效應(yīng)面法優(yōu)化染料木素磷脂復(fù)合物制備工藝

尹胭脂， 熊 陽(yáng) ， 吳雪莉， 祝露佳， 金 琪， 王星輝

(1. 湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙410208;2. 浙江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，浙江 杭州310053)

染料木素(genistein)亦稱金雀異黃素，主要是從大豆、葛根、槐花、染料木等豆科植物中提取出來(lái)的活性成分，是大豆異黃酮類物質(zhì)中活性最高的單一成分。它具有多種生物學(xué)活性，如抗氧化、抗腫瘤、抗糖尿病等，廣泛應(yīng)于制藥、保健品等領(lǐng)域，是一種很有潛力的癌癥化學(xué)預(yù)防劑，其抗癌作用具有廣泛的應(yīng)用前景。然而，染料木素的水溶性和脂溶性均較差，溶出速度慢;在胃腸道屬于被動(dòng)擴(kuò)散，油水分配系數(shù)小，腸滲透性差，多種因素導(dǎo)致其口服生物利用度很低［1-3］。

研究發(fā)現(xiàn)磷脂與某些藥物形成復(fù)合物后，可改善藥物的性質(zhì)。如改變藥物的溶解性能和溶出速度，增加其表觀油水分配系數(shù)，增強(qiáng)在胃腸道中的吸收，提高生物利用度;增強(qiáng)藥物的藥理作用及療效;延長(zhǎng)藥物的作用時(shí)間;降低藥物的毒副作用;減小胃腸道刺激性等［4-5］。因此，為提高染料木素的生物利用度，本實(shí)驗(yàn)將其制備成磷脂復(fù)合物。

星點(diǎn)設(shè)計(jì) (central composite rotatable design，CCRD)是近幾年來(lái)國(guó)外藥學(xué)工作者常用的集數(shù)學(xué)和統(tǒng)計(jì)方法于一體的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方法，應(yīng)用已經(jīng)成熟，與國(guó)內(nèi)經(jīng)常采用的均勻設(shè)計(jì)和正交設(shè)計(jì)相比具有精確度高、預(yù)測(cè)性好、簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)［6-7］。因此，本試驗(yàn)采取了星點(diǎn)設(shè)計(jì)結(jié)合效應(yīng)面法優(yōu)化染料木素磷脂復(fù)合物的制備工藝。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 JA1003 電子天平(上海精科有限公司);電子分析天平 (奧豪斯儀器有限公司CP213);恒溫水浴鍋(鞏義市英峪予華儀器制造廠);旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠);離心沉淀機(jī)(上海手術(shù)器械廠80-2);紫外分光光度計(jì)(上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司)。

1.2 藥品與試劑 染料木素和染料木素對(duì)照品(南京春秋生物工程有限公司;純度98%，批號(hào)ZL20120227);大豆磷脂(上海太偉藥業(yè)有限公司);其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 染料木素磷脂復(fù)合物制備方法 利用染料木素不溶于二氯甲烷，而磷脂和染料木素磷脂復(fù)合物均易溶于二氯甲烷且不易被破壞的特性，本實(shí)驗(yàn)采用二氯甲烷溶解反應(yīng)物分離未復(fù)合的染料木素。將一定量的染料木素和磷脂在一定條件下反應(yīng)后，減壓除去反應(yīng)溶劑，殘余物加入二氯甲烷，充分溶解磷脂及復(fù)合物，4 000 r/min 離心15 min，取上清液，去除有機(jī)溶劑后真空低溫干燥，即得染料木素磷脂復(fù)合物，為黃色略帶黏性的粉末。離心后所得的沉淀用95%乙醇溶解后，采用紫外可見(jiàn)光譜儀對(duì)未復(fù)合的染料木素進(jìn)行測(cè)定。

2.2 復(fù)合率的計(jì)算方法 由于染料木素幾乎不溶于二氯甲烷，而磷脂以及磷脂復(fù)合物易溶于二氯甲烷，將制備好的磷脂復(fù)合物加入適量二氯甲烷，磷脂復(fù)合物及多余的磷脂溶于其中，離心后的沉淀即為未復(fù)合的染料木素。通過(guò)公式(1)可計(jì)算出染料木素與磷脂的復(fù)合百分率(S):

