刺囊酸對(duì)于氧化型低密度脂蛋白誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮祖細(xì)胞損傷的保護(hù)作用及機(jī)制

賴 朋，劉怡欣

1西華大學(xué)生物工程學(xué)院，成都 610039;2 四川大學(xué)華西醫(yī)院老年病科，成都 610041

血管內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelial progenitor cells，EPCs)對(duì)于維持血管內(nèi)皮完整性和血管生成具有極其重要的作用。作為一種祖細(xì)胞，EPCs 為成熟血管內(nèi)皮細(xì)胞的前體細(xì)胞，具有分化能力，能通過再內(nèi)皮化(Re-endothelialization)或再血管化(Re-vascularization)發(fā)揮其保護(hù)血管內(nèi)皮的功能［1］。研究表明，骨髓中生成的EPCs 能夠延緩脈粥樣硬化(AS)的發(fā)病歷程，改善缺血灶的血液供應(yīng)［2］。因此，EPCs 被認(rèn)為是心腦血管疾病新的治療策略，包括動(dòng)冠心病、心肌梗死、缺血性卒中等［3，4］。臨床上已在小范圍開展應(yīng)用EPCs 移植治療缺血性疾病的實(shí)踐［5］。然而，有證據(jù)表明，如高血脂、高血糖等心血管危險(xiǎn)因素能減少循環(huán)中EPCs 的數(shù)量并削弱其功能［6，7］，其中oxLDL 作為獨(dú)立的心腦血管事件的危險(xiǎn)因素，在體內(nèi)和體外都能影響EPCs 的數(shù)量與功能［8，9］。因此，對(duì)抗在高濃度oxLDL 環(huán)境下所造成的EPCs 損傷將成為治療動(dòng)脈粥樣硬化等心腦血管缺血性疾病的方法之一［10］。

薔薇目，豆科落葉喬木皂莢(Gleditsia sinensis Lam.)廣泛分布于中國各地，其果實(shí)含有三萜、黃酮、低聚糖等多種類型的化合物。研究顯示皂莢具有多種生理活性［11］。近年來有報(bào)道顯示其中的三萜類化合物具有保護(hù)缺血心肌的作用［12］。此前的研究也發(fā)現(xiàn)皂莢水提物中的三萜酸(主要為刺囊酸和齊墩果酸)具有明顯的降血脂和抗AS 作用［13］。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，其中刺囊酸的降脂能力來源于其對(duì)兩種脂代謝酶:?；o酶A 膽固醇?；D(zhuǎn)移酶(ACAT)和二脂酰甘油?；D(zhuǎn)移酶(DGAT)的抑制［14］，但抗AS 的作用機(jī)制并未得到充分揭示。本研究考察了刺囊酸在體外對(duì)于oxLDL 誘導(dǎo)的EPCs損傷的保護(hù)作用，并揭示其部分作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

Agilent 1100 高效液相色譜儀，G1312A 二元泵，二極管陣列檢測(cè)器(DAD，美國Agilent 公司);IX71倒置熒光顯微鏡(日本Olympus 公司);680 酶標(biāo)儀、硝酸纖維素薄膜(美國Bio-Rad 公司);Wistar 大鼠［四川省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物專委會(huì)，許可證號(hào):SCXK(川)2013-14］;皂莢(成都中醫(yī)藥大學(xué));人纖連蛋白、異硫氰酸熒光素、荊豆凝集素、低密度脂蛋白、Wortmannin、硝基-L-精氨酸甲酯、二氨二苯吲哚、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(美國Sigma-Aldrich 公司);內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基及補(bǔ)充劑EGM-2-MV-Single Quots(美國Clonetics 公司);胎牛血清(美國Gibco 公司，批號(hào):1221109);DiI 標(biāo)記乙酰化低密度脂蛋白(美國Molecular Probes 公司);eNOS 抗體(批號(hào):sc-8904)、Ser1177 磷酸化eNOS 抗體(批號(hào):sc-3452)、Akt 抗體(批號(hào):sc-9005)、Ser473 磷酸化Akt 抗體(批號(hào):sc-2511)(美國Santa Cruz 公司);抗VEGFR-2 抗體(批號(hào):121126)、抗CD133 抗體(批號(hào):120831)(北京中杉金橋公司);辣根過氧化酶結(jié)合的IgG(武漢博士德公司，批號(hào):2012.06);TUNEL 試劑盒(美國Promega 公司);Caspase-3 活性檢測(cè)試劑盒(海門碧云天公司，批號(hào):20120128);Transwell 板(美國Corning 公司)。

