白酒中含氮類化合物定性分析方法

王 莉 ， 雷良波 ， 吳建霞 ， 徐 巖

（1.貴州茅臺酒股份有限公司，貴州 仁懷 564501；2.江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫 214122；3.江南大學工業(yè)生物技術教育部重點實驗室，江蘇 無錫214122）

吡嗪類化合物是白酒中一類重要的含氮類風味化合物，該類化合物風味閾值低，具有堅果香和焙烤香等怡人風味[1-4]，并對其它香味物質(zhì)有明顯的烘托疊加作用[5-6]。目前國內(nèi)外對酒中吡嗪類化合物的分離方法有液液萃取、真空濃縮后液液萃取、吹掃捕集、固相萃取、離子交換和CO2超臨界萃取等[7-12]。Wobben[13]等用減壓蒸餾法除去酒中大部分乙醇和水，而后用CH2Cl2萃取，GC-MS分離和鑒定朗姆酒和威士忌酒中的吡嗪類化合物；Liebich[14]采用乙醚-戊烷混合溶劑抽提，再以10%HCl萃取分離，用GC-MS鑒定出朗姆酒中7種吡嗪類化合物；山東大學陸懋蓀[15]利用陽離子樹脂富集白酒中的含氮化合物，共檢出12種吡嗪類化合物；余曉[16]等采用酸化萃取法對白酒中的含氮化合物進行研究分析，得出36種含氮化合物，其中27種吡嗪類化合物；徐占成[17]等采用液液萃取結合正相色譜分離技術應用全二維氣相色譜-飛行氣質(zhì)聯(lián)用儀 （GC×GC-TOFMS）檢出劍南春酒32種吡嗪類化合物。

作者旨在探索一套更優(yōu)的白酒中含氮類化合物的分析方法，深入分析茅臺酒中含氮類化合物尤其是吡嗪類化合物，以更好地剖析茅臺酒獨特的風味特征。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 主要儀器 氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀（GC7890A-5975C MSD）：色譜柱 DB-Wax （30 m×250.00 μm × 0.25 μm）， 美國安捷倫科技公司；R-200型旋轉蒸發(fā)儀：瑞士BüCHI公司；DC-12型氮吹儀：上海安譜科學儀器有限公司。

1.1.2 主要試劑及樣品 53%（V/V）貴州茅臺酒：貴州茅臺酒股份有限公司；NaCl（分析純）、H2SO4（分析純）、NaOH（分析純）、無水乙醇（分析純）、無水乙醚（分析純）：購自上海國藥集團；標準品：購自美國Sigma公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 白酒樣品預處理方法 取200 mL酒樣，用2 mol/L的硫酸調(diào)整酒樣酸度至 [H+]=1 mol/L后減壓蒸餾至30 mL，轉移至250 mL分液漏斗中，用50 mL重蒸乙醚萃取濃縮液，收集水相，用10%濃度的NaOH溶液調(diào)pH 13，靜置冷卻，無水乙醇調(diào)整酒精體積分數(shù)，適量NaCl過飽和，100 mL重蒸乙醚萃取上述溶液，收集有機相，用80 mL煮沸后冷卻的去離子水洗滌萃取液，收集有機相，加入適量的無水Na2SO4干燥過夜后，N2吹濃縮至0.1 mL，GC-MS分析。

1.2.2 GC-MS分析條件 進樣口溫度為230℃，載氣為He，流速1.3 mL/min；分流比5∶1，進樣量1 μL。程序升溫：起始溫度50℃，保持2 min，然后以6℃/min的升溫速率升溫到230℃，保留20 min。

離子源溫度230℃，四極桿溫度150℃，接口溫度280℃，EI源70 eV，scan方式掃描，質(zhì)量范圍30～550 Amu，溶劑延遲 5.00 min。

1.2.3 檢出物質(zhì)的定性 目標組分經(jīng)NIST 08L Database（Agilent Technologies Inc.）標準譜庫檢索、標準品對比以及參考文獻對比進行定性。

2 結果與討論

2.1 白酒中吡嗪類化合物分析方法的優(yōu)化

吡嗪類化合物是含有兩個氮原子的堿性化合物，如：吡嗪的 pKa=0.65，2，5-DMP 的 pKa=1.85，這說明如果要從基質(zhì)中萃取出更多的吡嗪類化合物，需要更低的pH值[18]。余曉等人曾報道將酒樣調(diào)酸使[H+]=1 mol/L時，有90%的吡嗪類化合物成鹽[16]。

作者比較了調(diào)整不同pH值后吡嗪類物質(zhì)的萃取效率，綜合考慮調(diào)酸對提取效率的影響及方法的可操作性，確定了用2 mol/L硫酸將酒樣調(diào)酸至[H+]=1 mol/L的調(diào)酸方案。同時在方法優(yōu)化的過程中考察了調(diào)酸、旋轉蒸發(fā)濃縮及萃取流程單元的先后順序，確定了酒樣調(diào)酸、旋轉蒸發(fā)濃縮、萃取的酒樣預處理流程。