其中M1為染料木素的初始投藥量;M2為沉淀量。

2.3 染料木素的UV 測(cè)定方法

2.3.1 紫外吸收波長(zhǎng)的確定 精密稱取10 mg 染料木素對(duì)照品，無(wú)水乙醇定容至100 mL，即得100.0 μg/mL 的貯備液，將貯備液配制成4.0 μg/mL溶液，于200 ～400 nm 進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描。結(jié)果顯示，其最大吸收波長(zhǎng)位于262 nm。

2.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 將染料木素貯備液配制成質(zhì)量濃度為2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 μg/mL 的溶液，以乙醇為空白，在262 nm 波長(zhǎng)下測(cè)吸光度。建立吸光度A 與質(zhì)量濃度C 的標(biāo)準(zhǔn)曲線，得標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=0.006 9X-0.003，r =0.999 7。由此可見(jiàn)，染料木素在2.0 ～6.0 μg/mL 范圍內(nèi)，吸光度與質(zhì)量濃度的線性關(guān)系良好。

2.3.3 精密度實(shí)驗(yàn) 取5.0 μg/mL 的對(duì)照品溶液，1 d 內(nèi)連續(xù)測(cè)定6 次吸光度，結(jié)果RSD =0.70%，說(shuō)明精密度良好。

2.3.4 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取5.0 μg/mL 的對(duì)照品溶液，分別于0、0.5、1、1.5、2、2.5、3 h 測(cè)定染料木素含有量。結(jié)果其RSD 為0.21%，表明染料木素在3h 內(nèi)保持穩(wěn)定。

2.3.5 回收率實(shí)驗(yàn) 取已知含有量的樣品溶液6份(3.8 μg/mL)，精密加入染料木素對(duì)照品(每1 mL加入相當(dāng)于4.0 μg 染料木素的貯備液)，在262 nm 波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度。根據(jù)實(shí)測(cè)值與理論值的比值計(jì)算回收率，結(jié)果該方法的平均回收率為(98.3 ±1.36)%，RSD 為1.49%。

2.4 單因素影響實(shí)驗(yàn)

2.4.1 反應(yīng)溶劑的選擇 設(shè)定磷脂與染料木素的投料比(m/m)為2 ∶1，反應(yīng)溫度為50 ℃，反應(yīng)時(shí)間為2 h，反應(yīng)物質(zhì)量濃度為25 mg/mL，以染料木素與磷脂的復(fù)合率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，考察四氫呋喃、無(wú)水乙醇、甲醇、乙酸乙酯等不同反應(yīng)溶劑對(duì)復(fù)合率的影響，分別平行3 份。

結(jié)果表明四氫呋喃作為反應(yīng)溶劑時(shí)，染料木素與磷脂的復(fù)合率較其他溶劑高，而且在試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，相比無(wú)水乙醇，采用四氫呋喃作為溶劑得到的產(chǎn)物黏性更小，樣品更容易分散。因此后續(xù)的實(shí)驗(yàn)選擇四氫呋喃作為反應(yīng)溶劑。

2.4.2 藥物與大豆磷脂投料比的影響 反應(yīng)溶劑為四氫呋喃，其余條件同“2.4.1”項(xiàng)，分別考察藥輔比(染料木素與大豆磷脂的投料比)為:1 ∶1、1 ∶2、1 ∶3、1 ∶4 時(shí)的復(fù)合率，分別平行3 份。

結(jié)果顯示藥物的結(jié)合百分率受磷脂與染料木素投料比的影響較大，隨磷脂投入量的增大而結(jié)合率增大，當(dāng)藥物與磷脂的比例為1 ∶3 時(shí)，所得復(fù)合物很黏，且攪拌后容器壁上有一些黏附物，而采用1 ∶1 的比例時(shí)，復(fù)合效果較差，1 ∶2 的比例較為適中，攪拌后容器壁上干凈，且所得復(fù)合物黏性適中，易于粉碎。

2.4.3 反應(yīng)時(shí)間的影響 其余條件同“2.4.1”項(xiàng)，考察不同反應(yīng)時(shí)間(1、2、3、4 h)對(duì)藥物形成復(fù)合率的影響。分別平行3 份。

結(jié)果表明反應(yīng)時(shí)間對(duì)復(fù)合率有一定影響，藥物與磷脂的反應(yīng)于2 h 后基本完全。超過(guò)2 h 后復(fù)合率反而有所下降。

2.4.4 反應(yīng)溫度的影響 其余條件同“2.4.1”項(xiàng)，考察不同反應(yīng)溫度(30、40、50、60 ℃)下染料木素與磷脂的復(fù)合率。分別平行3 份。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，隨溫度升高，藥物的復(fù)合率有所增加。但是當(dāng)溫度高于60 ℃時(shí)，磷脂容易氧化，所以試驗(yàn)的溫度不能高于60 ℃。

