基于納濾技術(shù)的消癌平注射液中的鉀離子去除工藝優(yōu)化

李存玉， 錢(qián) 祥， 楊澤秋， 陳偉偉， 李紅陽(yáng)， 彭國(guó)平*

(1. 南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 南京210023;2. 江蘇省中藥資源產(chǎn)業(yè)化過(guò)程協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇南京210023)

消癌平注射液是以單一藥材通關(guān)藤為原料，經(jīng)過(guò)水提取、精制而成的中藥注射劑，具有清熱解毒，化痰軟堅(jiān)的功效，多用于治療肝癌、肺癌、胃癌、食道癌等，多作為放療、化療的輔助治療藥物使用，臨床使用量較大，是一種效果較好的抗癌藥物［1］。但是，借助中藥注射液安全性再評(píng)價(jià)的契機(jī)，在對(duì)消癌平注射液進(jìn)行工藝優(yōu)化時(shí)發(fā)現(xiàn)，其生產(chǎn)過(guò)程中常常出現(xiàn)鉀離子濃度偏高的現(xiàn)象，危害著其用藥安全性。

鉀離子普遍存在于中藥材中，當(dāng)作為靜脈給藥時(shí)，鉀離子濃度過(guò)高容易造成機(jī)體電解質(zhì)平衡失調(diào)，對(duì)心肌的損傷很大［2］。因此，《中國(guó)藥典》2010 版規(guī)定靜脈注射液中鉀離子質(zhì)量濃度不得超過(guò)22% (mg/mL)［3］。消癌平注射液中鉀離子的超標(biāo)直接是由其原料藥材通關(guān)藤所引入的，因此需要在通關(guān)藤藥材提取、濃縮等工藝環(huán)節(jié)中采取適宜的方法降低鉀離子的含量，提升注射劑的質(zhì)量安全。

目前鉀離子的去除方法主要分為陽(yáng)離子交換樹(shù)脂法、電滲析法［4］，二者均能有效的去除藥液中的鉀離子，但是均存在成分吸附損失的問(wèn)題，因此在中藥注射液生產(chǎn)中存在應(yīng)用瓶頸。而納濾是介于超濾和反滲透之間的一種膜分離技術(shù)，截留分子量在200 ～1 000 Da 之間，具有操作壓力低，通量高，對(duì)無(wú)機(jī)離子高效去除的能力，目前在制藥、生物化工、食品、水處理等諸多領(lǐng)域廣泛應(yīng)用［5-8］。

為了在降低消癌平注射液中的鉀離子濃度的同時(shí)，保留其有效成分，本研究選擇系列截留分子量的納濾膜進(jìn)行消癌平注射液中間體納濾處理，以鉀離子的去除和有效成分綠原酸的保留為指標(biāo)，優(yōu)選適宜于中藥注射劑中鉀離子的去除工藝。

1 材料與方法

1.1 材料 通關(guān)藤飲片(批號(hào)20100130，由南京圣和藥業(yè)有限公司提供)，納濾膜(截留分子量150 ～300 Da、300 ～500 Da、600 ～800 Da，聚酰胺復(fù)合膜，星達(dá)(泰州)膜科技有限公司)，綠原酸對(duì)照品(批號(hào)110753-200212，中國(guó)食品藥品檢定研究院)，鉀離子標(biāo)準(zhǔn)溶液(國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心)，乙腈、磷酸為色譜純，水為超純水。

1.2 儀器 Agilent 1100 高效液相色譜儀(VWD檢測(cè)器，美國(guó)Agilent LC 公司);TAS-986 火焰原子吸收分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司);納濾膜分離設(shè)備(型號(hào)TNZ-1，南京拓鉒醫(yī)藥科技有限公司);不銹鋼煎藥桶(容量50 L)，燃?xì)鉃楦呒兌纫胰矚?，空氣為助燃?xì)狻?/p>

1.3 方法

1.3.1 消癌平注射液中間體的制備 按照消癌平注射液質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)制法，取通關(guān)藤飲片5.0 kg，加水(8、5、5 倍)煎煮3 次，第1 次1.5 h，第2 次1 h，第3 次0.8 h，提取液分別濾過(guò)，合并濾液，得消癌平注射液中間體約80 L。

