基于1 H-NMR 譜的獨(dú)一味代謝產(chǎn)物基礎(chǔ)研究

潘 正， 毛 慶， 江 生， 范 剛， 張 藝

(1. 成都中醫(yī)藥大學(xué)民族藥學(xué)院，四川成都611130;2. 重慶市食品藥品檢驗(yàn)所，重慶401121)

達(dá)布巴系藏醫(yī)藥學(xué)臨床常用藥材，別名達(dá)巴巴、吉布孜、達(dá)干木等，唇形科獨(dú)一味屬植物獨(dú)一味Lamiophlomis rotata (Benth.)Kudo 是其來(lái)源之一;獨(dú)一味分布于不丹、印度、尼泊爾和中國(guó)的西藏、青海、甘肅、云南等地，生長(zhǎng)于海拔3 000 m以上的石質(zhì)高山草甸、河灘地，是藏、蒙古、納西等少數(shù)民族常用草藥［1-2］。獨(dú)一味膠囊主要用于病人的切口疼痛、出血及手術(shù)后，但由于采挖地下部分破壞草地，近年來(lái)禁止采挖全草，獨(dú)一味為植株的干燥地上部分，以保護(hù)高寒草地的生態(tài)環(huán)境［3］。獨(dú)一味止血潛在市場(chǎng)需求還在急劇擴(kuò)大，野生資源品質(zhì)面臨更大的壓力。

獨(dú)一味主要含有黃酮、環(huán)烯醚萜、苯乙醇苷、揮發(fā)油及其他類成分［4-6］，上述成分中，環(huán)烯醚萜類、黃酮類和苯乙醇苷是獨(dú)一味的主要活性成分［7-9］。近年來(lái)，針對(duì)上述三類成分，國(guó)內(nèi)學(xué)者進(jìn)行了多種該分析方法的研究，分析方法集中于HPLC、HPLC-PAD、HPLC-PAD-MS 等［10-14］，但上述方法有一定局限性，樣品測(cè)試時(shí)間長(zhǎng)，不能全面反映藥材或制劑的品質(zhì)。

1H-NMR 技術(shù)的代謝物組學(xué)研究天然藥物的品種鑒定、質(zhì)量評(píng)價(jià)、化學(xué)分類學(xué)及產(chǎn)地溯源等研究領(lǐng)域具有多方面的優(yōu)勢(shì)。該方法單次測(cè)量就能同時(shí)檢測(cè)分析藥用植物中的多個(gè)主要組成成分;樣品預(yù)處理步驟簡(jiǎn)單;測(cè)定快速準(zhǔn)確;專屬性強(qiáng)。本實(shí)驗(yàn)采用基于氫核磁共振的代謝物組學(xué)技術(shù)，建立了獨(dú)一味的整體代謝指紋圖譜，該研究對(duì)于獨(dú)一味的鑒定、產(chǎn)地判別、質(zhì)量控制與評(píng)價(jià)、品種鑒別及其臨床合理利用等都將有重要的指導(dǎo)作用。

1 儀器與試藥

Varian Mercury Plus 400 MHz 核磁共振波譜儀(美國(guó)Varian 公司，第三軍醫(yī)大學(xué)-重慶化醫(yī)集團(tuán)控股公司聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室);Sartorius BP221S 電子天平(賽多利斯科學(xué)儀器有限公司);KQ-300B 型超聲波清洗器(鄭州鞏義市英峪儀器廠);氘代甲 醇 (CD3OD，99.8%)、氘 代 三 氯 甲 烷(CDCl3，99.8%)、重水 (D2O，99.9%)和氘代丙酮(acetone-d6，99.9%)均購(gòu)自北京京云重輕科技有限公司;8-O-乙酰山梔苷甲酯 (純度98.63%)、毛蕊花糖苷(純度為98.12%)均為本實(shí)驗(yàn)室自制，經(jīng)HPLC 測(cè)試，面積歸一化法計(jì)算純度，UV、NMR 光譜測(cè)試確認(rèn)其結(jié)構(gòu)。

獨(dú)一味藥材均采于2012 年7 月—8 月，樣品由甘南百草生物科技開(kāi)發(fā)有限公司采集，由張藝研究員鑒定為唇形科獨(dú)一味屬植物獨(dú)一味Lamiophlomis rotata (Benth.)Kudo 的干燥地上部分。

