深海來源真菌Penicillium sp.F00120 代謝產(chǎn)物的研究

田永奇 ，林秀萍 ，劉 娟，王俊峰，楊 斌，鞠志冉，陶華明，劉永宏

1中國科學(xué)院南海海洋研究所 中國科學(xué)院熱帶海洋生物資源與生態(tài)重點實驗室，廣州 510301;2中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100049;南方醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院，廣州 510515

經(jīng)過60 多年的不懈努力，海洋天然產(chǎn)物研究已經(jīng)有了長足的進步，藥學(xué)家們不斷地從海洋生物中分離出結(jié)構(gòu)新穎，活性良好的化合物，超過0.1%的化合物已作為新藥的先導(dǎo)化合物。鎮(zhèn)痛藥物Ziconotide、抗腫瘤藥物ET-743 和抗腫瘤藥物HaLichondrin B 等海洋藥物的相繼上市標志著海洋天然產(chǎn)物在新藥研發(fā)中占據(jù)了重要的位置［1］。海洋微生物與海綿、珊瑚并列成為海洋天然產(chǎn)物的三大來源［2］。由于海洋真菌具有次級代謝產(chǎn)物豐富、活性多樣和易于發(fā)酵培養(yǎng)等優(yōu)點，成為發(fā)現(xiàn)新的海洋活性天然產(chǎn)物的寶庫。迄今為止，已經(jīng)從海洋真菌的發(fā)酵產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)了1000 多個新化合物。這些代謝產(chǎn)物都表現(xiàn)出良好的抗腫瘤、抗菌、抗病毒和神經(jīng)心血管等活性［3］。

深海的高壓、低溫等極端環(huán)境賦予了深海真菌獨特的個性。深海真菌的次級代謝產(chǎn)物以結(jié)構(gòu)新穎，活性良好著稱，目前已經(jīng)成為藥學(xué)家們關(guān)注的熱點。2012年，本學(xué)科組從深海沉積物來源的真菌Penicillium sp.F00120 中分離得到了一個結(jié)構(gòu)新穎的倍半萜醌類化合物penicilliumin A［4］。該化合物具有抗腫瘤活性，是迄今為止報道的少數(shù)幾個來源于微生物的倍半萜醌類化合物之一。本文作為此工作的延續(xù)，采用高鹽培養(yǎng)基進行發(fā)酵，從Penicillium sp.F00120 的發(fā)酵產(chǎn)物中分離得到了9 個化合物，通過核磁共振、文獻對照等方法鑒定了這些化合物的結(jié)構(gòu)，其中化合物6 和7 為penicilliumin A 的同系物。

1 儀器與材料

核磁共振波譜儀:Brucker Avance DRX500 型(500/125 MHz，TMS 為內(nèi)標)。HR-ESI-MS:Bruker micro TOF-QII mass spectrometer(Bruker，F(xiàn)?llanden，Switzerland)。EYELAN-1000 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀。高效液相色譜儀:Agilent 1200(泵型號:G1212C，紫外檢測器型號:G1315D)，YMC-Pack(C8 250 × 10 mm I.D.S-5 μm，12 nm)。TLC:高效薄層層析板(HPTLC)為德國Merck 公司產(chǎn)品和煙臺江友硅膠開發(fā)有限公司產(chǎn)品。顯色劑:10%硫酸香蘭素溶液。常用有機試劑均為國產(chǎn)的分析純產(chǎn)品。

海洋真菌菌株F00120 從采自中國南海北部(Lat.22°6.017'N，Long119°17.440'E)1300 m 的海底沉積物樣品分離得到，經(jīng)形態(tài)特征和分子生物學(xué)鑒定，確定其屬于青霉屬，并命名為Penicillium sp.F00120［4］。該菌株現(xiàn)保存于中國科學(xué)院南海海洋研究所熱帶海洋生物資源與生態(tài)重點實驗室。

2 真菌發(fā)酵

將保藏于4 ℃斜面的Penicillium sp.F00120 接種到MB 固體培養(yǎng)基(麥芽浸膏1.5 g，粗海鹽1 g，瓊脂粉1.5 g，蒸餾水100 mL，pH 7.4～7.8)平板上，于25 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d。將活化后的菌株轉(zhuǎn)接到裝有10 mL MB 液體培養(yǎng)基(麥芽浸膏1.5 g，粗海鹽1 g，蒸餾水100 mL，pH 7.4～7.8，加玻璃珠)的100 mL 三角瓶中，于28 ℃、180 rpm 搖床培養(yǎng)2 d。將10 mL 種子培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接入裝有大米固體培養(yǎng)基(大米200 g，粗海鹽6 g，自來水200 mL)的1000 mL 三角瓶中，于25 ℃靜置培養(yǎng)60 d，共發(fā)酵培養(yǎng)30 瓶。