1.2 刺囊酸的分離

皂莢水提物的提取方法參照文獻(xiàn)報(bào)道［13］，隨后通過柱層析分離得刺囊酸(echinocystic acid，EA)。HPLC 檢測(cè)其純度≥98%，色譜條件為:固定相，40×500 mm 反相C18硅膠柱，粒徑5 μm;流動(dòng)相，甲醇∶水=8∶2;檢測(cè)器，DAD，215 nm 處檢測(cè)出峰。結(jié)構(gòu)經(jīng)ESI-MS 和1H NMR 確認(rèn)為EA(參見圖1)。

圖1 刺囊酸的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 Chemical structure of echinocystic acid (EA)

1.3 EPCs 的分離、培養(yǎng)及鑒定

EPCs 的分離和培養(yǎng)參照以前的方法［15］。3 到4 周齡的Wistar 大鼠處死并分離股骨和脛骨骨髓，F(xiàn)icoll 密度梯度離心法(密度:1.083)提取單個(gè)核細(xì)胞并接種于人纖連蛋白涂層(FN)的培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，培養(yǎng)基使用內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基(EGM-2)并補(bǔ)加EGM-2-MV-Single Quots 和20%胎牛血清(FBS)，4 d后洗去未貼壁細(xì)胞，此后每3 d 更換新鮮培養(yǎng)基，給藥前換為無血清培養(yǎng)基休眠培養(yǎng)24 h。

貼壁的單個(gè)核細(xì)胞培養(yǎng)7 d 后用異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的荊豆凝集素(UEA-1)和DiI 標(biāo)記的乙酰化低密度脂蛋白(DiI-acLDL)進(jìn)行熒光染色。細(xì)胞先與DiI-acLDL(10 μg/mL)在37 ℃共培養(yǎng)4 h，2%的多聚甲醛固定15 min 后再與UEA-1(10 μg/mL)共培養(yǎng)1 h，倒置熒光顯微鏡觀察，雙陽性細(xì)胞鑒定為EPCs［16］。EPCs 表面表達(dá)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體2(VEGFR-2)和CD133 等標(biāo)志性抗原，通過免疫熒光染色法標(biāo)記VEGFR-2 和CD133，雙陽性可確認(rèn)EPCs。

1.4 OxLDL 的制備

參考以前方法制備oxLDL［8］。正常低密度脂蛋白(nLDL)37 ℃下與CuSO4(10 μM)共培養(yǎng)24 h，用含NaCl(150 mM)、乙二胺四乙酸(1 mM)、多粘菌素(100 μg/mL)的無菌溶液透析過夜。制備的ox-LDL 可用測(cè)定硫代巴比妥酸反應(yīng)產(chǎn)物的含量及瓊脂糖凝膠電泳的方法驗(yàn)證。