應用上述優(yōu)化流程分析白酒樣品，在分析過程中發(fā)現(xiàn)：白酒中大多數(shù)含氮類化合物的含量相對較小，易被種類繁多且含量較高的多元醇和酯類化合物掩蓋，難以被檢出定性。因此，如何去除多元醇和酯類化合物的干擾，是能否有效定性白酒中含氮類化合物的關鍵，見圖1。作者以白酒中風味成分最為復雜的茅臺酒為分析對象，對白酒中吡嗪及含氮類化合物提取方法進一步優(yōu)化探索。

圖1 未除多元醇和酯類化合物的茅臺酒提取液的GC-MS總離子流圖Fig.1 GC-MS TIC of moutai liquor extract without removing the esters and polyhydric alcohol

根據(jù)相似相溶原理，樣品預處理時，在旋轉蒸發(fā)回調(diào)pH至堿性后，引入適當回調(diào)乙醇濃度和水洗萃取相的提取純化步驟，達到去除多元醇類化合物的目的。結果證明，上述步驟的引入能有效的去除多元醇類物質(zhì)（如2，3-丁二醇等），含氮類化合物如：Pyrazine，3-butyl-2，5-dimethyl-、2-Isoamyl-6-methylpyrazine-等得以有效檢出定性，見圖2。

圖2 除去多元醇和未除酯類化合物的茅臺酒提取液的GC-MS總離子流圖Fig.2 GC-MS TIC of moutai liquor extract by removing the esters

去除了酒樣中多元醇類物質(zhì)的干擾后，發(fā)現(xiàn)酯類物質(zhì)的存在仍會遮蓋部分目標提取物，進一步優(yōu)化提取方案，在旋轉蒸發(fā)濃縮后增加乙醚萃取去除酯類物質(zhì)的步驟，再進行回調(diào)pH值等以下操作流程，提取結果見圖3。在引入乙醚提取除酯步驟的基礎上，再進行回調(diào)乙醇濃度、水洗除醇，可去除多元醇和酯類化合物的干擾，有效地降低了GC-MS總離子流圖的基線，有利于 Pyrazine，2-ethyl-，6-methyl-、Pyrazine，trimethyl-等吡嗪類化合物的定性分析。

圖3 除多元醇和酯類化合物的茅臺酒提取液的GC-MS總離子流圖Fig.3 GC-MS TIC of moutai liquor extract by removing the esters and rolyhydric alcohol

通過上述方法優(yōu)化，確定了白酒中吡嗪類化合物分析的最佳提取流程：1）酒樣調(diào)酸 （2 mol/L H2SO4）調(diào)酸度至[H+]=1 mol/L強度；2）旋轉蒸發(fā)濃縮；3） 乙醚萃取除酯；4） 收集水相回調(diào) pH；5） 調(diào)整提取液乙醇濃度；6）乙醚萃?。?）收集有機相后水洗除多元醇；8）干燥后氮吹濃縮。

2.2 茅臺酒中吡嗪類及其他含氮類化合物定性結果

根據(jù)最優(yōu)的白酒中吡嗪類及其它含氮類化合物定性分析方法制備茅臺酒提取液，按照1.2.2的儀器分析條件進行GC-MS鑒定分析，通過對檢出物的定性分析，共定性了35種吡嗪類化合物，分析結果較文獻報道的白酒中吡嗪類化合物種類和數(shù)量均有增加，分析結果見圖4及表1。除此之外，還有包括吡啶類、噻唑類、噻吩類、喹啉類等21種其它含氮類化合物被檢出。

圖4 茅臺酒含氮類化合物定性分析總離子流圖Fig.4 GC-MS TIC of nitrogenous compounds in Moutai Liquor

表1 GC-MS鑒定出的茅臺酒中的吡嗪類化合物Table 1 Identification of pyrazines in moutai liquor by GC-MS

續(xù)表1

3 結語

作者在充分分析酒體風味物質(zhì)組成并了解各類風味化合物性質(zhì)的基礎上，將白酒提取步驟的各個提取單元有機串聯(lián)整合，并巧妙的引入除酯和除多元醇的提取純化步驟，有效的提高了分析儀器對吡嗪類及含氮類化合物的檢出率，形成了一套適用于白酒中吡嗪類化合物及其他含氮類化合物的有效定性分析方法。應用該方法共定性了茅臺酒中56種含氮化合物，其中35種吡嗪類化合物、21種其它含氮類化合物，定性的結果較前人文獻報道的茅臺酒中的含氮類物質(zhì)的種類、數(shù)量上均有所增加。本方法操作簡單、易行，不需要特殊的儀器設備，為白酒中吡嗪及含氮類化合物的分析提供了新方法，為白酒風味物質(zhì)分析提供了新思路。

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