固定化Pseudomonas putida CGMCC3830轉(zhuǎn)化3-氰基吡啶制備煙酸

李 恒， 趙 欣， 楊 濤， 龔勁松， 朱小燕，熊 雷， 陸震鳴， 許正宏， 史勁松

（江南大學(xué) 藥學(xué)院，江蘇 無錫 214122）

煙酸是一種重要的醫(yī)藥中間體，廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、材料、日化、食品等行業(yè)[1]。煙酸的生產(chǎn)工藝主要采用氨氧化法、硝酸氧化法等化學(xué)合成法[2]。傳統(tǒng)化學(xué)法生產(chǎn)煙酸存在反應(yīng)條件苛刻、環(huán)境污染大、副產(chǎn)物多等缺點。隨著綠色化學(xué)的發(fā)展，采用生物催化法制備煙酸受到越來越廣泛的重視。

腈水解酶在羧酸的生物法合成方面一直是研究的熱點[3]。目前，一系列具有腈水解酶活性的微生物被發(fā)掘和報道，如 Pseudomonas putida[4]，Bacillus subtilis[5]，Aspergillus niger[6]，Gibberella intermedia[7]等。利用酶法轉(zhuǎn)化腈類化合物主要有純酶及全細(xì)胞催化兩種形式。與純酶催化體系相比，全細(xì)胞催化具有穩(wěn)定性高、轉(zhuǎn)化成本低廉等優(yōu)勢[8]。而細(xì)胞固定化更進(jìn)一步提高了生物催化劑的價值和效率。固定化細(xì)胞有利于產(chǎn)物的批量分離與提取，同時能夠最大程度上保留酶的活性，增加細(xì)胞對底物的耐受性[9]，從而達(dá)到重復(fù)利用的目的[10]。固定化方法主要包括包埋法、交聯(lián)法、吸附法和共價結(jié)合法，其中，包埋法具有溫和的固定化條件以及良好的生物相容性。海藻酸鈉、瓊脂、卡拉膠、聚丙烯酰胺等均是常用的固定化材料[11]。由海藻酸鈉與氯化鈣交聯(lián)生成的海藻酸鈣凝膠成型快，酶活損失少，制備簡單，是包埋法制備固定化細(xì)胞的首選材料。

作者所在研究室前期篩選獲得了一株含有較高腈水解酶活性的P.putida CGMCC3830[12]，該菌在3-氰基吡啶、4-氰基吡啶生物催化合成煙酸和異煙酸的反應(yīng)中表現(xiàn)出很高的轉(zhuǎn)化效率。作者利用海藻酸鈉固定Pseudomonas putida CGMCC3830，通過固定化及轉(zhuǎn)化條件的優(yōu)化，確定固定化P.putida CGMCC3830轉(zhuǎn)化3-氰基吡啶合成煙酸的方法。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 菌種 P.putida，作者所在實驗室篩選獲得，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號CGMCC 3830。

1.1.2 主要試劑和設(shè)備 3-氰基吡啶、煙酸：分析純，Sigma公司；海藻酸鈉、殼聚糖、氯化鈣、甘油、尿素、亞硝基氰化鈉等主要試劑：均為國產(chǎn)分析純試劑。THZC型恒溫振蕩器：太倉市實驗設(shè)備廠；電子天平：上海鵬順科學(xué)儀器有限公司；Multitron培養(yǎng)振蕩器：瑞士INFORS HT；日立微量高速離心機(jī)CF15RXII：日本日立公司。

1.1.3 培養(yǎng)基 種子培養(yǎng)基組分（g/dL）：甘油1，胰蛋白胨1，酵母粉0.5，氯化鈉0.1，磷酸二氫鉀0.1，磷酸氫二鉀0.1。

發(fā)酵培養(yǎng)基在種子培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上增加尿素0.1 g/dL，調(diào)節(jié)pH 6.0。上述培養(yǎng)基均在121℃滅菌20 min。

1.2 方法

1.2.1 菌體培養(yǎng)與菌懸液制備 接種：挑取單菌落接種于種子培養(yǎng)基中，在30℃、200 r/min培養(yǎng)24 h。擴(kuò)大培養(yǎng)：向50 mL搖瓶中加入500 μL種子發(fā)酵液，在30℃、200 r/min條件下培養(yǎng) 48 h。在7 800 r/min、10℃下離心10 min，棄上清液，用生理鹽水洗滌菌體，在相同條件下重復(fù)離心分離、洗滌操作，制成菌懸液，冰箱保存，備用。