1.5 EPCs 的處理

單個(gè)核細(xì)胞培養(yǎng)7 d 后，胰酶消化后收集制成細(xì)胞懸液并計(jì)數(shù)，等細(xì)胞數(shù)接種于24 孔板并分為4組:正常組(Control，培養(yǎng)基+0.1%DMSO)、模型組(Model，培 養(yǎng) 基+100 μg/mL oxLDL)、高 劑 組(HEA，培養(yǎng)基+100 μg/mL oxLDL+20 μM EA)、低劑組(LEA，培養(yǎng)基+100 μg/mL oxLDL+5 μM EA)。另外，為研究PI3K/Akt/eNOS 信號(hào)通路在EA 作用中的作用，再設(shè)置兩組藥理抑制組:PI3K 抑制組(Wort，高劑組+100 nM Wortmannin 預(yù)處理)和eNOS 抑制組(L-NAME，高劑組+100nM l-NAME 預(yù)處理)。Wortmannin 為PI3K 抑制劑，硝基-L-精氨酸甲酯(L-NAME)為eNOS 抑制劑。

1.6 凋亡檢測(cè)

采用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)dUTP 缺口末端標(biāo)記(TUNEL)測(cè)定法和Caspase-3 活性檢測(cè)法測(cè)定oxLDL 誘導(dǎo)的EPCs 凋亡。按TUNEL 試劑盒說明書操作，EPCs 用二氨二苯吲哚(DAPI)反染。TUNEL 染色陽性細(xì)胞為凋亡細(xì)胞，以盲法計(jì)數(shù)并計(jì)算陽性率(凋亡率)。Caspase-3 活性檢測(cè)試劑盒同樣按說明書操作，最后使用酶標(biāo)儀在405 nm 處檢測(cè)對(duì)硝基苯胺的量，計(jì)算Caspase-3 活性。

1.7 細(xì)胞粘附測(cè)定

經(jīng)過相應(yīng)處理之后的EPCs 用DiI-acLDL 染色(方法見1.2)，消化、離心之后重懸于含0.5%FBS的EGM-2 培養(yǎng)基，計(jì)數(shù)后等量接種于FN 涂層的24孔板，37 ℃培養(yǎng)60 min 后輕輕洗去未貼壁細(xì)胞。倒置熒光顯微鏡200 倍視野下，每孔隨機(jī)選取6 個(gè)視野盲法計(jì)數(shù)貼壁細(xì)胞并計(jì)算平均貼壁細(xì)胞數(shù)。

1.8 細(xì)胞遷移測(cè)定

單個(gè)核細(xì)胞培養(yǎng)7 d 后，無添加的EGM-2 培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h 后進(jìn)行Transwell 小室實(shí)驗(yàn)。5 × 104個(gè)細(xì)胞重懸于100 μL 趨化緩沖液中，接種于8.0 μm 微孔的Transwell 上室，下室加入含100 ng/mL VEGF 的600 μL 趨化緩沖液，37 ℃下在5%CO2中培養(yǎng)8 h，用棉簽從上表面擦去未遷移細(xì)胞，0.1%結(jié)晶紫染色下室遷移細(xì)胞。在光鏡下每孔選取10 個(gè)隨機(jī)視野計(jì)數(shù)遷移細(xì)胞，并計(jì)算遷移率(對(duì)比總細(xì)胞數(shù))。

1.9 NO 產(chǎn)量測(cè)定

EPCs 的NO 產(chǎn)量可通過相應(yīng)試劑盒測(cè)定。EPCs 產(chǎn)生的NO 轉(zhuǎn)化為亞硝酸鹽和硝酸鹽，后者又被還原為前者，總亞硝酸鹽用Griess 試劑通過測(cè)定550 nm 處的吸光度定量。

1.10 相關(guān)蛋白表達(dá)測(cè)定

為揭示EA 的作用機(jī)制，采用Western blot 對(duì)細(xì)胞Akt/eNOS 蛋白及其磷酸化形式進(jìn)行了測(cè)定。Triton X-100 緩沖液中裂解EPCs 1 h，離心除去細(xì)胞核及碎片，蛋白由SDS-PAGE 分離并印記于硝酸纖維素薄膜上，Tris 緩沖液中以脫脂牛奶封閉薄膜并清洗，加入特異性抗體［eNOS 抗體(1 ∶2500)、Ser1177 磷 酸 化eNOS 抗 體(1 ∶500)、Akt 抗 體(1∶1000)、Ser473 磷酸化Akt 抗體(1∶500)］4 ℃孵育過夜，加入辣根過氧化酶結(jié)合的IgG(1∶40000)室溫孵育1 h，增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光發(fā)顯示印記并分析結(jié)果。

