沉淀聚合法制備1-脫氧野尻霉素分子印跡聚合物微球及其性能研究

羅孟君，鄧?guó)P君，郭巧紅，陳宗高，陳 波

1益陽(yáng)醫(yī)學(xué)高等專(zhuān)科學(xué)校，益陽(yáng) 413000;2 益陽(yáng)市第一中學(xué)，益陽(yáng) 413000;3 湖南師范大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，長(zhǎng)沙 410081

分子印跡技術(shù)(molecular imprinting technology，MIT)是指為獲得在空間結(jié)構(gòu)和結(jié)合位點(diǎn)上與某一分子(模板分子)完全匹配的聚合物的實(shí)驗(yàn)制備技術(shù)，常常被形容為制造識(shí)別“分子鑰匙”的人工“鎖”技術(shù)。分子印跡聚合物(molecularly imprinted polymer，MIP)是一類(lèi)通過(guò)分子印跡技術(shù)合成的對(duì)特定目標(biāo)分子(模板分子)及其結(jié)構(gòu)類(lèi)似物具有特異性識(shí)別和選擇性吸附的聚合物。由于其能夠特異性識(shí)別印跡分子，因此近年來(lái)被廣泛應(yīng)用于色譜分離［1］、膜分離［2］、固相萃取［3］、藥物控制釋放［4］、化學(xué)傳感［5］、環(huán)境檢測(cè)［6］等領(lǐng)域。

1-脫氧野尻霉素(1-Deoxynojirimycin，DNJ)又名1-去氧野艽霉素，是一種哌啶類(lèi)多羥基生物堿，化學(xué)名稱(2R，3R，4R，5S)-2-羥甲基哌啶-3，4，5-三醇，通常為白色粉末，分子式為C6H13NO4，其結(jié)構(gòu)式如圖1。

圖1 1-脫氧野尻霉素結(jié)構(gòu)式Fig.1 Chemical structure of DNJ

DNJ 是目前糖尿病治療藥物中唯一國(guó)際公認(rèn)的零傷害生物制劑，具有對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用，是降血糖、治療糖尿病的有效成分［7，8］，此外還具有抗病毒［9，10］、抗腫瘤轉(zhuǎn)移［11］等藥理作用。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)DNJ 的來(lái)源、在生物體內(nèi)的合成機(jī)制及化學(xué)合成方法進(jìn)行了大量的研究探索，希望為找到一種穩(wěn)定、高效、經(jīng)濟(jì)的獲取DNJ 的途徑提供理論基礎(chǔ)。

本研究以DNJ 為模板分子，MAA 為功能單體，EGDMA 為交聯(lián)劑，2，2'-偶氮二異丁腈(AIBN)為引發(fā)劑，乙腈為致孔劑，采用沉淀聚合法合成了對(duì)DNJ分子有特異性吸附、識(shí)別性能的MIP 微球，用于DNJ的選擇性吸附和富集。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

1-脫氧野尻霉素標(biāo)準(zhǔn)品(批號(hào):024K4076，美國(guó)Sigma 公司);甲基丙烯酸(MAA，99%，美國(guó)Sigma公司);乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA，98%，科密歐);偶氮二異丁腈(AIBN，化學(xué)純，阿拉丁試劑有限公司);乙腈(色譜純，科密歐)

恒溫水浴鍋(HH-4，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司);Agilent 1100 系列高效液相色譜儀，含F(xiàn)LD熒光檢測(cè)器;掃描電子顯微鏡(SEM，Hitachi S-4300，日本日立公司);電子天平(AX-200，日本Shimadzu Philippines 公司)

1.2 分子印跡聚合物微球的制備

1.2.1 溶劑的考察

準(zhǔn)確稱取0.25 mmol 的DNJ，分別溶于氯仿、乙腈、四氫呋喃、甲醇四種溶劑中，對(duì)其溶解能力進(jìn)行觀察。

1.2.2 反應(yīng)時(shí)間的考察

在固定其他反應(yīng)條件不變的前提下，采用不同的反應(yīng)時(shí)間合成了1-脫氧野尻MIP 微球。通過(guò)對(duì)產(chǎn)率進(jìn)行考察，從而確定最佳的反應(yīng)時(shí)間。

1.2.3 DNJ 分子印跡聚合物微球的制備

稱取DNJ 溶于一定量乙腈中，加入功能單體MAA，于室溫下震蕩30 min，置于冰箱中過(guò)夜，使DNJ 與MAA 充分作用，然后加入交聯(lián)劑EGDMA 和引發(fā)劑AIBN，充分混勻后，向混合液中通氮?dú)?0 min 除氧后密封，將混合液置于恒溫水浴箱，60 ℃熱聚合聚合24 h。聚合產(chǎn)物取出冷卻至室溫，離心獲得聚合物沉淀，用V(甲醇)∶V (乙酸)=9∶1 溶液洗掉模板分子和未聚合的功能單體和交聯(lián)劑，直至洗脫液中檢測(cè)不到模板分子，再用甲醇洗去過(guò)量的乙酸，于烘箱中40 ℃真空干燥。所得聚合物為MIP;同時(shí)按同樣方法不加DNJ 制備空白聚合物(NIP)。