1.2.2 海藻酸鈉固定化細(xì)胞的制備 稱取一定量的海藻酸鈉，在50℃水浴中攪拌溶解，將海藻酸鈉溶液與P.putida CGMCC3830菌懸液混合均勻后，用蠕動泵緩慢的將上述混合液滴入氯化鈣溶液中成球固化。經(jīng)PBS緩沖液（pH 7.0）洗滌3次置于4℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 酶活力的測定及定義 酶活力的測定方法：取適量固定化細(xì)胞置于10 mL用磷酸緩沖液配置的100 mmol/L 3-氰基吡啶溶液中，在30℃搖床反應(yīng)20 min，用2 mol/L的鹽酸終止反應(yīng)。過濾收集轉(zhuǎn)化液，依次加入苯酚鈉溶液1 mL，次氯酸鈉1.5 mL，亞硝基鐵氰化鈉1.5 mL[13]，測定630 nm下OD值，計算產(chǎn)氨量。

一個單位酶活（U）的定義：在一定條件下，每分鐘催化氰基水解產(chǎn)生1 μmol羧酸所需的酶量。

1.2.4 溫度對固定化細(xì)胞的轉(zhuǎn)化性能的影響 取等量的固定化細(xì)胞，分別在 25、30、35、40、45、50、60℃條件下，于10 mL體系中轉(zhuǎn)化50 mmol/L 3-氰基吡啶，分別取樣測定酶活。以最適溫度下的酶活為100%，計算其他溫度下樣品的相對活力。

1.2.5 pH對固定化細(xì)胞的轉(zhuǎn)化性能的影響 取等量的固定化細(xì)胞，在最適溫度反應(yīng)條件下，于10 mL體系中轉(zhuǎn)化50 mmol/L 3-氰基吡啶，調(diào)節(jié)pH分別為 3.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、11.0，轉(zhuǎn)化3-氰基吡啶，分別取樣測定酶活。以最適pH下的酶活為100%，計算其他pH值下樣品的相對活力。

1.2.6 底物濃度對固定化細(xì)胞的轉(zhuǎn)化性能的影響取等量的固定化細(xì)胞，在最適反應(yīng)條件下，分別考察底物濃度為 50、75、100、200 mmol/L 時對固定化細(xì)胞轉(zhuǎn)化性能的影響，定時取樣測定酶活，計算底物轉(zhuǎn)化率。

1.2.7 固定化細(xì)胞與游離細(xì)胞的批次實驗 為了評價和比較固定化細(xì)胞的重復(fù)使用性，將固定化細(xì)胞與游離細(xì)胞分別在濃度為100 mmol/L的3-氰基吡啶的反應(yīng)體系中轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化60 min后將細(xì)胞濾出，用生理鹽水清洗后進(jìn)行下一批次的反應(yīng)。

2 結(jié)果與討論

2.1 海藻酸鈉固定化條件的優(yōu)化

2.1.1 海藻酸鈉質(zhì)量濃度的確定 考察包埋過程中海藻酸鈉質(zhì)量濃度對酶活力的影響。如圖1所示，當(dāng)海藻酸鈉質(zhì)量濃度低于2 g/dL時，隨著其質(zhì)量濃度的升高，固定化細(xì)胞的相對酶活逐漸增大；當(dāng)海藻酸鈉質(zhì)量濃度為2 g/dL時，酶活最高。進(jìn)一步提高海藻酸鈉質(zhì)量濃度，酶活反而降低，這與文獻(xiàn)[5]報道類似。這是由于海藻酸鈉的質(zhì)量濃度過高導(dǎo)致凝膠網(wǎng)絡(luò)過于致密，從而使得底物分子難以進(jìn)入固定化小球內(nèi)部進(jìn)行轉(zhuǎn)化，因此酶活降低。同時，海藻酸鈉質(zhì)量濃度過高也會造成小球成型的欠缺。因此，海藻酸鈉的最適質(zhì)量濃度為2 g/dL。

圖1 海藻酸鈉濃度對固定化細(xì)胞相對酶活的影響Fig.1 Effect of sodium alginate concentration on the relative activity of the immobilized cell

2.1.2 氯化鈣質(zhì)量濃度對細(xì)胞酶活的影響 海藻酸鈉包埋法的主要原理是基于Ca2+的架橋作用，使海藻酸鈉形成空間網(wǎng)絡(luò)狀結(jié)構(gòu)從而固定細(xì)胞，因此作為固定劑的氯化鈣的質(zhì)量濃度對固定化細(xì)胞的制備也有極大的影響。由圖2可以看出，氯化鈣質(zhì)量濃度對固定化P.putida CGMCC3830酶活的影響與海藻酸鈉的影響趨勢相似。當(dāng)氯化鈣質(zhì)量濃度為0.4 g/dL時，酶活最高；當(dāng)氯化鈣質(zhì)量濃度高于0.4 g/dL時，酶活降低。這同樣是由于高質(zhì)量濃度的氯化鈣造成底物或產(chǎn)物的擴(kuò)散限制[14]。

