聯(lián)合提取鐵皮石斛中生物堿及多糖的研究

原 琳，李 嬌，榮永海，仝戰(zhàn)旗，榮 龍*

1北京航空航天大學生物與醫(yī)學工程學院，北京 100191;2 解放軍總醫(yī)院，北京 100853

鐵皮石斛(Dendrobium officinale)屬于蘭科石斛屬，是一種多年生附生草本植物。鐵皮石斛可入藥，為名貴中藥鐵皮楓斗的原植物，具有益胃生津，滋陰清熱等多種功效。現(xiàn)代藥理研究表明，鐵皮石斛具有增強免疫力、抗疲勞、抗氧化、促進消化、降血糖、降血壓等作用［1］。鐵皮石斛中含有多種化學成分，包括氨基酸、多糖、生物堿、菲類化合物等［2］。從石斛中分離得到的生物堿叫做石斛堿，為堿性的含氮有機化合物。研究表明，石斛堿為石斛的主要有效成分之一。石斛堿種類繁多，并具有多種生理活性，包括:降血壓、抗腫瘤、鎮(zhèn)靜鎮(zhèn)痛及抗菌抗瘧等。石斛堿的抗腫瘤活性已在動物實驗中得到證實，且石斛堿相較其他抗腫瘤藥具有低毒性、低成本的特點，因此生物堿的提取純化已成為近年來的一個研究熱點。此外，鐵皮石斛中還含有高達18.20 %的多糖。鐵皮石斛多糖主要具有抗氧化及增強免疫力等生理功能。同時，鐵皮石斛多糖也具有抗腫瘤的功效，可以抑制肝癌HepG2 細胞及人宮頸癌HelaS3 細胞的生長［3］。

鐵皮石斛中的生物堿和多糖均為重要的功能化合物。以往的研究［4-7］基本僅分離提取鐵皮石斛中的單一活性成分，導致鐵皮石斛原材料的極大浪費。因此，生物堿和多糖的聯(lián)合提取對于鐵皮石斛資源的綜合利用來說具有重要的現(xiàn)實意義。本研究應用了閃式提取法這一新型提取技術，具有溫和、高效、節(jié)能的優(yōu)點。本實驗室以往的研究［8-11］將其用于多種原材料活性成分的分離提取，均取得了良好的效果。本研究探討了利用閃式提取技術從鐵皮石斛中聯(lián)合提取生物堿及多糖的工藝方法，并對工藝中的酶解條件進行了優(yōu)化。

1 材料與儀器

鐵皮石斛冷凍鮮品(原料干重以原料鮮重13.78%計)，由江門市鴻豪實友生物有限公司提供。纖維素酶:北京鴻潤寶順科技有限公司，2000 U/g;木瓜蛋白酶:北京鴻潤寶順科技有限公司，980000 U/g;石斛堿標準品:中國食品藥品檢定研究院，99.8%;溴甲酚綠:天津市光復精細化工研究所，pH 值變色范圍3.8(黃綠)～5.4(藍);乙腈:J＆K，色譜純;其他試劑均為國產(chǎn)分析純試劑;水為雙蒸水。

高精度磁浮天平，BELENGINEER;閃式提取器:JHBE-50 型，河南金鼎科技發(fā)展有限公司;低速臺式離心機:TDL-5-A 型，上海安亭科學儀器廠;循環(huán)水式多用真空泵，上海知信實驗儀器技術有限公司;數(shù)顯恒溫水浴鍋，江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司;DHG-9071A 型電熱恒溫干燥箱，上海精宏實驗設備有限公司;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器:RE-52AA 型，上海亞榮生化儀器廠;紫外可見分光光度計:SP-756 型，上海光譜儀器有限公司;高效液相色譜儀:600 型，Waters;液相色譜儀:1200 系列，安捷倫科技有限公司;示差折光檢測器:Knauer。

2 實驗方法

2.1 生物堿測定

生物堿測定采用酸性染料比色法。

2.1.1 標準曲線的繪制

精密稱取石斛堿標準品1 mg，用氯仿溶解，用容量瓶定容至100 mL，以配制成10 μg/mL 的石斛堿標準品溶液。分別取標準溶液1、2、3、4、5 mL 置于分液漏斗中，用氯仿稀釋至10 mL。分別加入pH 4.5 的鄰苯二甲酸氫鉀緩沖液5 mL 及0.04%溴甲酚綠2 mL，劇烈振搖3 min，室溫下靜置30 min。將氯仿層用藥棉濾過，取續(xù)濾液5 mL，加入0.01 mol/L NaOH-乙醇溶液1 mL，搖勻。用分光光度計在620 nm 下測定其吸光度，由吸光度A 對濃度C(μg/mL)進行回歸計算，得到標準曲線方程:A=-0.0019 +0.1651C，R2=0.9992。

