磷酸二酯酶抑制劑對枯草芽孢桿菌發(fā)酵環(huán)磷腺苷的影響

朱曉宏， 朱曉慧， 魏 薇

（江蘇省微生物研究所有限公司，江蘇 無錫 214063）

環(huán)磷腺苷具有調(diào)節(jié)生物體內(nèi)很多酶催化反應(yīng)的功能，體內(nèi)很多激素的作用也是通過環(huán)磷腺苷區(qū)進行的，起著激素媒介物質(zhì)的作用[1]。

現(xiàn)已證明環(huán)磷腺苷（cAMP）是睪丸甾酮、雌激素、腎上腺激素、甲狀腺激素及胎盤激素等許多激素的第二信使。當(dāng)各種激素與細(xì)胞表面作用點接觸時，發(fā)動細(xì)胞內(nèi)三磷酸腺苷（ATP）轉(zhuǎn)化成環(huán)磷腺苷（cAMP）。細(xì)胞內(nèi)環(huán)磷腺苷（cAMP）的濃度變化又引起了細(xì)胞各種代謝的變化。而且環(huán)磷腺苷（cAMP）與細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成、脂肪分解、類固醇合成均有關(guān)系。環(huán)磷腺苷（cAMP）與惡性腫瘤、內(nèi)分泌之間的關(guān)系十分密切。在特定條件下，環(huán)磷腺苷（cAMP）對癌細(xì)胞具有控制作用，對冠心病、牛皮癬等有緩解作用。

目前在我國，環(huán)磷腺苷（cAMP）主要作為醫(yī)藥品被應(yīng)用。環(huán)磷腺苷（cAMP）在醫(yī)藥上主要作為急性心肌梗塞搶救藥并用于冠心病、糖尿病、氣喘、牛皮癬等疾病的治療。

生物代謝途徑中，磷酸二酯酶及其同工酶能夠使環(huán)磷腺苷降解[2]，破壞磷酸二酯酶及其同工酶，成為提高環(huán)磷腺苷發(fā)酵水平的有效途徑。

本研究采用菌種枯草芽孢桿菌Bacillus.subtilis jsim-1277已經(jīng)是腺苷酸脫氨酶陰性[3]減少了磷酸二酯酶活性，作者試驗了多種磷酸二酯酶同工酶抑制劑，有效提高了環(huán)磷腺苷的發(fā)酵水平。

1 材料與方法

1.1 菌種

作者所在研究室篩選育種得到的Bacillus.subtilis jsim-1277。該菌株與目前國內(nèi)鳥苷發(fā)酵菌種Bacillus.subtilis jsim-G518[4]相似，同樣源自肌苷產(chǎn)生菌Bacillus.subtilis jsim-1019。

1.2 培養(yǎng)基

1.2.1 種子培養(yǎng)基 葡萄糖2.0 g/dL，蛋白胨1.0 g/dL，玉米漿 0.3 g/dL，NaCl 0.3 g/dL；pH 7.0。 （固體培養(yǎng)基加瓊脂2 g/dL）

1.2.2 發(fā)酵培養(yǎng)基 葡萄糖6.0 g/dL，尿素1.0 g/dL，酵母粉1.0 g/dL，豆餅水解液0.3 g/dL，K2HPO41.0 g/dL，NaF 0.05 g/dL，MgSO40.1 g/dL；pH 7.0。依據(jù)實驗需要添加 1，5，10，20，50 mg/L 的酚噻嗪、 西馬多丁、硫苯唑林、丙苯氮嘌呤、茶堿等磷酸二酯酶抑制劑。

1.3 搖瓶發(fā)酵試驗

1.3.1 搖瓶種子培養(yǎng) 接一環(huán)生長良好的斜面培養(yǎng)物至裝有30 mL種子培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中培養(yǎng)，旋轉(zhuǎn)式搖床，頻率210 r／min，溫度36℃ ，培養(yǎng)18 h。

1.3.2 搖瓶發(fā)酵培養(yǎng) 將生長良好的種子液接至裝有30 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中培養(yǎng)，接種體積分?jǐn)?shù)10%，旋轉(zhuǎn)式搖床，頻率210 r／min，溫度36℃，培養(yǎng)72 h后測定環(huán)磷腺苷質(zhì)量濃度。培養(yǎng)條件與鳥苷發(fā)酵條件相似[5]。