1.3.2 納濾工藝 取消癌平注射液中間體40 L，取樣為原液，分別采用3 種不同截留分子量的納濾膜濃縮(納濾膜參數(shù)見(jiàn)表1)，操作壓力5 kg/cm2、溫度25 ℃，納濾濃縮過(guò)程如圖1 所示，將進(jìn)液端與截留液端均置于原液中，隨著納濾的進(jìn)行，根據(jù)最終可生產(chǎn)的消癌平注射液成品量，在原液濃縮至體積在4 L 左右時(shí)，加入3 倍體積純凈水繼續(xù)納濾，重復(fù)3 次，將濃縮液定容至4 L，取樣為納濾濃縮液。

表1 納濾膜參數(shù)Tab.1 Parameters of nanofiltration membrane

圖1 納濾膜過(guò)程示意圖Fig.1 Schematic diagram of nanofiltration process

1.3.3 綠原酸檢測(cè)［9-10］

1.3.3.1 綠原酸對(duì)照品溶液的制備 取綠原酸對(duì)照品適量，精密稱(chēng)定，置棕色量瓶中，加50%甲醇制成每1 mL 含40 μg 的綠原酸對(duì)照品溶液，即得。

1.3.3.2 HPLC 色譜條件 色譜柱:Thermo scientific C18色譜柱(4.6 mm ×150 mm，5 μm);柱溫25 ℃;檢測(cè)波長(zhǎng)327 nm;體積流量1 mL/min;進(jìn)樣量10 μL;流動(dòng)相乙腈-0.4% 磷酸水溶液 (9-91)。

1.3.3.3 綠原酸保留率測(cè)定 分別精密吸取綠原酸對(duì)照品溶液、消癌平注射液中間體、納濾濃縮液，按“1.3.3.2”項(xiàng)下的色譜條件，采用高效液相色譜法測(cè)定峰面積，采用外標(biāo)一點(diǎn)法，按式(1)計(jì)算綠原酸的保留率。

式中，R 為綠原酸的保留率;CN為納濾濃縮液中綠原酸的質(zhì)量濃度，單位為μg/mL;VN為納濾濃縮液體積，單位為mL;CT為提取液中綠原酸的質(zhì)量濃度，單位為μg/mL;VT為提取液體積，單位為mL。

1.3.4 鉀離子的檢測(cè)［11］

1.3.4.1 測(cè)定條件 檢測(cè)波長(zhǎng):768.5 nm，空心陰極燈電流2.0 mA，狹縫為0.2 nm，采用空氣-乙炔火焰，燃?xì)饬髁?.5 L/min。

1.3.4.2 線性關(guān)系 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備:精密量取質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL 的鉀單元素標(biāo)準(zhǔn)溶液100 mL，為對(duì)照品貯備液。

分別精密量取上述對(duì)照品貯備液各0、1、2、3、4、5 mL 置25 mL 量瓶中，純化水稀釋制得每1 mL分別含鉀0、20、40、60、80、100 μg 的溶液，依次噴入火焰，測(cè)定吸光度，以吸光度Y 為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度X (μg/mL)為橫坐標(biāo)，進(jìn)行二次方程最小二乘法擬合回歸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得回歸方程:Y = -0.001 03X2+0.150 22X +0.049 71，r=0.999 8。

1.3.4.3 重復(fù)性試驗(yàn) 按“1.3.4.2”項(xiàng)下方法制備同一批樣品的溶液6 份，平行測(cè)定，RSD為1.6%。

1.3.4.4 精密度試驗(yàn) 取同一份供試品溶液連續(xù)測(cè)定6 次，吸收值RSD 為1.1%。

1.3.4.5 回收率試驗(yàn) 精密量取納濾濃縮液1 mL于25 mL 量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻。分別精密量取上述溶液2.5 mL 及對(duì)照品貯備液1 mL 于同一25 mL 量瓶中，純化水稀釋至刻度，搖勻，即得加樣回收溶液。平行制備6 份，依法測(cè)定，計(jì)算回收率?；厥章势骄禐?8.7% (n = 6)，RSD為2.8%。