1.3 吸附性能測(cè)定

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

準(zhǔn)確稱取100.0 mg DNJ 標(biāo)準(zhǔn)品，用乙腈定容至10 mL 容量瓶，得到10 mg/mL 的DNJ 標(biāo)準(zhǔn)溶液母液，然后根據(jù)母液配制1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0 μg/mL 的梯度標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照文獻(xiàn)［14］所述柱前衍生-高效液相色譜法，用高效液相色譜-熒光檢測(cè)器測(cè)定，測(cè)得DNJ 峰面積A，繪制DNJ 溶液濃度與色譜峰面積值的工作曲線，并進(jìn)行線性回歸處理。

衍生化處理?xiàng)l件為:取10 μL DNJ 對(duì)照品溶液，依次加入10 μL 0.4 mol/L K3BO3緩沖液(pH 8.5)、20 μL 5 mmol/L FMOC-Cl 乙腈溶液，混勻后于20 ℃下反應(yīng)20 min，加入10 μL 0.1 mol/L 甘氨酸水溶液以中止反應(yīng)，反應(yīng)液再加入到950 μL 0.1%醋酸中，經(jīng)0.45 μm 微孔濾膜濾過(guò)后進(jìn)行色譜分析。

色譜條件為:色譜柱為Inertsil ODS-2 C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動(dòng)相為乙腈:0.1%醋酸水溶液(50∶50，V/V)，流速1.0 mL/min，柱溫30 ℃，熒光檢測(cè)器激發(fā)波長(zhǎng)為254 nm，吸收波長(zhǎng)322 nm，進(jìn)樣量15 μL。

1.3.2 聚合物吸附性能的測(cè)定

將100.0 mg 1-脫氧野尻霉素MIP 微球放入40 mL 磨口錐形瓶中，分別加入不同濃度的DNJ 乙腈溶液，室溫振蕩吸附24 h，離心分離后，取上層清液，用柱前衍生-高效液相色譜法測(cè)定DNJ 濃度，平行三次取平均值，根據(jù)吸附前后濃度變化計(jì)算聚合物的吸附量Q(mg/g);繪制出吸附量Q 與不同濃度關(guān)系的靜態(tài)等溫吸附曲線。同時(shí)考察NIP 微球的吸附性能。

其中:Co:吸附前溶液中DNJ 的濃度(mg/mL);Ce:吸附后溶液中DNJ 的濃度(mg/mL);m:稱取的分子印跡聚合物的質(zhì)量(mg);V:DNJ 溶液的體積(mL)。

1.3.3 吸附動(dòng)力學(xué)測(cè)定

根據(jù)聚合物吸附性能測(cè)定結(jié)果，分別稱取100 mg MIP 和NIP 微球至50 mL 磨口錐形瓶中，分別加入25 mL 濃度為0.5 mg/mLDNJ 乙腈溶液，然后將其放入恒溫振蕩器中室溫振蕩。每隔20 min 取20 μL 溶液進(jìn)行色譜分析，測(cè)定溶液中DNJ 濃度，從而分析其吸附動(dòng)力學(xué)性質(zhì)。

1.4 MIP 微球的選擇性考察

為了考察MIP 微球的選擇性識(shí)別性能，選用1-脫氧野尻霉素的結(jié)構(gòu)類(lèi)似物N-甲基-1-脫氧野尻霉素作為競(jìng)爭(zhēng)底物，在濃度為5.0 mmol/L 的乙腈溶液中進(jìn)行平衡吸附實(shí)驗(yàn)，測(cè)定達(dá)到平衡時(shí)溶液中的目標(biāo)分子濃度，并計(jì)算出分離系數(shù)(KD)及1-脫氧野尻霉素與N-甲基-1-脫氧野尻霉素的分離因子(α)，其中，KD=cp/cs，cp(mmol/g)表示聚合物結(jié)合底物的濃度，cs(mmol/L)表示溶液中底物的平衡濃度，α為2 種不同底物的分離系數(shù)之比。

1.5 聚合物微球掃描電鏡分析

利用Hitachi S-4300 SEM 對(duì)聚合物微球的表面結(jié)構(gòu)和粒徑進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 DNJ 分子印跡聚合物的制備

2.1.1 溶劑的選擇

統(tǒng)一溶劑量為20 mL，溶解模板分子，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1 所示，只有乙腈和甲醇能夠溶解模板分子，結(jié)合印跡分子與功能單體之間的疏水作用，應(yīng)選擇致孔效果較好的溶劑作為致孔劑，綜合考慮使用乙腈作為溶劑更合適。