3 提取與分離

Penicillium sp.F00120 的固體發(fā)酵物用丙酮浸泡過夜，攪拌粉碎，超聲提取15 min。提取物抽濾，蒸去丙酮，水層濃縮體積，用乙酸乙酯萃取2 次，收集上清液。固體殘渣再用乙酸乙酯浸提3 次，每次浸泡過夜，抽濾，收集上清液。將5 次得到的上清液合并，減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，共得浸膏47.6 g。粗浸膏以1∶1 的比例與100～200 的硅膠H 拌勻，待干燥后填入中壓正相硅膠柱分離，石油醚-乙酸乙酯(1∶0～0∶1)梯度洗脫，TLC 薄層檢測后合并，得到8 個餾分Fra.1～8。Frs.4 經(jīng)重結(jié)晶得到化合物1 (200 mg);Frs.5 經(jīng)液相制備(CH3OH∶H2O=6∶4)得到化合物2(25 mg);Fra.7 經(jīng)Sephadex LH-20 凝膠柱(甲醇)分離，得到5 個餾分Fra.7a～Frs.7e，其中Fra.7c 經(jīng)正相硅膠柱分離，二氯甲烷-甲醇(1∶0～0∶1)洗脫，得到8 個餾分Fra.7c1～Fra.7c8。Fra.7c3 重結(jié)晶得到化合物3(27 mg)。Fra.7c5 經(jīng)正相硅膠柱分離，二氯甲烷-甲醇(1 ∶0～0 ∶1)，得到化合物4(3 mg)、5(15 mg)。Fra.7d 經(jīng)ODS 柱分離，甲醇-水(1∶9，1 ∶1，7 ∶3，9 ∶1)得到4 個餾分Fra.7d1～ Fra.7d4。Fra.7d3 經(jīng)液相制備(CH3OH∶H2O=6∶4)得到化合物6(5.3 mg)、7(4.7 mg)、8(10 mg)、9(20 mg)。

4 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1 白色針狀結(jié)晶(CH3OH)，254 nm 處有紫外吸收。1H NMR (500 MHz，CDCl3)δH:5.59(1H，brm，H-6)，5.39 (1H，brm，H-7)，5.22 (2H，m，H-22，23)，3.67 (1H，m，H-3)，1.04 (3H，d，J=6.5 Hz，H3-21)，0.97 (3H，s，H3-10)，0.93 (3H，d，J=6.5 Hz，H3-28)，0.83 (6H，t，J=7.5 Hz，H3-26，H3-27)，0.65 (3H，s，H3-18);13C NMR (125 MHz，CDCl3)δc::141.4 (C，C-8)，139.8 (C，C-5)，135.6(CH，C-21)，132.0 (CH，C-22)，119.6 (CH，C-6)，116.3 (CH，C-7)，70.5 (CH，C-3)，55.8 (CH，C-17)，54.6 (CH，C-14)，46.3 (CH，C-9)，42.8 (CH，C-13)，40.8 (CH2，C-4)，40.4 (CH，C-24)，39.1(CH2，C-12)，38.4 (CH2，C-1)，37.1 (C，C-10)，33.1 (CH，C-25)，32.0 (CH2，C-2)，28.3 (CH2，C-16)，23.0 (CH2，C-15)，21.1 (CH3，C-21)，19.9(CH3，C-26)，19.6 (CH3，C-27)，17.6 (CH3，C-28)，16.3 (CH3，C-19)，12.1 (CH3，C-18)。以上數(shù)據(jù)與文獻［5］對照，基本一致，確定化合物結(jié)構(gòu)為ergosterol。

化合物2 淡黃色油狀物，254 nm 處有紫外吸收。EI-MS:112［M］+;1H NMR (500 MHz，CD3OD)δH:5.73 (1H，m，H-3)，4.34 (2H，t，J=10 Hz，H2-6)，2.41 (2H，t，J=5 Hz，H2-5)，1.99 (3H，brs，H3-7);13C NMR (CD3OD，125 MHz)δC:167.33 (C=O，C-2)，162.10 (C，C-4)，116.63 (CH，C-3)，67.63(CH2，C-6)，30.32 (CH2，C-5)，23.11 (CH3，C-7)。以上數(shù)據(jù)與文獻［6］對照，基本一致，確定化合物結(jié)構(gòu)為4-methyl-5，6-dihydro-2-pyranone。