2.4.5 反應(yīng)物質(zhì)量濃度的影響 其余條件同“2.4.1”項(xiàng)，考察不同反應(yīng)物質(zhì)量濃度(5、10、20、30 mg/mL)對(duì)復(fù)合率的影響，分別平行3 份。結(jié)果顯示反應(yīng)物質(zhì)量濃度為20 mg/mL 時(shí)的復(fù)合率最高，高于或低于此質(zhì)量濃度均會(huì)使復(fù)合率降低。

從以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，影響染料木素與磷脂復(fù)合率的主要因素是反應(yīng)物質(zhì)量濃度、投料比、反應(yīng)時(shí)間，而其他因素影響不大。

2.5 星點(diǎn)設(shè)計(jì)—效應(yīng)面法優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

2.5.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案 本試驗(yàn)中，根據(jù)單因素的考察結(jié)果，選擇對(duì)復(fù)合率影響較大的因素作為考察因素，即反應(yīng)時(shí)間(X1)、反應(yīng)物質(zhì)量濃度(X2)、染料木素與磷脂投料比(X3)，在確定各因素水平的極大(+α)和極小值(-α)以后，依據(jù)水平代碼分別求出+1、0、-1 所代表的物理量?！?、0 水平的安排遵循任意兩個(gè)物理量之間的差值與對(duì)應(yīng)代碼之間差值成等比的原則。實(shí)驗(yàn)中3 個(gè)考察因素的代碼水平及對(duì)應(yīng)物理量見(jiàn)表1，以復(fù)合率(y)為考察指標(biāo)，相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

表1 星點(diǎn)設(shè)計(jì)因素水平Tab.1 Factors ＆ levels of central composite design

表2 星點(diǎn)設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)安排及結(jié)果Tab.2 Central composite test design and results

2.5.2 模型擬合 以復(fù)合率為響應(yīng)指標(biāo)，應(yīng)用matlab 7.6 軟件，采用最小二乘法分別擬合各響應(yīng)指標(biāo)與影響因素間的一次項(xiàng)模型及全二次項(xiàng)模型。在擬合之前，先對(duì)各影響因素進(jìn)行正規(guī)化(即使Xnew = Xold/max (Xold)，以消除量綱不一致)。若一次項(xiàng)擬合結(jié)果較為理想，則采用該模型;若響應(yīng)指標(biāo)與影響因素間的關(guān)系較為復(fù)雜，采用一次項(xiàng)擬合結(jié)果并不理想，則采用全二次項(xiàng)模型進(jìn)行擬合;最后通過(guò)比較復(fù)相關(guān)系數(shù)及P 檢驗(yàn)選取較優(yōu)模型確立為最終擬合模型。對(duì)于二項(xiàng)式方程，根據(jù)統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)各項(xiàng)系數(shù)進(jìn)行的P檢驗(yàn)結(jié)果，篩除無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的參數(shù)(P ＞0.25)后，再進(jìn)行二項(xiàng)式方程擬合，達(dá)到模型簡(jiǎn)化之目的。所得方程如下:

(1)多元線性回歸方程

y=0.723 6+0.047 7X1+0.121 2X2+0.097 0X3，(r=0.910 3，復(fù)相關(guān)系數(shù)radj=0.892 4，P ＜0.000 1)

(2)全二項(xiàng)式方程為(準(zhǔn)入條件為P≤0.25):

其中全二項(xiàng)式方程中各項(xiàng)系數(shù)的P 值具體如下:X1:0.188 6;X2:0.003 8;X3:0.037 1;X1X2:0.199 0;X1X1:0.243 7;X2X2:0.037 0;X3X3:0.006 1。

由以上方程可知，全二項(xiàng)式擬合相關(guān)系數(shù)r 值高于多元線性回歸，擬合度高，且預(yù)測(cè)性好，實(shí)測(cè)值和預(yù)測(cè)值基本吻合(見(jiàn)圖1)，故選擇全二項(xiàng)式擬合模型為最終模型。

圖1 預(yù)測(cè)復(fù)合率與實(shí)測(cè)復(fù)合率關(guān)系圖Fig.1 Relational graph of predicted and actual recombination rate

2.5.3 效應(yīng)面優(yōu)化與預(yù)測(cè) 以簡(jiǎn)化后的全二項(xiàng)式數(shù)學(xué)模型為基礎(chǔ)描繪等高線圖作為效應(yīng)面，見(jiàn)圖2 ～4。