2 方法與結(jié)果

2.1 儀器條件 供試液在25 ℃，35%濕度環(huán)境下Varian 400 兆NMR 儀上測(cè)定。質(zhì)子觀察頻率400.64 MHz，采用弛豫時(shí)間編輯 (Carr. Purcell-Meiboom. Gill)脈沖序列，脈沖延遲時(shí)間 (d1)為1 s，譜線寬度(lb) =0.3;譜寬6 kHz，為了增大信噪比，取128 次的掃描次數(shù)，F(xiàn)ID 信號(hào)采集時(shí)間(at) =2.78;FID 轉(zhuǎn)換所需點(diǎn)數(shù)為65536;調(diào)用水峰壓制序列(Presat)壓制殘余水峰，總測(cè)定時(shí)間為11 min 22 s。在25 ℃時(shí)取一定量供試液溶解于0.5 mL 氘代甲醇溶劑中，TMS 為內(nèi)標(biāo)，測(cè)定獨(dú)一味樣品的1H-NMR 圖譜。

2.2 供試溶液的制備 精密稱取干燥的甘肅瑪曲馬場(chǎng)產(chǎn)獨(dú)一味粉末約100.0 mg，置于2 mL EP 管中，分別加入0.8 mL CD3OD，超聲提取30 min，離心(10 000 r/min);取上清液以0.22 μm 微孔濾膜過(guò)濾，加入0.6 mL 至標(biāo)準(zhǔn)的5 mm 核磁管中，備用。

2.31H-NMR 譜圖處理 核磁圖譜采用MestReNova (Version:6.1.0-6224)傅立葉變換處理，以TSP 的化學(xué)位移為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)譜圖進(jìn)行校正并進(jìn)行相位、基線調(diào)整處理。將δ 0.00 ～8.00 范圍按照0.04 為最小間隔積分，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化處理。再對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行ASCⅡ標(biāo)準(zhǔn)化，除去因交叉弛豫引起峰型變寬的殘余水峰，最終得到186 段數(shù)據(jù)，代表186 個(gè)變量進(jìn)行相似度分析。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 精密度 精密稱取同一批甘肅瑪曲馬場(chǎng)供試品，按照“2.2”項(xiàng)制備供試樣品液。1H-NMR 波譜連續(xù)測(cè)定6 次，按“2.3”項(xiàng)下所述方法處理圖譜，得到6 組積分值數(shù)據(jù)，以第一組數(shù)據(jù)為共有模式，通過(guò)Excel 軟件計(jì)算數(shù)據(jù)之間的夾角余弦值，分別為1.000、0.996、0.995、0.996、0.999 和0.997，均大于0.995，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示儀器測(cè)量精密度良好。

2.4.2 重復(fù)性 精密稱取同一批藥材粉末6 份，每份100.0 mg，按照“2.2”項(xiàng)制備供試樣品液。再按上述方法分別進(jìn)行1H-NMR 測(cè)定和數(shù)據(jù)處理，按“2.3”項(xiàng)處理圖譜，得到6 組積分值數(shù)據(jù)，以第一組數(shù)據(jù)為共有模式，通過(guò)Excel 軟件計(jì)算數(shù)據(jù)之間的夾角余弦值，分別為 1.000、0.996、0.998、0.995、0.996 和0.997，均在0.995 以上，說(shuō)明樣品制備方法具有很好的重復(fù)性。

2.4.3 穩(wěn)定性 精密稱取同一批甘肅瑪曲馬場(chǎng)供試品，按照“2.2”項(xiàng)制備供試樣品液。分別在0、4、8、12、16、20 h 連續(xù)進(jìn)行1H-NMR 測(cè)定6 次，按“2.3”項(xiàng)處理圖譜，得到6 組積分值數(shù)據(jù)，以第1 組數(shù)據(jù)為共有模式，通過(guò)Excel 軟件計(jì)算數(shù)據(jù)之間的夾角余弦值，分別為 1.000、0.995、0.997、0.997、0.999、099 5 和0.997，均大于0.995，結(jié)果顯示在常溫實(shí)驗(yàn)條件下20 h 內(nèi)測(cè)定供試樣品溶液穩(wěn)定性良好。

2.5 圖譜信號(hào)歸屬 采用“加標(biāo)定性試驗(yàn)”、以及與文獻(xiàn)［5，7，9，13］數(shù)據(jù)比對(duì)的方法進(jìn)行獨(dú)一味供試品1H-NMR 指紋圖譜的信號(hào)歸屬。