化合物3 白色晶體，EI-MS:500 ［M］+，高分辨給出分子式為C28H36O8;1H NMR (500 MHz，DMSO)δH:5.24 (1H，s，H-11)，4.77 (1H，d，J=4.5 Hz，H-6)，4.48 (1H，brs，H-3)，3.89 (1H，d，J=14.3，4.5 Hz，H-7β)，3.40 (3H，s，H3-28)，2.48(1H，m，H-9)，2.33 (1H，dd，J=14.3，4.5 Hz，H-7α)，1.99 (3H，s，H3-27)，1.90 (1H，brs，H-1)，1.88 (1H，brs，H-5)，1.74 (3H，s，H3-21)，1.57(1H，m，H-2)，1.28 (3H，s，H3-18)，1.12 (3H，s，H3-22)，1.02 (3H，s，H3-20)，0.89 (3H，s，H3-24)，0.78 (3H，s，H3-25);13C NMR (DMSO，125 MHz)δc:194.3 (C，C-15)，194.1 (C，C-17)，179.2 (C，C-23)，173.2 (C=O，C-19)，169.6 (C=O，C-26)，140.3 (C，C-12)，118.4 (CH，C-11)，103.5 (C，C-16)，77.9 (CH，C-6)，75.5 (CH，C-3)，70.0 (C，C-14)，54.8 (C，C-13)，53.8 (CH，C-5)，50.6 (CH，C-9)，50.2 (CH3，C-28)，43.2 (C，C-10)，41.1 (C，C-8)，36.4 (CH2，C-7)，33.8 (C，C-4)，25.8 (C，C-24)，24.2 (CH3，C-22)，22.0 (C，C-25)，21.7 (CH，C-2)，20.9 (CH3，C-21)，20.7 (CH3，C-27)，20.6(CH，C-1)，17.7 (CH3，C-20)，7.9 (CH3，C-18)。以上數(shù)據(jù)與文獻［7］對照，基本一致，確定化合物結(jié)構(gòu)為citreohybridonol。

化合物4 白色晶體，EI-MS:428 ［M］+;1H NMR (500 MHz，CDCl3)δH:5.27 (2H，m，H-22，H-23)，4.88 (1H，brd，J=6.6 Hz，H-7α)，4.31 (1H，m，H-3α)，3.37 (1H，d，J=2.5 Hz，H-6β)，2.55(1H，dd，J=13.2，11.7 Hz，H-4β)，1.28 (3H，s，H3-19)，1.07 (3H，d，J=6.6 Hz，H3-21)，0.96 (3H，s，H3-18)，0.94 (3H，d，J=6.9 Hz，H3-28)，0.85 (6H，d，J=6，8 Hz，H3-26，H3-27);13C NMR (150 MHz，CDCl3)δc:151.6 (C-14)，135.2 (C-22)，132.4(C-23)，126.8 (C-8)，68.7 (C-3)，64.9 (C-5)，63.6(C-7)，60.3 (C-6)，55.4 (C-17)，43.7(C-13)，42.9(C-24)，40.5 (C-20)，39.3 (C-9)，39.2 (C-4)，37.1 (C-12)，34.9 (C-10)，33.1 (C-25)，33.0 (C-1)，31.2 (C-2)，28.0 (C-16)，25.9 (C-15)，21.1(C-21)，20.0 (C-27)，19.7 (C-26)，19.3 (C-11)，17.9 (C-28)，17.7 (C-28)，16.9 (C-19)。以上數(shù)據(jù)與文獻［8］對照，基本一致，確定化合物結(jié)構(gòu)為5α，6α-Epoxy-(22E，24R)-ergosta-8(14)，22-diene--3β，7β-diol。