圖2 氯化鈣濃度對固定化細(xì)胞相對酶活的影響Fig.2 Effect of CaCl2concentration on the relative activity of the immobilized cell

2.1.3 固化時間對細(xì)胞酶活的影響 固化時間對固定化細(xì)胞相對酶活的影響見圖3。固化時間太短易導(dǎo)致凝膠交聯(lián)不夠充分，形成的凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)松散，機(jī)械強(qiáng)度差。當(dāng)固化時間為6 h時，凝膠致密程度適中，固定化細(xì)胞的酶活最高。進(jìn)一步的固化會導(dǎo)致凝膠過于致密，酶活反而降低。因此選定最佳固化時間為6 h。

圖3 固化時間對固定化細(xì)胞相對酶活的影響Fig.3 Effect of immobilization time on the relative activity of the immobilized cell

2.2 溫度對固定化細(xì)胞轉(zhuǎn)化性能的影響

溫度對固定化細(xì)胞酶活力的影響見圖4。當(dāng)溫度低于35℃時，固定化細(xì)胞酶活隨著溫度的升高而增加；高于35℃時酶活降低速率快，這是由于高溫造成腈水解酶的失活。因此選擇最適溫度為35℃。

圖4 溫度對固定化細(xì)胞相對酶活的影響Fig.4 Effect of temperature on the relative activity of the immobilized cell

2.3 pH對固定化細(xì)胞轉(zhuǎn)化性能的影響

反應(yīng)體系中pH值直接影響酶的催化活性。如圖5所示，當(dāng)pH為7.0時，固定化細(xì)胞的酶活最高。pH過高或者過低，均易造成酶活力的降低。但固定化細(xì)胞對堿環(huán)境的耐受性較好，pH為11.0時，其相對酶活仍保留88.7%。

圖5 pH對固定化細(xì)胞相對酶活的影響Fig.5 Effect of pH on the relative activity of the immobilized cell

2.4 固定化細(xì)胞底物濃度選擇

底物濃度對固定化細(xì)胞相對酶活的影響見圖6。底物濃度由50 mmol/L增加到100 mmol/L過程中，隨著底物濃度的增加，固定化細(xì)胞轉(zhuǎn)化3-氰基吡啶的速率逐漸減慢，底物完全轉(zhuǎn)化所需時間逐漸延長。當(dāng)?shù)孜餄舛冗_(dá)到200 mmol/L時，底物轉(zhuǎn)化率明顯下降，180 min的轉(zhuǎn)化率僅為17.4%。這是由于高底物濃度對細(xì)胞有有一定的毒害作用[15]，從而造成腈水解酶的失活。因此，選擇100 mmol/L為最適底物濃度。

圖6 不同濃度底物對固定化細(xì)胞酶活力影響Fig.6 Effect of substrate concentration on the relative activity of the immobilized cell

2.5 固定化細(xì)胞的批次轉(zhuǎn)化

固定化細(xì)胞與游離細(xì)胞的批次轉(zhuǎn)化效果見圖7。可以看出，固定化細(xì)胞連續(xù)使用10次后，酶活保留59.1%，產(chǎn)物煙酸的得率為91.8 g/g干細(xì)胞重。而相同條件下，游離細(xì)胞使用3次后，酶活下降至45.6%，煙酸得率僅為24.6 g/g干細(xì)胞重。由此可見，P.putida CGMCC3830經(jīng)過海藻酸鈉包埋后，批次使用次數(shù)及產(chǎn)物得率均明顯提高。

圖7 固定化細(xì)胞批次轉(zhuǎn)化性能Fig.7 Reuse of the immobilized cell

3 結(jié)語

作者采用包埋法對P.putida CGMCC3830細(xì)胞進(jìn)行固定化，同時考察其轉(zhuǎn)化3-氰基吡啶為煙酸的性能。以海藻酸鈉為包埋材料，通過海藻酸鈉質(zhì)量濃度、氯化鈣質(zhì)量濃度以及固化時間等的優(yōu)化，得到固定化最適條件為：海藻酸鈉質(zhì)量濃度2 g/dL，氯化鈣質(zhì)量濃度0.4 g/dL，固化時間6 h。進(jìn)一步優(yōu)化固定化細(xì)胞的轉(zhuǎn)化條件，得到最適轉(zhuǎn)化條件為：溫度35℃，pH 7.0，底物濃度100 mmol/L。批次轉(zhuǎn)化實驗結(jié)果顯示，當(dāng)?shù)孜餄舛葹?00 mmol/L時，固定化細(xì)胞可重復(fù)使用10次，酶活保留59.1%，煙酸得率為91.8 g/g細(xì)胞干重，比游離細(xì)胞提高了2.7倍。由此可見，P.putida CGMCC3830經(jīng)固定化后，單位細(xì)胞的轉(zhuǎn)化能力以及使用穩(wěn)定性均顯著提高。