3 討論

3.1 樣品提取溶劑的考察 取同一批藥材4 份(甘肅瑪曲馬場(chǎng))，分別以CDCl3、CD3OD-D2O(0.7 ∶0.3，V/V)、acetone-d6和CD3OD 為提取溶劑制備供試品溶液，進(jìn)行1H-NMR 測(cè)定，觀察每個(gè)溶劑體系的提取效率，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 不同提取溶劑的1H-NMR 測(cè)定結(jié)果比較Fig.1 1H-NMR Spectra of different solvent extractions

結(jié)果表明，CDCl3和acetone-d6能提取出更多的低極性代謝物，如脂肪酸類成分，但是二者對(duì)次生代謝產(chǎn)物的提取效率卻很低。CD3OD 和CD3OD-D2O 體系都能提取出更多的次生代謝產(chǎn)物，CD3OD-D2O 能提取出更多的糖類成分，但峰信號(hào)在δ3.0 ～4.0 之間重疊嚴(yán)重，CD3OD 峰信號(hào)整體重疊較CD3OD-D2O 輕，但信號(hào)強(qiáng)度較CD3OD-D2O 弱，但可以通過(guò)增加樣品的質(zhì)量提高提取溶液濃度消除信號(hào)較弱的缺點(diǎn)，綜合各種因素考慮，最終選擇CD3OD 為樣品溶液制備的提取溶劑。

3.2 藥材提取物1H-NMR 譜的代謝物鑒定 以甘肅瑪曲產(chǎn)獨(dú)一味地上部分為研究對(duì)象，進(jìn)行1HNMR 信號(hào)歸屬及代謝物鑒定。從1H-NMR 譜圖中可以獲取樣品中不同物質(zhì)的化學(xué)位移、耦合常數(shù)、裂分情況以及譜峰面積比例等相關(guān)信息，其中根據(jù)化學(xué)位移可初步判斷該質(zhì)子所處的化學(xué)基團(tuán)種類，以及“加對(duì)照品定性試驗(yàn)”和對(duì)比文獻(xiàn)數(shù)據(jù)，幫助物質(zhì)結(jié)構(gòu)的確定。如圖2 所示，樣品氫譜顯示δ7.32 (1H，s)為與羰基共軛的烯氫質(zhì)子，δ5.56(1H，d，J=4.0 Hz)為與兩個(gè)氧相連的次甲基質(zhì)子，與對(duì)照品8-O-乙酰山梔苷甲酯的NMR 圖譜吻合，可以構(gòu)建8-O-乙酰山梔苷甲酯的代謝物指紋峰。

最終，從獨(dú)一味地上部分提取物中共鑒定出10 個(gè)化合物(表1)，5 個(gè)環(huán)烯醚萜苷類化合物，3個(gè)苯丙素類化合物和2 個(gè)糖類化合物。其中:環(huán)烯醚萜苷類化合物為山梔苷甲酯，8-O-乙酰山梔苷甲酯，6-O-乙酰山梔苷甲酯，胡麻屬苷，Phlorigidoside C;苯丙素類化合物為木犀草苷，連翹酯苷B和毛蕊花糖苷;兩種糖類化合物為α-葡萄糖和β-葡萄糖。

表1 獨(dú)一味代謝產(chǎn)物1H-NMR 信號(hào)歸屬特征信號(hào)峰及耦合常數(shù)Tab.1 1H-NMR chemical shifts and coupling constant of L. rotate metabolites

獨(dú)一味地上部分的一維1H-NMR 譜見(jiàn)圖2。

圖2 獨(dú)一味氘代甲醇提取物1H-NMR 指紋圖譜中代謝產(chǎn)物信號(hào)歸屬Fig.2 Representative 1H-NMR spectra (CD3OD)of Lamiophlomis rotate methanol extract and metabolites are classified

4 結(jié)論

獨(dú)一味中的黃酮類成分和苯乙醇苷類成分，全波長(zhǎng)紫外吸收?qǐng)D譜比較接近，紫外分光光度法很難準(zhǔn)確測(cè)定出總黃酮類或苯乙醇苷類成分，HPLC 或HPLC-MS 等方法可以通過(guò)化合物的保留時(shí)間和相應(yīng)面積，對(duì)樣品中的兩類成分定性定量，但色譜柱品牌不同，儀器或?qū)嶒?yàn)室條件不同，結(jié)果難免產(chǎn)生偏差。實(shí)驗(yàn)基于1H-NMR 譜的獨(dú)一味地上部分測(cè)試，可檢測(cè)分析獨(dú)一味中10 個(gè)主要組成成分。同時(shí)供試品溶液制備簡(jiǎn)單，樣品測(cè)定快速，1H-NMR方法具有很好的普適性、耐用性和重復(fù)性。

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