化合物5 無色油狀物，EI-MS:354 ［M］+;1H NMR (500 MHz，CDCl3)δH:5.36 (4H，m，H-9，10，12，13)，4.20 (1H，dd，J=11.5，4.5 Hz，Ha-19)，4.16 (1H，dd，J=11.5，6 Hz，Hb-19)，3.93 (1H，m，H-20)，3.70 (1H，dd，J=11.5，4.5 Hz，H-21a)，3.60 (1H，dd，J=11.5，4.5 Hz，H-21b)，2.77 (2H，t，J=6.5 Hz，H2-11)，2.35 (2H，t，J=7.5 Hz，H2-2)，2.05 (4H，m，H2-8，H2-14)，1.64 (2H，m，H2-3)，1.25～1.40 (14H，m)，0.89 (3H，t，J=6.5 Hz，H3-18);13C NMR (125 MHz，CDCl3)δC:174.3 (C=O，C-1)，130.2 (CH，C-9)，130.0 (CH，C-13)，128.1(CH，C-10)，127.9 (CH，C-9)，70.3 (CH，C-20)，65.2 (CH2，C-19)，63.3 (CH，C-21)，34.1 (CH2，C-2)，31.5 (CH2，C-16)，29.6 (CH2，C-7)，29.3(CH2，C-6)，29.1 (CH2，C-17)，29.1 (CH2，C-5)，29.1 (CH2，C-4)，27.2 (CH2，C-8)，27.2 (CH2，C-14)，25.6 (CH2，C-11)，24.9 (CH2，C-3)，22.6(CH2，C-17)，14.1 (CH3，C-18)。以上數(shù)據(jù)與文獻［9］對照，基本一致，確定化合物結(jié)構(gòu)為1-Linoleoylglycerol。

化合物6 白色固體，EI-MS:360 ［M］+;1H NMR (500 MHz，CD3OD)δH:5.91 (1H，d，J=1.6，H-2')，4.77 (1H，brs，Ha-12)，4.52 (2H，brs，Hb-12 and H-4')，4.29 (1H，d，J=17.7 Hz，H-7'a)，4.21(1H，d，J=17.7 Hz，H-7'b)，3.67 (1H，d，J=2.9 Hz，H-5')，2.33 (1H，ddd，J=12.6，3.9，2.5 Hz，H-7e)，2.31 (1H，d，J=14.0 Hz，H-11a)，1.92 (1H，td，J=12.6，3.9 Hz，H-7a)，1.81 (1H，dd，J=14.0，11.1 Hz，Hb-11)，1.76 (1H，dt，J=12.6，3.9 Hz，H-1e)，1.75 (1H，d，J=11.1 Hz，H-9)，1.72 (1H，m，H-6e)，1.60 (1H，qt，J=13.6，3.4 Hz，H-2a)，1.49(1H，dquint，J=13.6，3.4 Hz，H-2e)，1.38 (1H，dm，J=13.6 Hz，H-3e)，1.30 (1H，qd，J=12.6，3.9 Hz，H-6a)，1.21 (1H，td，J=13.6，4.6 Hz，H-3a)，1.18 (1H，td，J=13.6，3.4 Hz，H-1a)，1.12 (1H，dd，J=12.6，2.5 Hz，H-5)，0.70 (3H，s，H3-13)，0.79 (3H，s，H3-14)，0.85 (3H，s，H3-15);13C NMR(125 MHz，CD3OD)δC:195.4 (C=O，C-1')，161.2(C，C-3')，150.5 (C，C-8)，120.2 (CH，C-2')，107.4 (CH2，C-12)，64.3 (CH，C-4')，64.0 (CH2，C-7')，62.2 (CH，C-5')，59.5 (C，C-6')，55.7 (CH，C-5)，51.5 (CH，C-9)，43.3 (CH2，C-3)，40.7 (C，C-10)，40.0 (CH2，C-1)，39.3 (CH2，C-7)，34.5(C，C-4)，34.1 (CH3，C-13)，25.6 (CH2，C-6)，22.2(CH3，C-14)，22.0 (CH2，C-11)，20.4 (CH2，C-2)，15.0 (CH3，C-15)。以上數(shù)據(jù)與文獻［10］對照，基本一致，確定化合物結(jié)構(gòu)為Macrophorin。

