白藜蘆醇固體脂質(zhì)納米粒的處方和制備工藝優(yōu)化

朱可馨， 王志成， 王 冰* ， 張 彤*

(1. 上海中醫(yī)藥大學(xué)，上海201203;2. 上海市中醫(yī)醫(yī)院，上海200071)

白藜蘆醇(resveratrol，Res)是一種多酚類化合物，具有降低血脂、保護(hù)心血管、抗腫瘤、抗氧化等藥理作用［1］，研究發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇還具有抑制鈣庫釋放鈣離子從而抑制血小板活性，起到抑制血小板聚集的作用［2］。因白藜蘆醇為多酚類化合物，極性較強(qiáng)、難溶于水，易溶于三氯甲烷、甲醇、乙醇、丙酮等強(qiáng)極性溶劑中［3］，從而口服生物利用度較低，研究結(jié)果顯示其對(duì)光不穩(wěn)定，因此給臨床使用帶來不便。固體脂質(zhì)納米粒(solid lipid nanopartieles，SLN)是采用生理相容的高熔點(diǎn)脂質(zhì)材料作為載體，將藥物包裹在類脂核中或吸附于納米粒表面制成固體膠粒給藥系統(tǒng)［4］。能改善藥物溶解性，提高穩(wěn)定性，具有靶向性的特點(diǎn)，進(jìn)而達(dá)到提高藥效的作用［5］。將白藜蘆醇制成固體脂質(zhì)納米粒能夠改善藥物的溶解性［6］，提高生物利用度?，F(xiàn)有的白藜蘆醇劑型有酒劑及脂質(zhì)體等。其中酒劑藥物適用人群范圍較小、脂質(zhì)體穩(wěn)定性較差且使用三氯甲烷、甲醇等溶劑，因此不適宜臨床使用?；诎邹继J醇的物理化學(xué)性質(zhì)及固體脂質(zhì)納米粒的制劑優(yōu)勢(shì)，本實(shí)驗(yàn)在單因素考察基礎(chǔ)上，結(jié)合星點(diǎn)設(shè)計(jì)效應(yīng)面法優(yōu)化制劑工藝，為制備穩(wěn)定性好、載藥量高的白藜蘆醇固體納米脂質(zhì)粒(Res-SLN)提供初步研究數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器 Agilent 1200 高效液相色譜儀(美國Agilent 公司);RE-52AA 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 (上海亞榮生化儀器廠);SB3200 超聲波清洗器(上海千載科技有限公司);激光粒徑測(cè)定儀Nano ZS 90 (英國馬爾文公司);XS105DU 型電子天平(瑞士梅特勒-托利多公司);SB5200D 超聲波清洗機(jī)(寧波新芝生物科技股份有限公司)。

1.2 藥品與試劑 白藜蘆醇對(duì)照品 (批號(hào)111535-200502，購自中國食品藥品檢定研究院，供含量測(cè)定);白藜蘆醇原料 (上海施丹德生物制品有限公司，純度≥98.0%);單硬脂酸甘油酯(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，化學(xué)純);三硬脂酸甘油酯(上海阿拉丁試劑公司);泊洛沙姆188 (BASF 公司，注射級(jí));蛋黃卵磷脂(上海艾韋特醫(yī)藥科技有限公司，注射級(jí));膽酸鈉(上海源聚生物科技有限公司);其他試劑購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，均為分析純。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 Res-SLN 的包封率與載藥量測(cè)定方法

2.1.1 色譜條件［7］Topsil C18色譜柱(4.6 mm×150 mm，5 μm);流動(dòng)相為乙腈-水(25 ∶75);檢測(cè)波長306 nm;體積流量1 mL/min;柱溫25 ℃;進(jìn)樣量為20 μL。

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線和方法學(xué)驗(yàn)證 稱取白藜蘆醇對(duì)照品5 mg，精密稱定，用甲醇溶解定容至5 mL，制得對(duì)照品貯備液。吸取白藜蘆醇對(duì)照品貯備液加甲醇制成1.01、2.02、4.04、8.08、16.16 和32.32 μg/mL 的對(duì)照品溶液，注入液相色譜儀，以峰面積為縱坐標(biāo)，白藜蘆醇質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.1.3 Res-SLN 的包封率及載藥量測(cè)定 將白藜蘆醇固體脂質(zhì)納米粒的混懸液置于超濾離心管(截留量為10 kDa)中，高速離心(10 ℃，轉(zhuǎn)速為15 000 r/min，離心時(shí)間為50 min)，取下清液，稀釋適當(dāng)倍數(shù)，按前述色譜條件測(cè)得游離藥物濃度，以下述公式計(jì)算包封率及載藥量:

2.1.4 超濾法回收率試驗(yàn) 稱取卵磷脂0.12 g，加入30 mL 丙酮-無水乙醇(1 ∶1)，完全溶解。稱取單硬脂酸甘油酯0.12 g，加熱熔融后與上述溶液混合均勻得到油相。取240 mL 質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL 的F68 ∶膽酸鈉(1 ∶1)溶液為水相。將油相50 ℃減壓濃縮得到油膜，加入水相后置于50 kHz 超聲波清洗器中超聲40 min，制備得到空白固體脂質(zhì)納米?；鞈乙?。取500 μL 空白固體脂質(zhì)納米?；鞈乙? 份于超濾離心管中，分別加入40、50、60 μg 白藜蘆醇對(duì)照品后，離心(10 ℃，15 000 r/min，50 min)，取下層，按上述色譜條件測(cè)定，計(jì)算加樣回收率。

2.2 不同制備方法篩選 采用溶劑乳化揮發(fā)法、薄膜超聲分散法、微乳分散法和水性溶劑擴(kuò)散法進(jìn)行白藜蘆醇固體脂質(zhì)納米粒制備方法篩選。油相的制備:稱取白藜蘆醇24 mg，蛋黃卵磷脂40 mg，單硬脂酸甘油酯0.12 g，將蛋黃卵磷脂與Res 置于燒杯中，加入30 mL 無水乙醇溶解，再將單硬脂酸甘油酯(60 ℃加熱熔融)與上述溶液混合，即得。水相的制備:配制質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL 的泊洛沙姆188 水溶液，量取160 mL 泊洛沙姆188 水溶液于250 mL 錐形瓶中，即得。

2.2.1 溶劑乳化揮發(fā)法 根據(jù)參考文獻(xiàn)［8］，將水相于50℃水浴保溫，以500 r/min 速度均勻攪拌，將油相注入水相液面下，待注入完成后取出，于室溫條件下繼續(xù)攪拌30 min，再用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀真空濃縮(50 ℃)至4 mL 得初乳。另取20 mL 水相于50 mL 錐形瓶中，置于冰浴中保溫，同時(shí)以500 r/min 速度均勻攪拌，再將初乳注入水相液面下，注入完成后于冰浴中繼續(xù)攪拌2.5 h，即得白藜蘆醇固體脂質(zhì)納米?；鞈乙?。

2.2.2 薄膜超聲分散法

2.2.2.1 方法1 將油相置于250 mL 茄形瓶中，以旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀真空濃縮(50 ℃)，蒸干后得到油膜，將茄形瓶置于超聲波清洗器中，用蠕動(dòng)泵將160 mL 水相以3 mL/min 的速度注入油膜，再將混懸液轉(zhuǎn)移至超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)繼續(xù)超聲處理，設(shè)置條件為超聲時(shí)間為3 s，間歇為5 s，全程時(shí)間為12 min，即得白藜蘆醇固體脂質(zhì)納米?；鞈乙?。

2.2.2.2 方法2 將油相置于250 mL 茄形瓶中，以旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀真空濃縮(50 ℃)，蒸干后得到油膜，將160 mL 水相加入茄形瓶中，以超聲波清洗器繼續(xù)超聲處理40 min，即得Res-SLN 混懸液。

2.3 微乳分散法 水相以500 r/min 轉(zhuǎn)速攪拌，50 ℃水浴保溫，將油相注入160 mL 水相液面下，待注入完成，取出，得到微乳。另取20 mL 水相于50 mL 錐形瓶中，置于冰浴中保溫，同時(shí)以500 r/min 速度均勻攪拌，將微乳距離水相液面6 cm 處注入，待注入完成后冰浴保溫，繼續(xù)攪拌15 min，即得Res-SLN 混懸液。

2.4 水性溶劑擴(kuò)散法 水相以500 r/min 轉(zhuǎn)速攪拌，50 ℃水浴保溫，將油相注入160 mL 水相液面下，待注入完成，取出，在室溫下繼續(xù)攪拌30 min，即得白藜蘆醇固體脂質(zhì)納米?；鞈乙骸?/p>

2.5 單因素考察 考察脂質(zhì)材料、油相卵磷脂與脂質(zhì)材料比、水相表面活性劑種類、有機(jī)溶劑種類、水相溫度、超聲功率、超聲時(shí)間、藥脂比、水相體積、水相質(zhì)量濃度對(duì)粒徑大小以及穩(wěn)定性的影響。