[1]何玉財，周瓊，張躍，等.一株煙腈水解酶菌株的篩選及其催化特性初步研究[J].化工進(jìn)展，2011，30（12）：2714-2718.HE Yucai，ZHOU Qiong，ZHANG Yue，et al.Isolation and catalytic characteristics of a 3-cyanopyridine hydrolyzing strain[J].Chemical and Engineering Progress，2011，30（12）：2714-2718.（in Chinese）

[2]王奇昌，白金泉，郭豐艷，等.煙酸制備的研究進(jìn)展[J].廣東化工，2008，35（3）：32-35.WANG Qichang，BAI Jinquan，GUO Fengyan，et al.Research development on preparation of nicotinic acid[J].Guangdong Chemical Industry，2008，35（3）：32-35.（in Chinese）

[3]Gong J S，Lu Z M，Li H，et al.Nitrilases in nitrile biocatalysis：recent progress and forthcoming research[J].Microbial Cell Factories，2012，11：142-159.

[4]Banerjee A，Kaul P，Banerjee U C.Purification and characterization of an enantioselective arylacetonitrilase from Pseudomonas putida[J].Archives of Microbiology，2006，184（6）：407-418.

[5]Zheng Y G，Chen J，Liu Z Q，et al.Isolation，identification and characterization of Bacillus subtilis ZJB-063，a versatile nitrileconverting bacterium[J].Applied Microbiology and Biotechnology，2008，77（5）：985-993.

[6]Kaplan O，Vejvoda V，Plihal O，et al.Purification and characterization of a nitrilase from Aspergillus niger K10[J].Applied Microbiology and Biotechnology，2006，73（3）：567-575.

[7]Wu Y，Gong J S，Lu Z M，et al.Isolation and characterization of Gibberella intermedia CA3-1，a novel and versatile nitrilaseproducing fungus[J].Journal of Basic Microbiology，2013，53（11）：934-941.

[8]Kaul P，Banerjee A，Banerjee U C.Stereoselective nitrile hydrolysis by immobilized whole-cell biocatalyst[J].Biomacromolecules，2006，7：1536-1541.

[9]Sheldon R A，Van Pelt S.Enzyme immobilisation in biocatalysis：why，what and how[J].Chemical Society Reviews，2013，42（15）：6223-6235.

[10]Dursun A Y，Tepe O.Internal mass transfer effect on biodegradation of phenol by Ca-alginate immobilized Ralstonia eutropha[J].Journal of Hazardous Materials，2005，126（1-3）：105-111.

[11]Hartmeier W.Immobilized Biocatalysts[M].Berlin：Springer，2013：22-50.

[12]朱小燕，龔勁松，李恒，等.產(chǎn)芳香腈水解酶的惡臭假單胞菌 Pseudomonas putida CGMCC3830的篩選、鑒定及發(fā)酵優(yōu)化[J].生物工程學(xué)報，2014，30（3）：412-424.ZHU Xiaoyan，GONG Jinsong，LI Heng，et al.Screening，identification and culture optimization of a newly isolated aromatic nitrilase-producing bacterium-Pseudomonas putida CGMCC3830[J].Chinese Journal of Biotechnology，2014，30（3）：412-424.（in Chinese）

[13]徐美珍，任杰，龔勁松，等.生物催化 3-（4-氯苯基）-戊二腈去對稱性水解合成光學(xué)純巴氯芬的關(guān)鍵前體[J].生物工程學(xué)報，2013，29（1）：31-40.XU Meizhen，REN Jie，GONG Jinsong，et al.Biocatalytic desymmetric hydrolysis of 3-（4-chlorophenyl）-glutaronitrile to the key precursor of optically pure baclofen[J].Chinese Journal of Biotechnology，2013，29（1）：31-40.（in Chinese）

[14]El-Hadi A A，El-Minofi H A.Enhanced bioconversion of lactose by immobilized cells of Bacillus subtilis using different matrices[J].Wudpecker Journal of Agricultural Research，2012，1（10）：415-423.

[15]Sharma N N，Sharma M，Bhalla T C.An improved nitrilase-mediated bioprocess for synthesis of nicotinic acid from 3-cyanopyridine with hyperinduced Nocardia globerula NHB-2[J].Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology，2011，38（9）：1235-1243.