2.1.2 樣品的測定

精密稱取本實驗制得的生物堿樣品50 mg 置于100 mL 容量瓶中，用氯仿溶解并定容至100 mL。取10 mL 置于分液漏斗中，其余按“2.1.1 標準曲線的繪制”項下方法進行測定。

2.2 多糖測定

多糖測定采用苯酚-硫酸比色法［12］。

2.2.1 標準曲線的繪制

精密稱取葡萄糖標準品20 mg 置于100 mL 容量瓶中，加水溶解，并定容至刻度，以配置成200 μg/mL 的葡萄糖標準溶液。將此標準溶液稀釋至20、40、60、80、100、120 μg/mL，各濃度稀釋液各取1 mL 置于具塞試管中，分別加入5%苯酚溶液1 mL，震蕩混勻后立即加入濃硫酸5 mL，混勻后在100 ℃下水浴20 min，冰浴5 min。用分光光度計在488 nm 下測定顯色后溶液的吸光度，由吸光度A 對濃度C(μg/mL)進行回歸計算，得到標準曲線方程:A=-0.0046 +0.0081 C，R2=0.9992。

2.2.2 樣品的測定

精密稱取本實驗制得的多糖樣品20 mg 置于100 mL 容量瓶中，加水溶解至刻度，取1.0 mL 置于具塞試管中，其余按“2.2.1 標準曲線的繪制”項下方法進行測定。

2.3 聯(lián)合提取方法

2.3.1 生物堿的提取

稱取一定量的鐵皮石斛冷凍鮮品，剪碎，加入8倍體積無水乙醇，以3500 rpm 閃提1 min，間隔1 min，再閃提1 min。以5000 rpm，離心15 min。取沉淀，加入15 倍體積水，以4000 rpm 閃提1 min，間隔1 min，再閃提1 min。以5000 rpm，離心15 min。加水浸沒沉淀，真空抽濾，重復3～4 次，洗凈沉淀，即得到鐵皮石斛粗渣。向鐵皮石斛粗渣中加50 倍體積水，加入16 U/g 纖維素酶和19600 U/g 木瓜蛋白酶，用6 mol/L 鹽酸將pH 值調(diào)至5.5，在50 ℃下酶解2 h 后過濾。用水洗凈濾渣。取洗凈的濾渣，在真空干燥箱中干燥，之后加入氨水和6 mol/L NaOH溶液堿化。加入3 倍體積丙酮，回流5～8 h 進行脫脂。過濾，取濾渣，用三氯甲烷充分提取其中的生物堿。過濾后取濾液置于蒸發(fā)皿中，在水浴鍋上將其中的三氯甲烷蒸干。用甲醇將生物堿溶解，離心后取沉淀，待其自然干燥便得到生物堿。

2.3.2 結(jié)合多糖的提取

取第一次過濾后得到的濾液，與第二次水洗沉淀得到的洗液合并，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上蒸發(fā)濃縮至原體積的1/10。加入乙醇達80%質(zhì)量百分濃度，在-20 ℃下靜置醇沉1 h。以5000 rpm，離心15 min。取沉淀，經(jīng)無水乙醇、丙酮和乙醚三次脫水，干燥后便得到結(jié)合多糖。

2.3.3 游離多糖的提取

取第二次離心后得到的上清，與第一次水洗沉淀得到的洗液合并，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上蒸發(fā)濃縮至原體積的1/10。加入乙醇達80%質(zhì)量百分濃度，在-20 ℃下靜置醇沉1 h。以5000 rpm，離心15 min。取沉淀，經(jīng)無水乙醇、丙酮和乙醚三次脫水，干燥后便得到游離多糖。

2.4 酶解條件的優(yōu)化

2.4.1 料液比對生物堿及多糖提取率的影響

取一定量的鐵皮石斛粗渣，平均分成5 份，分別加入20、30、40、50、60、70 倍體積水，同時加入20 U/g 纖維素酶和19600 U/g 木瓜蛋白酶，用6 mol/L 鹽酸將pH 值調(diào)至5.5，在50 ℃下酶解2 h，過濾后分別測定料液比為1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60、1∶70時，濾渣中生物堿及上清中多糖的提取率。綜合分析后確定酶解的最佳料液比。