圖2 投料比和反應(yīng)物質(zhì)量濃度對(duì)復(fù)合率影響的等高線圖(反應(yīng)時(shí)間為2 h)Fig.2 Contour map of the influence of weight ratio and reactant concentration on the recombination rate(the reaction time is 2 h)

圖3 投料比和反應(yīng)時(shí)間對(duì)復(fù)合率影響的等高線圖(反應(yīng)物質(zhì)量濃度為15 mg/mL)Fig.3 Contour map of the infleunce of weight ratio and reaction time on the recombination rate (the reactant concentration is 15mg/mL)

圖4 反應(yīng)時(shí)間和反應(yīng)物質(zhì)量濃度對(duì)復(fù)合率影響的等高線圖(投料比為1 ∶2)Fig.4 Contour map of the influence of reaction time and reactant concentration on the recombination rate(the weight ratio is 1 ∶2)

由圖2 可知，在一定范圍內(nèi)，當(dāng)投料比相同時(shí)，染料木素與磷脂的復(fù)合率隨反應(yīng)物質(zhì)量濃度的增大而增大;而當(dāng)反應(yīng)物質(zhì)量濃度相同時(shí)，復(fù)合率隨投料比的增大而增高;由圖3 可知，投料比質(zhì)量濃度較低時(shí)，反應(yīng)時(shí)間越長(zhǎng)復(fù)合率越高，當(dāng)投料比增加到一定值時(shí)，復(fù)合率不會(huì)隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)而不斷增加，即在某一區(qū)域內(nèi)復(fù)合率增高趨勢(shì)達(dá)到平臺(tái)期;由圖4 可知，當(dāng)反應(yīng)物質(zhì)量濃度增大時(shí)，達(dá)到相同復(fù)合率所需的反應(yīng)時(shí)間越少;當(dāng)反應(yīng)時(shí)間一定時(shí)，反應(yīng)物質(zhì)量濃度越高，復(fù)合率越高，從二次項(xiàng)方程式可以看出，反應(yīng)物質(zhì)量濃度與反應(yīng)時(shí)間之間存在明顯的交互作用。

2.5.4 優(yōu)化工藝及驗(yàn)證 由軟件預(yù)測(cè)的最優(yōu)條件為:X1=2.1548，X2=25，X3=2 ∶3，預(yù)測(cè)的y =98.18%。為了確定建立模型與實(shí)驗(yàn)結(jié)果是否相符，通過(guò)進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)對(duì)模型的可靠性進(jìn)行驗(yàn)證。在預(yù)測(cè)優(yōu)選出的最佳工藝條件下制備染料木素磷脂復(fù)合物，共進(jìn)行4 組實(shí)驗(yàn)，取平均值與全二項(xiàng)式方程優(yōu)選出的最佳工藝條件下模擬的預(yù)測(cè)值進(jìn)行比較，結(jié)果染料木素磷脂復(fù)合物復(fù)合率的實(shí)驗(yàn)值為(97.57 ±1.03)%，預(yù)測(cè)值為98.18%，二者相差低于1%，說(shuō)明模型是比較可靠的，實(shí)驗(yàn)所得到的擬合方程可以較好地描述因素與指標(biāo)的關(guān)系。

2.6 染料木素磷脂復(fù)合物理化性質(zhì)的測(cè)定

2.6.1 溶解度的測(cè)定 取過(guò)量的染料木素、染料木素與磷脂的物理混合物(按照復(fù)合物的工藝配比，藥量和輔料的比例與復(fù)合物相同)、染料木素磷脂復(fù)合物，分別加入1 mL 的水、正辛醇、二氯甲烷，平行3 份，37 ℃恒溫振蕩24 h，4 000 r/min離心10 min，上清液加乙醇稀釋適當(dāng)倍數(shù)進(jìn)行染料木素測(cè)定。結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 染料木素及其物理混合物、磷脂復(fù)合物在不同溶劑中的溶解度(n=3)Tab.3 Solubility of genistein and its physical mixture，phospholipid complex in different solvents (n=3)

2.6.2 油水分配系數(shù)的測(cè)定 取適量染料木素、含染料木素的物理混合物、磷脂復(fù)合物分別溶于40 mL 水飽和的正辛醇中，放在超聲波使其溶解。離心，取上清液，留取母液。從中取10 mL 放入錐形瓶中，加入10 mL 正辛醇飽和的水，平行3 份，恒溫振蕩24 h，分別取正辛醇層、水層稀釋適當(dāng)倍數(shù)后測(cè)定其中染料木素含量。采用公式(2)計(jì)算Ko/w值。

