HPLC 同時(shí)測(cè)定不同產(chǎn)地遠(yuǎn)志飲片中6 種寡糖酯類成分

姜 秋， 李慧芬， 梁 曉， 張學(xué)蘭

(山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東 濟(jì)南250355)

遠(yuǎn)志為臨床常用的安神益智中藥，具有安神益智、交通心腎、祛痰、消腫的功效［1］。研究表明，寡糖酯類成分為遠(yuǎn)志安神益智的主要活性成分，具有抗抑郁、抗老年癡呆、神經(jīng)保護(hù)及抗氧化活性［2-7］?！吨袊?guó)藥典》2010 年版規(guī)定，遠(yuǎn)志藥材及其飲片中3，6＇-二芥子?；崽蔷坏蒙儆?.50%［1］。但遠(yuǎn)志中含有多種寡糖酯類成分，迄今為止，已從遠(yuǎn)志中分離出的寡糖酯類化合物有近30 種［8-9］。孫長(zhǎng)清等用HPLC 法測(cè)定了不同產(chǎn)地遠(yuǎn)志藥材中抗老年癡呆活性成分西伯利亞遠(yuǎn)志糖A5和西伯利亞遠(yuǎn)志糖A6［10］，但HPLC 同時(shí)測(cè)定遠(yuǎn)志飲片中3，6＇-二芥子酰基蔗糖、西伯利亞遠(yuǎn)志糖A5、球 腺 糖 A、 tenuifolisideA、 tenuifolisideB、tenuifoliside C 尚未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)建立了HPLC 同時(shí)測(cè)定遠(yuǎn)志飲片中上述6 種寡糖酯類成分的方法，并測(cè)定了6 個(gè)不同產(chǎn)地遠(yuǎn)志飲片中6 種寡糖酯類成分的含有量，為科學(xué)控制和評(píng)價(jià)遠(yuǎn)志飲片的質(zhì)量提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 儀器與試藥

L-2000 型高效液相色譜儀(日本日立公司);FA1604N 型電子天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司，1/10 萬(wàn));KQ-250E 型醫(yī)用超聲波清洗器(江蘇昆山市超聲儀器有限公司)。遠(yuǎn)志飲片購(gòu)自山東百味堂中藥飲片有限公司、濟(jì)南宏濟(jì)堂中藥飲片公司及濟(jì)南建聯(lián)中藥店，產(chǎn)地分別為陜西、河南、山西(太原和沂州地區(qū))、山東、河北。經(jīng)山東中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室周鳳琴教授鑒定為遠(yuǎn)志科植物遠(yuǎn)志Polygala tenuifolia Willd干燥根的段狀飲片。3，6＇-二芥子?；崽恰⑽鞑麃嗊h(yuǎn)志糖 A5、球腺糖 A、tenuifoliside A、tenuifoliside B、tenuifoliside C 對(duì)照品(本課題組自制，純度均大于98%);高效液相用乙腈(色譜純)，娃哈哈純凈水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件［11］Kromasil C18色譜柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm);流動(dòng)相為乙腈(A)-0.1%甲酸(B)溶液，梯度洗脫(0 ～10 min，8%A →12%A;10 ～25 min，12% A →25% A;25 ～40 min，25% A→75% A);柱溫30 ℃;檢測(cè)波長(zhǎng)330 nm，體積流量1.0 mL/min。在上述色譜條件下，6 種寡糖酯類成分與其他組分分離度良好，色譜圖見(jiàn)圖1。

2.2 供試品溶液的制備［10］取6 個(gè)不同產(chǎn)地遠(yuǎn)志飲片粉末(過(guò)60 目篩)各約0.2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇20 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲提取40 min，取出，放冷，再稱定質(zhì)量，用50% 甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，以0.45 μm 微孔濾膜濾過(guò)，即得。

圖1 混合對(duì)照品(A)與遠(yuǎn)志飲片(B)HPLC 圖Fig.1 Chromatograms of six kinds of oligosaccharide esters mixed reference substances (A)，raw herbal pieces (B)

2.3 混合對(duì)照品溶液的制備 精密稱取3，6＇-二芥子?；崽?.73 mg、西伯利亞遠(yuǎn)志糖A5 2.22 mg、球腺糖A 3.05 mg、tenuifoliside A 2.75 mg、tenuifoliside B 3.08 mg、tenuifoliside C 3.55 mg，分別置于5、5、25、5、10、25 mL 量瓶中，分別加50%甲醇制成每1 mL 含3，6＇-二芥子酰基蔗糖0.546 mg、西伯利亞遠(yuǎn)志糖A 0.444 mg、球腺糖A 0.122 mg、tenuifoliside A 0.550 mg、tenuifoliside B 0.308 mg、tenuifoliside C 0.142 mg 的對(duì)照品貯備液。分別精密量取3，6＇-二芥子?；崽菍?duì)照品貯備液2 mL 及其余5 種對(duì)照品貯備液各1 mL，置同一10 mL 量瓶中，加50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得混合對(duì)照品溶液。