2.4.2 纖維素酶添加量對生物堿及多糖提取率的影響

取一定量的鐵皮石斛粗渣，平均分成5 份，分別加入8、16、24、32、40、48 U/g 纖維素酶，同時加入50倍體積水和19600 U/g 木瓜蛋白酶，用6 mol/L 鹽酸將pH 值調(diào)至5.5，在50 ℃下酶解2 h，過濾后分別測定纖維素酶添加量為8、16、24、32、40、48 U/g時，濾渣中生物堿及上清中多糖的提取率。綜合分析后確定酶解的最佳纖維素酶添加量。

2.4.3 木瓜蛋白酶添加量對生物堿及多糖提取率的影響

取一定量的鐵皮石斛粗渣，平均分成5 份，分別加入9800、19600、29400、39200、49000、58800 U/g木瓜蛋白酶，同時加入50 倍體積水和20 U/g 纖維素酶，用6 mol/L 鹽酸將pH 值調(diào)至5.5，在50 ℃下酶解2 h，過濾后分別測定木瓜蛋白酶添加量為9800、19600、29400、39200、49000、58800 U/g 時，濾渣中生物堿及上清中多糖的提取率。綜合分析后確定酶解的最佳木瓜蛋白酶添加量。

2.4.4 酶解時間對生物堿及多糖提取率的影響

取一定量的鐵皮石斛粗渣，平均分成5 份，分別加入50 倍體積水、20 U/g 纖維素酶和19600 U/g 木瓜蛋白酶，用6 mol/L 鹽酸將pH 值調(diào)至5.5，在50℃下分別酶解1、1.5、2、2.5、3、3.5 h，過濾后分別測定酶解時間為1、1.5、2、2.5、3、3.5 h 時，濾渣中生物堿及上清中多糖的提取率。綜合分析后確定最佳酶解時間。

2.5 產(chǎn)品得率及純度的計算方法

2.6 生物堿HPLC 檢測

2.6.1 色譜條件

色譜柱為Waters SunFireTMC18柱(4.6 mm×150 mm，5 μm);流動相為乙腈:0.1%三乙胺=40∶60;流速為1 mL/min;柱溫為室溫;檢測波長為240 nm;進樣量為20 μL。

2.6.2 石斛堿標準品檢測

準確稱取石斛堿標準品0.05 g，用乙腈溶解，定容至10 mL。用上述色譜條件進行檢測。

2.6.3 生物堿樣品檢測

準確稱取本工藝制得的生物堿樣品50 mg，用乙腈溶解，定容至10 mL。用上述色譜條件進行檢測。

2.7 多糖分子量測定

制得的多糖分子量通過凝膠滲透色譜(Gel permeation chromatography，GPC)測定，采用彭鋒［13］等人的方法。色譜條件:色譜柱為PL aquagel-OH 50柱(300 mm ×7.7 mm，Polymer Laboratories 有限公司);流速保持在0.5 mL/min;洗脫劑為含20 mmol/L NaCl 的5 mmol/L PBS 緩沖液(pH 值為7.5);柱溫為30 ℃。使用PL 支鏈淀粉(分子量分別為783、12200、100000、1600000 Da，Polymer Laboratories 有限公司)作為標準品進行校準。樣品用含20 mmol/L NaCl 的5 mmol/L PBS 緩沖液(pH 值為7.5)溶解配制。

3 結(jié)果與討論

3.1 酶解條件單因素實驗的結(jié)果

不同酶解料液比對生物堿及多糖提取率的影響如圖1(A)所示。隨著加水比例的增大，細胞吸水脹破，生物堿的提取率顯著增大，在料液比為1∶30時生物堿提取率達到最大，之后隨著加水比例的增大逐漸減小，可能原因是，加水使纖維素酶及木瓜蛋白酶被大幅度稀釋，破壞其保持穩(wěn)定所需的條件，因此，兩種酶的酶解能力均下降，無法溶解細胞壁，由于細胞壁的保護作用，防止了細胞脹破。多糖提取率起初處于較高水平，可能原因是細胞壁酶解產(chǎn)生了部分多糖，使多糖測定結(jié)果偏高。之后隨著加水比例的增大，多糖提取率逐漸減小，其原因與生物堿提取率減小相同，料液比達到1∶40 后，多糖提取率趨于穩(wěn)定。綜上，可選擇1∶30 作為最適酶解料液比，此時生物堿提取率最大，且多糖提取率也較高。

不同纖維素酶添加量對生物堿及多糖提取率的影響如圖1(B)所示。生物堿提取率隨著纖維素酶添加量的增加而增大，在纖維素酶添加量為24 U/g時，生物堿的提取率達到最大，之后趨于平緩。多糖提取率隨著纖維素酶添加量的增加顯著增大，在纖維素酶添加量達到32 U/g 時，多糖的提取率達到最大，而后稍有下降。綜上，可選擇32 U/g 作為最適纖維素酶添加量，此時多糖提取率最大，而生物堿提取率也保持在最高水平。