式中Co、Cw分別為藥物在正辛醇層和水層的濃度。

計(jì)算得染料木素、含染料木素的物理混合物、磷脂復(fù)合物的油水分配系數(shù)分別為0.768 9 ±0.064 7、1.093 2 ±0.123 5、0.892 0 ±0.047 0。

3 討論

在工藝優(yōu)化和處方篩選過(guò)程中，常需同時(shí)考察多個(gè)因素對(duì)結(jié)果的影響，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行優(yōu)化。采用固定其他因素改變某一因素的單因素考察法能收到一定效果，但也具有一定的局限性，實(shí)驗(yàn)次數(shù)較多且費(fèi)用較高，而且無(wú)法考察各因素間的交互作用，而因素之間的交互作用對(duì)響應(yīng)指標(biāo)的影響很大。選擇適應(yīng)于非線性擬合的試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法，可提高實(shí)驗(yàn)精確度，提高優(yōu)化效果。近年來(lái)常用集數(shù)學(xué)和統(tǒng)計(jì)學(xué)方法于一體的效應(yīng)面優(yōu)化法進(jìn)行優(yōu)化，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)采用中心組成設(shè)計(jì) (central composite design，CCD)［7-8］，它能以較少的實(shí)驗(yàn)次數(shù)對(duì)各因素的效應(yīng)進(jìn)行非線性估計(jì)，并能通過(guò)求得的考察指標(biāo)與各因素間的關(guān)系式和效應(yīng)面，確定在試驗(yàn)范圍內(nèi)的各因素的最佳值，反映各因素及因素間的相互作用對(duì)指標(biāo)值的影響程度。從本實(shí)驗(yàn)的單因素考察中無(wú)法看出各因素之間的交互作用，而采用星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面優(yōu)化法，不僅可以得到單個(gè)因素對(duì)指標(biāo)的影響及影響程度，還得到了各主要因素之間的交互作用，從而取得了較好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

由染料木素及磷脂復(fù)合物的理化性質(zhì)可知，將染料木素制備成磷脂復(fù)合物后，即提高了它在水中的溶解度，同時(shí)也提高了其在有機(jī)溶劑中的溶解度。相對(duì)于染料木素、染料木素和磷脂的物理混合物在水中溶解度均略有提高，這是由于磷脂是屬于表面活性劑，可以在一定程度上起到增溶作用。而在二氯甲烷和正辛醇中也有所提高，可能是由于染料木素在與正辛醇、二氯甲烷攪拌的過(guò)程中，也有部分形成了磷脂復(fù)合物的形式，或者是由于溶解了磷脂的有機(jī)溶劑本身對(duì)于染料木素的溶解行為就有所改變。但相對(duì)于磷脂復(fù)合物，物理混合物在水中和有機(jī)溶劑中的溶解度均沒(méi)有磷脂復(fù)合物提高的多。據(jù)報(bào)道，黃酮類成分等與磷脂的極性基團(tuán)部分可以發(fā)生較強(qiáng)的相互作用，抑制了分子中單鏈的自由轉(zhuǎn)動(dòng)，而磷脂的兩個(gè)長(zhǎng)鏈脂肪酸鏈不參與復(fù)合反應(yīng)，可自由移動(dòng)，包裹了磷脂的極性部分形成一個(gè)親脂性的表面，使復(fù)合物表現(xiàn)出較強(qiáng)的脂溶性［10］。

從油水分配系數(shù)的結(jié)果可知，磷脂復(fù)合物在正辛醇/水系統(tǒng)的油水分配系數(shù)相比染料木素有所提高，但不如物理混合物提高的多，原因可能是由于磷脂復(fù)合物同時(shí)提高了染料木素在水中和正辛醇中的溶解度，但正辛醇和水中溶解度提高倍數(shù)之間的比例不如物理混合物大。

藥物的油/水分配系數(shù)與藥物在生物膜中的分配有關(guān)，油水分配系數(shù)在一定范圍內(nèi)的增大，會(huì)使藥物進(jìn)入生物膜的量增大，有利于藥物的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，從而使進(jìn)入體內(nèi)的藥物量增加，生物利用度提高［10］。染料木素磷脂復(fù)合物油水分配系數(shù)的增大，預(yù)示其體內(nèi)吸收有可能得到提高。但和物理混合物相比，是否可以顯著提高還有待進(jìn)一步研究。

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