表1 1-脫氧野尻霉素溶解性實(shí)驗(yàn)Table 1 DNJ solubility experiment

2.1.2 聚合時(shí)間的考察

在固定其他反應(yīng)條件不變的前提下，通過(guò)考察聚合產(chǎn)物產(chǎn)率隨時(shí)間的變化關(guān)系，對(duì)產(chǎn)率作圖得到圖2，由圖可知，聚合物產(chǎn)率隨時(shí)間增長(zhǎng)而增大，當(dāng)時(shí)間為24 h 時(shí)，得率為85.4%，此后時(shí)間增大，產(chǎn)率隨之增大的幅度已經(jīng)很小，因此，本實(shí)驗(yàn)以24 h 的聚合時(shí)間為最佳。

圖2 時(shí)間對(duì)聚合物產(chǎn)率的影響Fig.2 The influence of reaction time on polymerization rate

2.2 MIP 與NIP 對(duì)DNJ 吸附性能的考察

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

以色譜峰面積A 對(duì)標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度C 進(jìn)行線性回歸，得回歸方程:A=317974C +9983，相關(guān)系數(shù)R=0.9982，結(jié)果表明在1～10 μg/mL 之間，線性關(guān)系良好。

2.2.2 吸附量的考察

分別考察了MIP 與NIP 對(duì)不同濃度DNJ 溶液的吸附性能，繪制出了相應(yīng)的等溫吸附曲線，吸附詳情見(jiàn)圖3。由圖可知，在0.1～0.8 mg/mL 范圍內(nèi)，吸附量與溶液濃度成正相關(guān)性，當(dāng)濃度達(dá)到一定程度，吸附量不再升高，達(dá)到飽和。而印跡聚合物的吸附量明顯大于非印跡聚合物，這是由于印跡聚合物中有預(yù)定的孔穴，孔穴中有特定排列的功能基能夠與模板分子產(chǎn)生作用，而非印跡聚合物中則沒(méi)有這種孔穴。

圖3 MIP 與NIP 對(duì)DNJ 分子的等溫吸附曲線Fig.3 Adsorption isotherm of theophylline MIP and NMIP

2.2.3 MIP 與NIP 微球的吸附動(dòng)力學(xué)

對(duì)MIP 與NIP 微球進(jìn)行吸附動(dòng)力學(xué)測(cè)定，結(jié)果如圖4。

圖4 MIP 與NIP 吸附動(dòng)力學(xué)Fig.4 Kinetics of adsorption of MIP and NIP

由圖4 可知，隨著時(shí)間增長(zhǎng)，MIP 對(duì)DNJ 的吸附量逐漸增大，當(dāng)吸附時(shí)間達(dá)到100 min，吸附接近飽和。NIP 對(duì)DNJ 吸附量不大，隨時(shí)間增長(zhǎng)，也呈增大的趨勢(shì)。

2.3 MIP 微球?qū)Φ孜锏奈竭x擇性考察

本實(shí)驗(yàn)以與1-脫氧野尻霉素結(jié)構(gòu)類(lèi)似的N-甲基-1-脫氧野尻霉素作為競(jìng)爭(zhēng)底物，在濃度為5.0 mmol/L 的乙腈溶液中進(jìn)行平衡吸附實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2 所示:

表2 MIP 微球的選擇性Table 2 Selectivity of MIP microspheres

由表2 可知，與NIP 微球相比，MIP 微球?qū)NJ具有較好的選擇性。

2.4 MIP 與NIP 掃描電鏡分析

用掃描電子顯微鏡(SEM)分別觀測(cè)兩種微球的形貌，掃描結(jié)果如圖5 所示:

圖5 MIP(左)與NIP(右)掃描電鏡圖Fig.5 The SEM photographs of MIP and NIP

由圖5 可以看出，實(shí)驗(yàn)中制備的MIP 與NIP 形態(tài)均一，除NIP 粒徑較MIP 大外，彼此間無(wú)明顯差異，這可能是由于模板分子DNJ 的存在，使得聚合物生成過(guò)程中其分子內(nèi)部結(jié)構(gòu)形成固定形狀的孔穴，從而空間排列發(fā)生了改變。

3 結(jié)論

本文采用沉淀聚合法制備了1-脫氧野尻霉素分子印跡聚合物微球，并對(duì)其制備方法進(jìn)行了初步優(yōu)化。吸附性能考察實(shí)驗(yàn)說(shuō)明，印記聚合物對(duì)DNJ分子能選擇性吸附，MIP 吸附性能較NIP 強(qiáng)。吸附選擇性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，相對(duì)于與DNJ 結(jié)構(gòu)相似的N-甲基-1-脫氧野尻霉素，本實(shí)驗(yàn)所制備的MIP 微球?qū)NJ 有較強(qiáng)的選擇結(jié)合特性。該方法簡(jiǎn)單易行，聚合物微球顆粒在1 μm 左右，為開(kāi)發(fā)天然產(chǎn)物中1-脫氧野尻霉素的分離提純新工藝提供了理論基礎(chǔ)。

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