1.11 統(tǒng)計(jì)方法

2 結(jié)果與討論

2.1 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 EPCs 的鑒定

單個(gè)核細(xì)胞經(jīng)過7 d 的培養(yǎng)分化形成紡錘形外觀(早期EPCs 的形態(tài))，約90%以上的貼壁細(xì)胞在DiI-acLDL 攝取和UEA-1 結(jié)合實(shí)驗(yàn)中呈雙陽性(參見圖2A、B 和C)。免疫熒光染色的結(jié)果顯示CD133 +和VEGFR-2 +細(xì)胞占了細(xì)胞總數(shù)的絕大部分(參見圖2D)，這進(jìn)一步確定了這些細(xì)胞正是EPCs。

圖2 200 倍熒光顯微鏡下EPCs 的鑒定。A、B、C 分別代表DiI-acLDL 攝取陽性細(xì)胞、FITC-UEA-l 結(jié)合陽性細(xì)胞及雙陽性細(xì)胞;D 為分化培養(yǎng)7 天后的單個(gè)核細(xì)胞進(jìn)一步進(jìn)行免疫熒光染色的情況，同樣，VEGFR2 和CD133 雙陽性鑒定為EPCs;圖中顯示早期EPCs 為紡錘形而晚期EPCs 為卵石型。A、B、C 中白色橫條代表50 μm，D 中代表20 μm。Fig.2 Characterisation of bone marrow-derived endothelial progenitor cells (EPCs)at ×200 magnification.(A)Red fluorescence represents cells positive for DiI-acLDL uptaking.(B)Green fluorescence represents cells positive for FITC-UEA-l binding.(C)Yellow fluorescence represents differentiated endothelial progenitor cell-like adherent cells that were double-positive for uptake of DiI-acLDL and binding with FITC-UEA-l.(D)The cultured mononuclear cells were further characterized by immunofluorescent staining using the EPC-specific markers，VEGFR-2 and CD133，and the nuclear marker DAPI.The cells further differentiated to cobblestone-like late EPCs.Bars in A，B，and C=50 μm.Bars in D=20 μm

2.1.2 EA 抑制oxLDL 誘導(dǎo)的EPCs 凋亡

如圖3A-F 所示，TUNEL 染色與DAPI 復(fù)染使凋亡細(xì)胞呈現(xiàn)出綠色，而TUNEL 陰性的活細(xì)胞為藍(lán)色。在模型組中，oxLDL 陽性細(xì)胞對(duì)比正常組大大增加(模型組:35.2 ±6.4%，正常組:6.4 ±2.0%;P＜0.05);而EA 明顯降低了TUNEL 陽性細(xì)胞的比例(高劑組:14.7 ±5.3%，低劑組:22.9 ±7.2%;對(duì)比模型組P＜0.05)，而且此效果呈現(xiàn)出劑量依賴性;經(jīng)過藥理抑制劑Wortmannin 或L-NAME 預(yù)處理后，凋亡細(xì)胞的數(shù)量對(duì)比EA 高劑組明顯上升(PI3K抑制組:30.3 ±6.9%，eNOS 抑制組:28.1 ±5.8%，對(duì)比高劑組P＜0.05;參見圖3G)。Caspase-3 作為細(xì)胞凋亡通路中的關(guān)鍵蛋白，其活性在模型組中明顯升高(模型組:670 ±89%，正常組:100% ±13%;P＜0.05;參見圖3H);EA 存在下，Caspase-3 活性收到明顯的劑量依賴性的抑制(高劑組:224 ±70%，低劑組:339 ±59%;對(duì)比模型組P＜0.05);同樣，Wortmannin 和l-NAME 使Caspase-3 活性再次上升(PI3K 抑制組:405 ± 44%，eNOS 抑制組:619 ±107%，對(duì)比高劑組P＜0.05)。