2.4 線性關(guān)系考察 精取“2.3”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液1、2、5、10、40 μL，注入液相色譜儀，按“2.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜峰峰面積，以色譜峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，以進(jìn)樣量X(μg)為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，結(jié)果各成分線性關(guān)系良好，見(jiàn)表1。

表1 6 種寡糖酯類成分的線性關(guān)系考察結(jié)果Tab.1 Linear relationship of the six kinds of oligosaccharide esters

2.5 精密度試驗(yàn) 精取供試品溶液10 μL，重復(fù)進(jìn)樣6 次，測(cè)定3，6＇-二芥子?；崽?、西伯利亞遠(yuǎn)志糖A5、球腺糖A、tenuifoliside A、tenuifoliside B、tenuifoliside C 的峰面積。結(jié)果RSD 分別為1.0%、1.3%、1.4%、1.1%、1.4%、1.4%，表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精取同一供試品溶液10 μL，分別在0、2、4、8、12、24 h 進(jìn)樣，測(cè)定3，6＇-二芥子?；崽恰⑽鞑麃嗊h(yuǎn)志糖A5、球腺糖A、tenuifoliside A、tenuifoliside B、tenuifoliside C 峰面積，結(jié)果 RSD 分別為 1.1%、1.2%、1.4%、1.2%、1.5%、1.4%，表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一產(chǎn)地遠(yuǎn)志飲片粉末(過(guò)60 目篩)6 份，各約0.2 g，精密稱定，按“2.2”項(xiàng)下方法制備成供試品溶液，按上述色譜條件測(cè)定，計(jì)算3，6＇-二芥子酰基蔗糖、西伯利亞遠(yuǎn)志糖A5、球 腺 糖 A、tenuifoliside A、tenuifoliside B、tenuifoliside C 的含有量，結(jié)果6 次測(cè)定的RSD 分別為1.3%、1.3%、1.7%、1.4%、1.9%、1.7%，表明該方法重復(fù)性較好。

2.8 加樣回收率試驗(yàn) 取已測(cè)知含有量的遠(yuǎn)志飲片(陜西)粉末(過(guò)60 目篩)6 份，各約0.1 g，精密稱定，分別精密加入3，6＇-二芥子?；崽?0.824 mg/mL)、西伯利亞遠(yuǎn)志糖A5 (0.227 mg/mL)、球腺糖A (0.062 mg/mL)、tenuifoliside A (0.261 mg/mL)、tenuifoliside B (0.125 mg/mL)、tenuifoliside C (0.082 mg/mL)對(duì)照品溶液各1 mL，再以50%甲醇補(bǔ)足至20 mL，按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣分析，結(jié)果見(jiàn)表2。

2.9 樣品測(cè)定 精取混合對(duì)照品溶液和供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀分析測(cè)定，按干燥品計(jì)算樣品中各指標(biāo)成分含有量，結(jié)果見(jiàn)表3。

表2 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=6)Tab.2 Results of recovery tests (n=6)

表3 6 種成分測(cè)定結(jié)果(%，n=2)Tab.3 Determination results of the six kinds of oligosaccharide esters (%，n=2)

3 小結(jié)與討論

3.1 本研究對(duì)不同產(chǎn)地遠(yuǎn)志飲片中球腺糖A、tenuifoliside A、tenuifoliside B、tenuifoliside C 進(jìn)行了測(cè)定，并建立了HPLC 梯度洗脫同時(shí)測(cè)定不同產(chǎn)地遠(yuǎn)志飲片中3，6＇-二芥子?；崽恰⑽鞑麃嗊h(yuǎn)志糖A5、球腺糖A、tenuifoliside A、tenuifoliside B、tenuifoliside C 的定量分析方法。結(jié)果表明，該方法操作簡(jiǎn)便、靈敏可靠、重復(fù)性好，為遠(yuǎn)志的進(jìn)一步開發(fā)以及飲片的質(zhì)量控制和評(píng)價(jià)提供了新的測(cè)定方法。

3.2 研究表明，不同產(chǎn)地遠(yuǎn)志飲片中6 種寡糖酯類成分含有量相差較大，其中河南產(chǎn)地遠(yuǎn)志飲片中3，6＇-二芥子酰基蔗糖含有量最低為0.44%，低于《中國(guó)藥典》規(guī)定的不得少于0.5%的限量要求，其余產(chǎn)地3，6＇-二芥子酰基蔗糖含有量均符合藥典規(guī)定。遠(yuǎn)志飲片中除3，6＇-二芥子?；崽呛辛枯^高外，西伯利亞遠(yuǎn)志糖A5、tenuifoliside A、tenuifoliside B 在各產(chǎn)地遠(yuǎn)志飲片中含有量也較高。鑒于寡糖酯類成分為遠(yuǎn)志抗老年癡呆和抗抑郁的活性成分，能夠反映遠(yuǎn)志安神益智的藥效，建議以多種寡糖酯類成分共同控制和評(píng)價(jià)遠(yuǎn)志藥材及其飲片的質(zhì)量。

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