不同木瓜蛋白酶添加量對生物堿及多糖提取率的影響如圖1(C)所示。生物堿提取率隨著木瓜蛋白酶添加量的增加而增大，在木瓜蛋白酶添加量為19600 U/g 時，生物堿的提取率達到最大，之后趨于穩(wěn)定，增加木瓜蛋白酶添加量生物堿提取率也不再增大。多糖提取率隨著木瓜蛋白酶添加量的增加而逐漸增大，在木瓜蛋白酶添加量達到39200 U/g 之后，多糖提取率趨于穩(wěn)定，再增加木瓜蛋白酶添加量多糖提取率僅有少量增大。綜上，可選擇39200 U/g 作為最適木瓜蛋白酶添加量，此時生物堿提取率處于最高水平，而多糖提取率也處于較高水平。

不同酶解時間對生物堿及多糖提取率的影響如圖1(D)所示。生物堿提取率隨著酶解時間的增加而增大，在酶解時間延長到1.5 h 后，生物堿提取率開始趨于平緩。多糖提取率隨著木瓜蛋白酶添加量的增加而逐漸增大，在酶解時間達到2.5 h 之后，多糖提取率趨于平緩。綜上，可以選擇2.5 h 作為酶解的最適時間。在此酶解時間下，生物堿及多糖提取率均在較高水平，且可以節(jié)省工藝時間和能源，提高提取效率。

圖1 不同料液比(A)、纖維素酶添加量(B)、木瓜蛋白沒添加量(C)及酶解時間(D)對生物堿及多糖提取率的影響Fig.1 Effect of material/solvent ratio(A)，amount of cellulose added(B)，amount of papain added(C)，and hydrolysis time (D)on the extraction yields of alkaloid and polysaccharide

3.2 各成分測定結(jié)果

用最優(yōu)工藝條件所提取的各成分定量測定結(jié)果見表1。

人工種植的鐵皮石斛中總生物堿含量約為0.0190%～0.0430%，而野生一年生鐵皮石斛總生物堿含量約為0.0343%，不同品種和生長年限的鐵皮石斛生物堿含量基本在一個固定的范圍內(nèi)變動［14］。研究報道，野生鐵皮石斛中多糖含量約為20.98%～22.32%，而組織培養(yǎng)的鐵皮石斛中多糖含量約為20.65%～22.18%。本實驗所提取的生物堿質(zhì)量占原料濕重的0.01875%，同時，由表1 可知，本工藝所提取的總多糖得率為23.5%。因此，本工藝方法對鐵皮石斛中的生物堿及多糖進行了有效提取。另外，所提取的生物堿、結(jié)合多糖及游離多糖的純度分別達到了78.2%、81.3%及90.6%。綜上，本工藝成功從鐵皮石斛中聯(lián)合提取了生物堿和多糖兩種物質(zhì)，且保證了各成分的得率和純度，提高了鐵皮石斛原材料的利用率。

表1 鐵皮石斛中各成分定量測定結(jié)果Table 1 Quantitative determination of products

3.3 生物堿HPLC 檢測

石斛堿標準品及本工藝所制得的生物堿樣品的HPLC 色譜圖如圖2 所示，結(jié)果表明，樣品與標準品出峰時間基本相同，因此，本工藝所提取分離的生物堿可基本確定為石斛堿。

圖2 石斛堿標準品及鐵皮石斛生物堿樣品的HPLC 色譜圖Fig.2 HPLC chromatograms of dendrobine standard (A)and D.officinale alkaloid sample (B)

3.4 多糖分子量測定

如圖3 所示，本研究所制得的多糖經(jīng)GPC 分析，得到結(jié)合多糖及游離多糖的重均分子量分別為2373Da、17987Da。

圖3 凝膠滲透色譜測定結(jié)合多糖(A)及游離多糖(B)分子量結(jié)果Fig.3 GPC chromatograms of joint polysaccharide(A)and free polysaccharide(B)

4 結(jié)論

本研究利用閃式提取、酶解等方法成功從鐵皮石斛中聯(lián)合提取了生物堿及多糖兩種生物活性成分，對于鐵皮石斛這種珍貴中藥材的綜合利用具有重要意義。利用本研究所確定的提取方法及提取條件所得到的生物堿、多糖具有較高的提取率及純度。此工藝方法簡單高效、節(jié)約能源及試劑。綜上，本方法適于在工業(yè)化生產(chǎn)中推廣，從鐵皮石斛中的提取得到的生物堿及多糖具有廣闊的應用前景。

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