2.1.3 EA 改善EPCs 粘附及遷移功能

EPCs 的粘附能力對(duì)于其附著于內(nèi)皮和細(xì)胞外基質(zhì)，形成新生血管極其重要。本研究中，oxLDL 顯然明顯削弱了EPCs 的粘附能力(模型組:14 ±1，正常組:24 ±3;P＜0.05;參見圖4A-F);EA 部分恢復(fù)了EPCs 的正常粘附功能(高劑組:20 ±2，低劑組:17 ±2;對(duì)比模型組P＜0.05);而兩個(gè)抑制劑顯著抵消了EA 的作用(PI3K 抑制組:13 ±3，eNOS 抑制組:15 ±2，對(duì)比高劑組P＜0.05，參見圖4G)。

遷移能力對(duì)于EPCs 發(fā)揮功能同樣重要，Transwell 小室測(cè)試的結(jié)果如預(yù)計(jì)的一樣(參見圖5A、C、D)，模型組遷移率遠(yuǎn)低于正常組(6.6 ± 0.9 對(duì)11.0 ± 1.4%);高劑量的EA 明顯改善了這種情況(高劑組:10.2 ± 2.0%;對(duì)比模型組P＜0.05)，而低劑未見明顯效果(低劑:8.0 ± 2.4%;對(duì)比模型P ＞0.05);Wortmannin 和L-NAME 顯著抑制了高劑EA 對(duì)于EPCs 遷移能力的恢復(fù)(PI3K 抑制組:6.9± 2.2%，eNOS 抑制組:7.4 ± 1.6%，對(duì)比高劑組P＜0.05)。

圖3 A 到F 為TUNEL 凋亡檢測(cè)結(jié)果圖(依次為正常組、模型組、高劑組、低劑組、PI3K 抑制組和eNOS 抑制組)，說明了EA抑制EPCs 凋亡的作用，白色箭頭代表陽性即凋亡細(xì)胞;G 為各組的TUNEL 檢測(cè)陽性率統(tǒng)計(jì);H 為Caspase-3 活性統(tǒng)計(jì)圖。A 到F 中白色橫條代表25 μm;G、H 中* 代表相對(duì)于正常組P＜0.05;#代表相對(duì)于模型組P＜0.05;§代表相對(duì)于高劑組P＜0.05。Fig.3 A representation illustrating TUNEL-positive EPCs (A-F).White arrows show dual staining of EPCs (apoptosis).TUNELpositive EPCs were examined and counted in a blinded manner，and the percentage of apoptotic cells was calculated (G).Caspase-3 activity was measured by a caspase-3 activity assay kit，as described under Materials and methods (H).Data are shown as mean±SD (n=6).* P＜0.05 versus Control;#P＜0.05 versus Model;§ P＜0.05 versus High-dose (G and H).The Bar=25 μm

圖4 A 到F 表示各組EPCs 的粘附能力(依次為正常組、模型組、高劑組、低劑組、PI3K 抑制組和eNOS 抑制組)。紅色為DiI-acLDL 標(biāo)記的粘附于FN 涂層培養(yǎng)板上的EPCs，其中白色橫條代表50 μm。G 為200 倍視野下粘附細(xì)胞數(shù)的統(tǒng)計(jì)圖，每組隨機(jī)取6 個(gè)視野做統(tǒng)計(jì)，其中* 代表相對(duì)于正常組P＜0.05;#代表相對(duì)于模型組P＜0.05;§代表相對(duì)于高劑組P＜0.05。Fig.4 Effects of EA on endothelial progenitor cell (EPC)adhesion.Identical numbers of cells were re-plated onto FN-coated culture plates.After removal of non-adherent cells，the adherent cells were counted.Data are shown as mean±SD (n=6).* P＜0.05 versus Control;#P＜0.05 versus Model;§ P＜0.05 versus High-dose (G).The Bar=50 μm