2.6 星點(diǎn)設(shè)計(jì)優(yōu)化 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇對(duì)結(jié)果影響較顯著的3 個(gè)因素作為考察對(duì)象，即藥脂比(X1)、水相油相體積比(X2)、水相表面活性劑質(zhì)量濃度(X3)，因素取值范圍分別為X1為3 ～5;X2為5 ～8;X3為0.1 ～0.5 mg/mL，以粒徑大小(Y1)、粒徑分布指數(shù)PDI (Y2)、載藥量(Y3)作為因變量(效應(yīng)值)，采用星點(diǎn)效應(yīng)面法優(yōu)化處方。采用三因素五水平星點(diǎn)設(shè)計(jì)，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)見表1。

表1 星點(diǎn)設(shè)計(jì)因素水平

3 結(jié)果

3.1 載藥量與包封率的確定 所得標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算線性回歸方程為:Y=116.43X+23.46 (r2=0.999 5)。結(jié)果表明白藜蘆醇在1.01 ～32.32 μg/mL 質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。低、中、高質(zhì)量濃度日內(nèi)精密度RSD 依次為2.7%，2.9%和0.4%，日內(nèi)精密度良好。超濾法回收率實(shí)驗(yàn)得到低、中、高質(zhì)量濃度(1.01、8.08、32.32 μg/mL)加樣回收率為96.1%、94.8%、97.1%，RSD 均小于3.0%。該方法精密度、準(zhǔn)確性良好，且超濾法回收率實(shí)驗(yàn)表明離心管對(duì)于藥物無吸附，可用于載藥量及包封率的測(cè)定。

3.2 制備方法篩選 取4 種方法制得的Res-SLN 樣品，按照前述方法測(cè)定包封率、載藥量及粒徑，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。結(jié)果表明，采用溶劑乳化揮發(fā)法、薄膜超聲分散法制備的白藜蘆醇固體脂質(zhì)納米粒的包封率均在90%以上，載藥量在15%以上，而微乳分散法和水性溶劑擴(kuò)散法制得樣品的包封率僅為37.76%和54.57%，載藥量均為10%左右;從粒徑結(jié)果看，兩種薄膜超聲分散法所得樣品的粒徑分別為285.50 nm 和196.80 nm，溶劑乳化揮發(fā)法所制樣品粒徑最大，微乳分散法和水性溶劑擴(kuò)散法所制樣品粒徑最小。結(jié)合載藥量、包封率及粒徑三個(gè)因素綜合考慮，選擇薄膜超聲分散法的方法2 為Res-SLN 的制備方法。

表2 不同制法的Res-SLN 樣品測(cè)定結(jié)果(n=3)

3.3 處方及工藝優(yōu)化

3.3.1 處方單因素考察 考察脂質(zhì)材料、油相卵磷脂與脂質(zhì)材料比、水相表面活性劑種類與有機(jī)溶劑種類對(duì)粒徑大小的影響，并且觀察樣品在室溫下靜置3 h 后的樣品的顏色外觀、均勻度，以及底部是否有沉淀等現(xiàn)象，以綜合考慮樣品穩(wěn)定性，結(jié)果見表3。

表3 薄膜超聲分散法脂質(zhì)材料單因素考察結(jié)果

綜上，由脂質(zhì)材料單因素考察結(jié)果可以看出，脂質(zhì)材料選擇為單硬脂酸甘油酯、油相卵磷脂與脂質(zhì)材料比例為1 ∶1，且水相表面活性劑選擇為膽酸鈉-F68 (1 ∶1)、有機(jī)溶劑選擇為無水乙醇-丙酮(1 ∶1)時(shí)制備的白藜蘆醇固體脂質(zhì)納米粒樣品粒徑較小且較為穩(wěn)定。

3.3.2 制備工藝單因素考察 考察水相溫度、超聲功率、超聲時(shí)間、藥脂比、水相體積、水相質(zhì)量濃度對(duì)粒徑大小的影響并綜合考慮穩(wěn)定性的影響。結(jié)果見表4。

表4 薄膜超聲分散法單因素考察結(jié)果

綜上，由制備工藝單因素考察結(jié)果可以看出，當(dāng)超聲水相溫度選擇為室溫，超聲功率選擇為50 kHz，超聲時(shí)間為40 min，并且選用藥脂比為1 ∶3、且水相體積選擇為300 mL，水相質(zhì)量濃度選擇為0.1 mg/mL，所制備的Res-SLN 樣品粒徑較小、較為穩(wěn)定。

3.4 星點(diǎn)設(shè)計(jì)優(yōu)化試驗(yàn)