1.3.4.6 樣品測(cè)定 精密量取消癌平注射液中間體(或納濾濃縮液)1 ～10 mL (使供試品溶液吸收值在標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi))于25 mL 量瓶中，純化水稀釋至刻度，搖勻，即得供試品溶液。精密吸取空白溶液與供試品溶液，照標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備項(xiàng)下方法測(cè)定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算供試品中鉀的含有量，按式(2)計(jì)算鉀離子的去除率。

式中，Q 為鉀離子的去除率;CN＇為納濾濃縮液中鉀離子的質(zhì)量濃度，單位為μg/mL;VN＇為納濾濃縮液體積，單位為mL;CT＇為提取液中鉀離子的質(zhì)量濃度，單位為μg/mL;VT＇為提取液體積，單位為mL。

2 結(jié)果

2.1 綠原酸的保留率 從表2 數(shù)據(jù)中可以看出，不同截留分子量的納濾膜對(duì)綠原酸的保留率表現(xiàn)出一定差異，但是隨著膜孔徑的增大，綠原酸保留率呈現(xiàn)出下降的趨勢(shì)，其中截留率分子量小于500 Da 時(shí)，綠原酸的保留率均能控制在93%以上，當(dāng)選用600 ～800 Da 納濾膜時(shí)，綠原酸損失明顯，接近20%，高于150 ～300 Da 納濾膜。

2.2 鉀離子的去除率 對(duì)比不同孔徑納濾膜的鉀離子去除效果，從表2 數(shù)據(jù)中可以看出，3 種納濾膜中鉀離子均有較高的透過(guò)率，均高于74%，但是150 ～300Da 納濾膜濃縮液中鉀離子質(zhì)量濃度高達(dá)383.2 μg/mL，而300 ～500 Da 及600 ～800 Da納濾膜濃縮液中鉀離子質(zhì)量濃度均低于220 μg/mL，且去除率均高于150 ～300 Da 納濾膜。

表2 不同納濾膜的綠原酸保留率及鉀離子去除率Tab.2 Rates of chlorogenic acid retention and K + removal by different nanofiltration membranes

2.3 鉀離子去除的納濾工藝優(yōu)選 以消癌平注射液中間體中有效成分綠原酸的保留率及鉀離子去除率作為納濾濃縮工藝優(yōu)選的評(píng)價(jià)指標(biāo)，但是分析表2 中數(shù)據(jù)可以得出，綠原酸的保留和鉀離子的去除是一對(duì)難以解決的技術(shù)矛盾，在保障注射劑中鉀離子質(zhì)量濃度小于《中國(guó)藥典》2010 版規(guī)定(220 μg/mL)時(shí)的同時(shí)，可以選擇截留分子量為300 ～500 Da 及600 ～800 Da 納濾膜，其中600 ～800 Da納濾膜的綠原酸損失明顯，故選擇截留分子量為300 ～500 Da 納濾膜去除消癌平注射液中的鉀離子。

3 討論

消癌平注射液在實(shí)際生產(chǎn)中，多采用電滲析法去除通關(guān)藤提取液中的鉀離子，但是綠原酸及部分甾體皂苷類(lèi)成分損失嚴(yán)重，而電滲析處理后需要進(jìn)一步的加熱濃縮，又進(jìn)而降低了有效成分綠原酸的質(zhì)量濃度，導(dǎo)致目前存在鉀離子超標(biāo)的注射劑品種，多以有效成分損失為代價(jià)來(lái)保障注射劑的用藥安全性。