2.1.4 EA 增加EPCs 一氧化氮的產(chǎn)量

作為eNOS 的產(chǎn)物，NO 在心腦血管系統(tǒng)有廣泛的活性，對(duì)于EPCs 也有重要的影響［9］。oxLDL 大大降低EPCs 中NO 的產(chǎn)量(模型組:7.97 ±1.56 μM，正常組:18.37 ±2.52 μM;P＜0.05);EA 在這方面也發(fā)揮了較好的作用(高劑組:19.28 ±3.27 μM，低劑組:10.6 ±0.84;對(duì)比模型組P＜0.05);但是，隨著對(duì)PI3K/Akt/eNOS 通路的抑制，NO 的產(chǎn)量再次降低(PI3K 抑制組:11.09 ±2.31 μM，eNOS 抑制組:8.23 ±0.9 μM，對(duì)比高劑組P＜0.05;參見圖5B)。

2.1.5 EA 對(duì)激活A(yù)kt/eNOS 通路

鑒于PI3K/Akt/eNOS 信號(hào)通路在EPCs 存活、功能中的關(guān)鍵性作用，假設(shè)EA 將對(duì)此條通路具有調(diào)節(jié)作用并通過免疫印跡法進(jìn)行了驗(yàn)證(參見圖6)。本研究設(shè)定正常組磷酸化Akt(p-Akt)或磷酸化eNOS(p-eNOS)蛋白水平為100%。結(jié)果發(fā)現(xiàn)ox-LDL 并未使Akt 的表達(dá)量減少，但卻顯著抑制了Akt的磷酸化激活(模型組:47 ±5%;對(duì)比正常組P＜0.05);而模型組的eNOS 表達(dá)受到明顯抑制(模型組eNOS:39 ±6%，對(duì)比正常組P＜0.05);EA 顯著增加了Akt 的磷酸化(高劑組p-Akt:76 ±6%，低劑組p-Akt:55 ± 3%;對(duì)比模型組P＜0.05);然而，EA并不能恢復(fù)oxLDL 造成的eNOS 表達(dá)下降，卻劑量依賴性的提高了p-eNOS 與eNOS 的比例，激活了eNOS(高劑組p-eNOS/eNOS:1.33 ±0.15，低劑組peNOS/eNOS:1.07 ±0.3;對(duì)比模型組0.82 ±0.05;P＜0.05);Wormannin 作為信號(hào)通路上游的PI3K 抑制劑造成p-Akt 的下調(diào)而對(duì)p-eNOS/eNOS 沒有太大的影響(PI3K 抑制組p-Akt:49 ±6%;PI3K 抑制組p-eNOS/eNOS:對(duì)比高劑組P＜0.05)。L-NAME作為eNOS 的直接抑制劑對(duì)蛋白表達(dá)并沒有明顯影響［17］。