化合物7 無定型粉末，EI-MS:418 ［M］+;1H NMR (500 MHz，CD3OD)，δH:6.12 (2H，brs，H2-2')，4.90 (1H，brs，H-12a)，4.79 (1H，brs，H-12b)，4.41 (2H，brs，H-7')，3.96 (1H，s，H-5')，3.05(1H，d，J=17.2 Hz，H-8'e)，2.91 (1H，d，J=17.2 Hz，H-8')，2.36 (1H，ddd，J=12.9，3.9，2.5 Hz，H-7b)，2.20 (1H，dd，J=14.8，4.6 Hz，H-11a)，2.11 (1H，td，J=12.9，4.8 Hz，H-7a)，1.97 (1H，m，H-11b)，1.82 (1H，m，H-9)，1.73 (1H，brd，J=12.9 Hz，H-6b)，1.72 (1H，brd，J=13.7 Hz，H-1b)，1.58 (1H，qt，J=13.7，3.4 Hz，H-2a)，1.45 (1H，qt，J=13.7，3.4 Hz，H-2b)，1.36 (1H，td，J=13.7，3.4 Hz，H-3b)，1.31 (1H，qd，J=12.9，3.9 Hz，H-6a)，1.17 (1H，dd，J=12.5，2.5 Hz，H-5)，1.14 (1H，td，J=13.7，3.4 Hz，H-3a)，1.12 (1H，td，J=13.7，3.4 Hz，H-1a)，0.84 (3H，s，H3-13)，0.78 (3H，s，H3-14)，0.70 (3H，s，H3-15);13C NMR (125 MHz，CD3OD)δc:192.3 (C=O，C-1')，167.8 (C=O，C-9')，164.5 (C，C-3')，150.1 (C，C-8)，120.4 (CH2，C-2')，108.0 (CH2，C-12)，85.2 (C，C-6')，74.7(CH，C-5')，71.8 (C，C-4')，60.7 (CH2，C-7')，56.2 (CH，C-5)，50.2 (C，C-9)，43.3 (CH2，C-8')，42.8 (CH2，C-3)，41.0 (C，C-10)，39.3 (CH2，C-1)，38.8 (CH2，C-7)，34.2 (C，C-4)，33.8 (CH3，C-13)，25.2 (CH2，C-6)，22.2 (CH2，C-11)，22.0(CH3，C-14)，19.9 (CH2，C-2)，15.1 (CH3，C-15)。以上數(shù)據(jù)與文獻［11］對照，基本一致，確定化合物結(jié)構(gòu)為purpurogemutantin。

化合物8 黃色粉末，EI-MS:218 ［M］+;1H NMR (500 MHz，CD3OD)δH:6.37 (1H，s，H-4)，6.31 (2H，s，H-5，7)，4.22 (1H，m，H-2')，4.02(1H，m，H-4')，2.62 (1H，dd，J=14.4，4.9 Hz，Hb-1')，2.55 (1H，dd，J=14.4，8.Hz，Ha-1')，1.58(1H，ddd，J=14.2，8.2，7.2 Hz，Ha-3')，1.33(1H，ddd，J=14.2，4.9，3.9 Hz，Hb-3')，1.19 (3H，d，J=6.3 Hz，CH3-5');13C NMR (125 MHz，CD3OD)δC:167.9 (C=O，C-1)，167.3 (C，C-6)，164.9 (C，C-8)，156.2 (C，C-3)，141.3 (C，C-10)，107.2 (CH，C-4)，103.7 (CH，C-5)，102.7 (CH，C-7)，99.9 (C，C-9)，67.1 (CH，C-2')，65.3 (CH，C-4')，47.0 (CH2，C-3')，43.0 (CH2，C-1')，24.4(CH3，C-5')。以上數(shù)據(jù)與文獻［12］對照，基本一致，確定化合物結(jié)構(gòu)為3-(2S，4S-dihydroxypentyl)-6，8-dihydroxyisocoumarin。

化合物 9 無色針狀結(jié)晶，EI-MS:280［M］+;1H NMR (500 MHz，CD3OD)δH:6.56 (1H，d，J=2.0 Hz，H-6)，6.53 (1H，d，J=2.0 Hz，H-8)，5.96 (1H，s，H-2)，4.10 (1H，m，H-2')，2.62(1H，dd，J=14.4，5.1 Hz，H-1')，2.62 (3H，s，H3-11)，2.55 (1H，dd，J=14.4，7.9 Hz，H-1')，1.18(1H，d，J=6.2 Hz，H-3');13C NMR (125 MHz，CD3OD)δC:182.11 (C，C-4)，167.2 (C，C-5)，163.1 (C，C-9)，161.6 (C，C-2)，143.8 (C，C-7)，118.1 (CH，C-3)，118.1 (C，C-3)，116.0 (C，C-10)，112.6 (CH，C-6)，101.8 (CH，C-8)，66.5(CH，C-2')，44.3 (CH2，C-1')，23.6 (CH3，C-11)，23.2 (CH3，C-3')。以上數(shù)據(jù)與文獻［13］對照，基本一致，確定化合物結(jié)構(gòu)為 5-hydroxy-7-(2'-hydroxypropyl)-2-methyl-chromone。

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