3.4.1 結(jié)果 根據(jù)三因素五水平星點(diǎn)設(shè)計(jì)(表1)制備不同處方的白藜蘆醇固體脂質(zhì)納米粒，測(cè)定粒徑及載藥量，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表5。

表5 星點(diǎn)設(shè)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果

3.4.2 模型擬合 運(yùn)用Design expert 統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)各水平進(jìn)行多元非線性回歸，得到二項(xiàng)式擬合的方程為:

結(jié)果表明各效應(yīng)與兩因素各水平的非線性擬合效果較好，其中Y1、Y3復(fù)相關(guān)系數(shù)較大。

3.4.3 效應(yīng)面優(yōu)化與預(yù)測(cè) 根據(jù)二項(xiàng)式方程，繪制對(duì)處方影響顯著的影響因素的三維效應(yīng)面圖，各因素對(duì)載藥量的影響效應(yīng)面見圖1 ～3。重疊各個(gè)效應(yīng)面的最優(yōu)區(qū)域，得到制備Res-SLN 的較優(yōu)工藝參數(shù)是藥脂比為3;水相油相體積比為8;水相表面活性劑質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL。

圖1 藥脂比及水相油相體積比對(duì)載藥量的影響效應(yīng)面

圖2 藥脂比及水相表面活性劑質(zhì)量濃度對(duì)載藥量的影響效應(yīng)面

3.4.4 工藝參數(shù)優(yōu)化驗(yàn)證結(jié)果 按優(yōu)化處方制備3 批Res-SLN 混懸液，測(cè)得其粒徑大小、粒徑PDI 和載藥量分別為142.7 nm、0.307 和21.35%;3 次預(yù)測(cè)的結(jié)果分別為158.06 nm、0.34 和24.0%，偏差值分別為- 9.7%、-9.7%和-10.8%，預(yù)測(cè)值與實(shí)測(cè)值接近，說明模型擬合效果較好。

4 討論

本實(shí)驗(yàn)對(duì)4 種RES-SLN 制備方法進(jìn)行篩選，其中，微乳分散法與水性溶劑擴(kuò)散法的包封率遠(yuǎn)低于溶劑乳化揮發(fā)法以及薄膜超聲分散法，根據(jù)參考文獻(xiàn)［9］，當(dāng)處方組成相同時(shí)，使用不同的制備方法對(duì)于包封率的影響較大。溶劑乳化揮發(fā)法中第一步得到初乳的方法與微乳分散法及水性溶劑擴(kuò)散法相似，但溶劑乳化揮發(fā)法中得到初乳后蒸發(fā)濃縮，進(jìn)一步復(fù)乳化，得到固體脂質(zhì)納米?；鞈乙喊饴瘦^高。

圖3 水相油相體積比及水相表面活性劑質(zhì)量濃度對(duì)載藥量的影響效應(yīng)面

RES-SLN 制備方法的篩選中，微乳分散法與水性溶劑擴(kuò)散法制得的樣本沒有經(jīng)過超聲過程，粒徑均小于制備中有超聲過程的溶劑乳化揮發(fā)法以及薄膜超聲分散法，根據(jù)參考文獻(xiàn)［10］，超聲波對(duì)于大顆粒的粒子具有均勻細(xì)化的作用，但是對(duì)于粒徑小的粒子作用并不明顯。超聲過程中均伴隨熱量的釋放，產(chǎn)生的熱量越大，粒子可能產(chǎn)生重新聚集現(xiàn)象從而粒徑增大。

另外，對(duì)于4 種RES-SLN 制備方法的篩選中，最終制得的樣品由于制備方式不同而造成最終體積有所差異。樣品體積是否對(duì)于載藥量、包封率及粒徑造成影響尚需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)進(jìn)行討論。

采用薄膜超聲分散法所制備Res-SLN 載藥量為24%，比現(xiàn)有文獻(xiàn)中使用熱高壓均質(zhì)法以及水性溶劑擴(kuò)散法制得的同類制劑的載藥量均有顯著提高［6，11］。且處方中使用易揮發(fā)、毒性較小的無水乙醇:丙酮混合溶劑作為有機(jī)溶劑，與現(xiàn)有文獻(xiàn)中多使用的乙酸乙酯或三氯甲烷比較［12］，本法使用的有機(jī)溶劑毒性更低、殘留更少。

與現(xiàn)有文獻(xiàn)已有處方和制法比較，本實(shí)驗(yàn)在SLN 制備中選擇以泊洛沙姆188 ∶膽酸鈉混合溶液作為水相表面活性劑，且加入卵磷脂作為油相的輔料，使得所制納米粒的粒徑減小、載藥量提高。

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