2.2 討論

總結(jié)本研究的結(jié)果可以得到兩個(gè)主要發(fā)現(xiàn):首先是確定了刺囊酸確實(shí)具有獨(dú)立于降脂作用之外的抗AS 機(jī)制。之前的體內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)皂莢水提物(含80%的EA)能顯著降低高脂飼料喂養(yǎng)的家兔的血脂，包括甘油三酯及總膽固醇，另外也觀察到治療組斑塊面積的大幅度縮小，這證實(shí)EA 具有抗AS 能力，但這是否完全來自于其降血脂作用并未得到揭示［13］。其次，本研究證實(shí)了最初的設(shè)想，即EPCs 是EA 的作用靶點(diǎn)，而且EA 通過對(duì)PI3K/Akt/eNOS 信號(hào)通路的激活發(fā)揮保護(hù)EPCs 的作用，尤其是在高濃度oxLDL 存在的情況下。EPCs 在防止斑塊形成，改善AS 造成的組織缺血方面發(fā)揮出重要的作用［18］，但高脂血癥或糖尿病狀態(tài)下oxLDL 增加將損傷EPCs 的數(shù)量與功能，加速AS 的發(fā)病過程［19，20］。本研究通過體外模擬高oxLDL 環(huán)境所造成的EPCs損傷模型，證實(shí)了EA 對(duì)EPCs 的保護(hù)作用起碼是其抗AS 能力的機(jī)制之一。另外，本研究還證明PI3K/Akt/eNOS 信號(hào)通路在此過程中發(fā)揮重要作用，其中Akt 和eNOS 更是調(diào)節(jié)EPCs 存活與功能的關(guān)鍵分子［20-23］。因此，本研究特地考察了細(xì)胞中Akt 與eNOS 在oxLDL 環(huán)境中和加入EA 后的狀態(tài)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)oxLDL 抑制了這兩種蛋白的磷酸化激活，從而促進(jìn)了EPCs 的凋亡和功能紊亂，而EA 雖然對(duì)Akt 與eNOS 的表達(dá)量沒有影響，但卻增加了磷酸化。藥理抑制組的結(jié)果也從側(cè)面印證了PI3K/Akt/eNOS 通路對(duì)于EA 發(fā)揮作用的重要性?？傊?，這些機(jī)制研究結(jié)果與細(xì)胞數(shù)量及功能的指標(biāo)結(jié)果一致，表明了對(duì)于Akt 和eNOS 磷酸化的調(diào)節(jié)可能是EA 的主要作用機(jī)制。

本研究的結(jié)果還表明EA 的作用具有劑量依賴性，然而，預(yù)實(shí)驗(yàn)卻表明劑量在20 μM 以上時(shí)這種依賴性變得并不明顯，而且更高劑量的EA (＞80 μM)甚至?xí)T導(dǎo)EPCs 的凋亡。因此，根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，實(shí)驗(yàn)設(shè)置了20 μM 和5 μM 的高、低劑量組。雖然包括EA 及齊墩果酸在內(nèi)的三萜酸具有細(xì)胞毒活性［24，25］，但在體內(nèi)試驗(yàn)中，起碼在藥效劑量水平上卻未見明顯毒性反應(yīng)，而且血清轉(zhuǎn)氨酶水平也遠(yuǎn)低于阿托伐他汀對(duì)照組?？傊?，通過更為深入的藥效及毒理研究，刺囊酸有望成為新的抗缺血藥物或先導(dǎo)化合物。

3 結(jié)論

研究結(jié)果表明，oxLDL 在體外誘導(dǎo)EPC 的凋亡，并且顯著降低細(xì)胞粘附、遷移和合成NO 的能力，考慮到EPC 在體內(nèi)發(fā)揮內(nèi)皮修復(fù)、血管發(fā)生等重要作用，oxLDL 對(duì)細(xì)胞數(shù)量及功能的損傷是其引起并加速動(dòng)脈粥樣硬化形成的重要機(jī)制之一。刺囊酸能夠減輕oxLDL 對(duì)EPC 的損傷，包括抑制細(xì)胞凋亡，部分恢復(fù)細(xì)胞粘附、遷移、NO 合成等功能。本研究還探索了刺囊酸的作用機(jī)制，結(jié)果表明oxLDL抑制Akt 及eNOS 的磷酸化，而刺囊酸有效對(duì)抗了oxLDL 的作用，藥理對(duì)照組的結(jié)果證實(shí)了激活A(yù)kt/eNOS 通路的確是刺囊酸的主要作用機(jī)制。結(jié)合之前的體內(nèi)研究中，刺囊酸可能通過降血脂和維持EPC 數(shù)量及功能的方式發(fā)揮抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用。由于在較高劑量表現(xiàn)出的細(xì)胞毒的作用，刺囊酸作為藥物應(yīng)用還需要更加深入的研究工作。

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