 至成糊狀，其余操作同“2.3.1”項(xiàng)。結(jié)果表明，當(dāng)無水乙醇用量與揮發(fā)油量1 ∶1時(shí)，揮發(fā)油包合率和包合物收率達(dá)到最大(見圖4)。

圖4 乙醇用量對(duì)包合工藝的影響

2.4 Box-Behnken 設(shè)計(jì)-效應(yīng)面分析法優(yōu)選包合工藝條件

2.4.1 設(shè)計(jì)方案與實(shí)驗(yàn)結(jié)果 基于上述研磨法包合工藝影響因素考察的結(jié)果，選取β-CD 用量、加水量、研磨時(shí)間為考察因素，每個(gè)因素設(shè)計(jì)3 個(gè)水平(低中高3 個(gè)水平分別以-1、0、1 進(jìn)行編碼，見表2)，以揮發(fā)油包合率為響應(yīng)值(Y)，采用Design-Expert 8.05 軟件生成Box-Behnken設(shè)計(jì)方案，參照“2.2.2”項(xiàng)和“2.2.3”項(xiàng)下的方法制備各方案的包合物并測(cè)定其揮發(fā)油包合率，結(jié)果見表3。

表2 Box-Behnken 設(shè)計(jì)因素水平

2.4.2 模型擬合與顯著性檢驗(yàn) 采用Design-Expert 8.05軟件對(duì)上述實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到揮發(fā)油包合率(Y)對(duì)β-CD 用量(A)、加水量(B)、研磨時(shí)間(C)的二次回歸模型:Y = - 231.41 + 35.84A + 34.25 B +81.77C - 1.80A2- 5.78B2- 17.71C2，決定系數(shù)R2=0.950 2。對(duì)回歸模型及其系數(shù)進(jìn)行方差分析(ANOVA)，可知該模型達(dá)到極顯著水平(P ＜0.01)，且失擬項(xiàng)(Lack of Fit)不顯著(P ＞0.05)，表明該模型實(shí)驗(yàn)誤差小，模型擬合良好。但模型中A、B 二項(xiàng)系數(shù)的P 值大于0.05，表明因素A、B 對(duì)模型的響應(yīng)值(揮發(fā)油包合率)影響較小(見表4)。

2.4.3 響應(yīng)面分析與優(yōu)化 根據(jù)上述模型方程，采用Design-Expert 8.05 軟件，作三維圖，如圖5 ～7 所示。由三維圖中的曲面和等高線可以直觀地看出，研磨時(shí)間對(duì)揮發(fā)油包合率的影響顯著，而β-CD 用量與加水量的影響則不大，但隨著加水量和投料比例的增加，包合率都是先增大后減小;當(dāng)加水量約為3 倍量、β-CD 用量約為揮發(fā)油投料量的10 倍、研磨時(shí)間約為2.5 h 時(shí)，包合率接近最大值。另外，根據(jù)包合物制備中要求包合率越大越好，通過Design Expert 8.05 軟件可找出最優(yōu)的包合工藝方案，即β-CD 用量為揮發(fā)油投料量的10.06 倍，加2.90 倍量的水，研磨2.31 h。

表3 Box-Behnken 設(shè)計(jì)方案與試驗(yàn)結(jié)果

表4 二次回歸模型方差分析

2.4.4 模型預(yù)測(cè)與驗(yàn)證 考慮到實(shí)際操作方便，將上述最優(yōu)包合工藝方案修正為:β-CD 用量為揮發(fā)油投料量的10倍，加3 倍量的水，研磨2.5 h。在此條件下，揮發(fā)油包合率的理論值為91.57%。按修正后的最優(yōu)包合工藝條件進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，實(shí)際測(cè)得揮發(fā)油包合率為90.15% ±1.07%，與理論預(yù)測(cè)值較接近，說明該模型擬合度高。

3 討論

3.1 目前環(huán)糊精包合工藝的優(yōu)選應(yīng)用最多的是正交設(shè)計(jì)，幾乎達(dá)到了普及的程度，該設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)次數(shù)少，數(shù)據(jù)處理簡(jiǎn)單。但當(dāng)需要控制影響因素微小變化而響應(yīng)值變化較大時(shí)，采用正交設(shè)計(jì)產(chǎn)生的偏差較大［7］。Box-Behnken 設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法是統(tǒng)計(jì)與設(shè)計(jì)試驗(yàn)技術(shù)的合成，該法的在各個(gè)方面的應(yīng)用已日趨成熟［8-9］，在進(jìn)行非線性模式設(shè)計(jì)和研究中具有優(yōu)勢(shì);對(duì)中心點(diǎn)進(jìn)行重復(fù)實(shí)驗(yàn)可提高實(shí)驗(yàn)的精密度;采用多元二次方程擬合因素和效應(yīng)值之間的函數(shù)關(guān)系，再通過對(duì)回歸方程的分析可尋求最佳工藝參數(shù)［10］。本研究表明Box-Behnken 設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法用于優(yōu)選揮發(fā)油β-CD 包合工藝可行，預(yù)測(cè)值與真實(shí)值非常接近，同時(shí)所得結(jié)果直觀、精確，便于分析。

圖5 加水量和β-CD 用量對(duì)揮發(fā)油包合率影響的三維圖

圖6 環(huán)糊精用量和研磨時(shí)間對(duì)揮發(fā)油包合率影響的三維圖

3.2 在Box-Behnken 設(shè)計(jì)中，要注意各考察因素中心點(diǎn)水平的選擇，它對(duì)于順利獲得最優(yōu)試驗(yàn)方案(或工藝條件)具有重要意義。一般可先通過單因素試驗(yàn)了解各考察因素的不同試驗(yàn)條件(水平)對(duì)效應(yīng)值(評(píng)價(jià)指標(biāo))的影響情況，再結(jié)合專業(yè)知識(shí)選取各因素具有最大(或接近最大)效應(yīng)值的試驗(yàn)條件作為中心點(diǎn)水平。

圖7 研磨時(shí)間和加水量對(duì)揮發(fā)油包合率影響的三維圖

3.3 揮發(fā)油包合物的評(píng)價(jià)指標(biāo)通常有揮發(fā)油包合率、包合物收率、含油率等，不同的制備方法及不同成分的揮發(fā)油的包合，評(píng)價(jià)指標(biāo)也各不一樣［11］。揮發(fā)油包合率是揮發(fā)油包合物評(píng)價(jià)指標(biāo)當(dāng)中最直接也是最準(zhǔn)確的評(píng)價(jià)方法，應(yīng)用也最為廣泛，揮發(fā)油包合率越高，包合效果越好，而包合物收得率和含油率在大批量實(shí)際生產(chǎn)中也有重要的意義［12-13］，在本實(shí)驗(yàn)中由于在單因素考察中已經(jīng)表明包合物收率隨著各因素及水平的變化影響較小，故在優(yōu)選工藝中沒有將其作為評(píng)價(jià)指標(biāo)。

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