納濾技術(shù)具有常溫操作，不破壞熱敏性成分的優(yōu)勢(shì)［12］，在消癌平注射液中間體濃縮中具有明顯的技術(shù)優(yōu)勢(shì)。雖然在離子去除的同時(shí)，綠原酸有少量損失，但是與目前常用的電滲析法或離子交換樹(shù)脂法比較，則優(yōu)勢(shì)明顯。600 ～800 Da 納濾膜對(duì)消癌平注射液中間體濃縮時(shí)，鉀離子的去除率高達(dá)99.3%，雖然綠原酸的保留率在80%左右，但是隨著通關(guān)藤提取液的濃縮，濃縮液中綠原酸濃度升高的同時(shí)，其膜透過(guò)量也會(huì)相應(yīng)提高，損失量增加，因此本實(shí)驗(yàn)中采用“濃縮液中加入3 倍體積純凈水繼續(xù)納濾，重復(fù)3 次”的納濾濃縮方法，如果減少藥液的稀釋倍數(shù)與重復(fù)納濾次數(shù)，綠原酸的損失會(huì)下降，但是鉀離子的去除效率則難以保證，但是增加藥液的稀釋倍數(shù)與重復(fù)納濾次數(shù)，在引起有效成分損失的同時(shí)，生產(chǎn)效率也會(huì)大幅降低。

雖然納濾技術(shù)在中藥制劑生產(chǎn)中的濃縮應(yīng)用尚處于起步階段，但是其具有良好的應(yīng)用前景，在去除有害物質(zhì)的同時(shí)，提升中藥注射劑質(zhì)量。但是，隨著納濾技術(shù)的逐步推廣，首先需要考慮納濾膜在使用中膜材質(zhì)與藥液之間的兼容性，不能因?yàn)槟げ馁|(zhì)的脫落危害注射劑的安全性，從而限制了納濾技術(shù)的推廣應(yīng)用;其次納濾膜使用方法的規(guī)范性，從而保證注射劑產(chǎn)品質(zhì)量的均一性。納濾技術(shù)的種種優(yōu)勢(shì)決定了其應(yīng)用潛力，但是在實(shí)際的推廣中必須根據(jù)中藥提取液中成分的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，選擇適宜的納濾濃縮方式。

［1］ 李邇娜，王 芳，欽 松，等. 消癌平注射液抗腫瘤作用機(jī)制研究進(jìn)展［J］. 中國(guó)中醫(yī)藥信息雜志，2012，19(9):111-112.

［2］ 徐麗君，魏世超，鄒 欣，等. 黃芩注射液去鉀離子工藝研究［J］. 醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2002，S1:11.

［3］ 國(guó)家藥典委員會(huì). 中華人民共和國(guó)藥典:2010 年版一部［S］. 北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010，附錄ⅠⅩS.

［4］ 鐘躍寬，郝鵬彬，孫晶波，等. 紅花注射液去除鉀離子不同工藝對(duì)比研究［J］. 臨床合理用藥，2013，6(4B):31-32.

［5］ 崔崇威，紀(jì) 峰，唐小輝，等. 納濾膜法生產(chǎn)桶裝飲用水與提高水資源利用率［J］. 哈爾濱工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，39(2):258-261.

［6］ 韓少卿，葉 驥，薛 強(qiáng)，等. 超濾和納濾膜分離技術(shù)提取螺旋霉素［J］. 中國(guó)抗生素雜志，2005，30(1):52-55.

［7］ 胡立新，崔朝亮，程新華，等. 利用膜分離技術(shù)對(duì)牛初乳進(jìn)行除菌濃縮的研究［J］. 食品科技，2007，(3):90-92.

［8］ 牟旭鳳，白慶中，陳紅盛，等. 聚合物輔助超濾/納濾技術(shù)處理模擬放射性廢水［J］. 給水排水，2006，32 (S1):174-177.

［9］ 溫瑞卿，李東輝，王 鑫. HPLC 法和聚類(lèi)分析法探討不同廠家消癌平片中綠原酸含量的一致性和穩(wěn)定性［J］. 中成藥，2011，32(11):2021-2023.

［10］ 溫瑞卿，李東輝，韓 杰，等. 消癌平片中綠原酸測(cè)定的影響因素和優(yōu)化研究［J］. 中成藥，2012，34 (4):762-764.

［11］ 聶黎行，金紅宇，林瑞超，等. 原子吸收分光光度法測(cè)定紅花注射液中鉀的含量［J］. 藥物分析雜志，2010，30(3):468-470.

［12］ Murakami A N N，Amboni R D M C，Prudêncio E S，et al.Concentration of biologically active compounds extracted from Ilex paraguariensis St. Hil. By nanofiltration［J］. Food Chem，2013，141(1):60-65.