1.4 分析方法

高效液相色譜法。用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，以0.05 mol/L磷酸二氫鉀溶液 （含0.01 mol/L四丁基溴化銨，用磷酸調(diào)節(jié)pH值至4.3）-乙腈（85∶15）為流動相，檢測波長為258 nm。標(biāo)準(zhǔn)品溶液0.2 mg/mL，取20 μL注入液相色譜儀，按外標(biāo)法以峰面積計算測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 酚噻嗪的影響

在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加了 1、5、10、20、50 mg/L 的酚噻嗪，與不添加的常規(guī)培養(yǎng)基發(fā)酵進行對照，結(jié)果見表1。

表1 酚噻嗪對環(huán)磷腺苷發(fā)酵的影響Table 1 Effect of various concentration of phenothiazine on cAMP accumulation

酚噻嗪的加入非但沒有提高，還大大降低了環(huán)磷腺苷的生產(chǎn)能力。發(fā)酵過程中，菌自溶時間提前，可能與酚噻嗪對菌種具有毒性有關(guān)。

2.2 西馬多丁的影響

在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加了 1、5、10、20、50 mg/L 的西馬多丁，與不添加的常規(guī)培養(yǎng)基發(fā)酵進行對照，結(jié)果見表2。

表2 西馬多丁對環(huán)磷腺苷發(fā)酵的影響Table 2 Effect of various concentration of cemadotin on cAMP accumulation

西馬多丁在低濃度可以提高環(huán)磷腺苷的生產(chǎn)能力，在5 mg/L添加量時，可以提高產(chǎn)量16%，而添加量過大則反而減產(chǎn)?？赡芘c西馬多丁對磷酸二酯酶同工酶的抑制有關(guān)。

2.3 硫苯唑林的影響

在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加了 1、5、10、20、50 mg/L 的硫苯唑林，與不添加的常規(guī)培養(yǎng)基發(fā)酵進行對照，結(jié)果見表3。

表3 硫苯唑林對環(huán)磷腺苷發(fā)酵的影響Table 3 Effect of various concentration of thibenzazoline on cAMP accumulation

硫苯唑林的加入同樣沒有提高，并大大降低了環(huán)磷腺苷的生產(chǎn)能力。發(fā)酵過程中，菌自溶時間也提前，可能與硫苯唑林對菌種具有毒性有關(guān)。

2.4 丙苯氮嘌呤的影響

在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加了 1、5、10、20、50 mg/L 的丙苯氮嘌呤，與不添加的常規(guī)培養(yǎng)基發(fā)酵進行對照，結(jié)果見表4。

表4 丙苯氮嘌呤對環(huán)磷腺苷發(fā)酵的影響Table 4 Effect of various concentration ofbenzene nitrogen purine on cAMP accumulation

丙苯氮嘌呤的加入同樣沒有提高，并大大降低了環(huán)磷腺苷的生產(chǎn)能力。發(fā)酵過程中，菌自溶時間提前更明顯，可能與丙苯氮嘌呤對菌種具有毒性有關(guān)。

2.5 氨茶堿的影響

在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加了 1、5、10、20、50 mg/L 的氨茶堿，與不添加的常規(guī)培養(yǎng)基發(fā)酵進行對照，結(jié)果見表5。

氨茶堿可以提高環(huán)磷腺苷的生產(chǎn)能力，在5 mg/L添加量時，可以提高產(chǎn)量10.7%，隨著添加質(zhì)量濃度的提高，環(huán)磷腺苷增產(chǎn)能力維持在9%～10%左右，可能與氨茶堿對某類磷酸二酯酶同工酶產(chǎn)生了抑制有關(guān)。

表5 氨茶堿對環(huán)磷腺苷發(fā)酵的影響Table 5 Effect of various concentration of aminophylline on cAMP accumulation

2.6 西馬多丁與氨茶堿聯(lián)合使用的影響

西馬多丁與氨茶堿共同使用，按照之前試驗中最佳的3個質(zhì)量濃度組合，結(jié)果見表6。

表6 西馬多丁與氨茶堿聯(lián)用對環(huán)磷腺苷發(fā)酵的影響Table 6 Effect of cemadotin combined with aminophylline on cAMP accumulation

西馬多丁和氨茶堿聯(lián)用，具有提高環(huán)磷腺苷的生產(chǎn)能力，且提高能力相互間有加成效果，可能西馬多丁和氨茶堿分別抑制的磷酸二酯酶同工酶類別不同，協(xié)同減少了菌對自身產(chǎn)物環(huán)磷腺苷的降解，實現(xiàn)了增產(chǎn)的效果。

3 結(jié)語

環(huán)磷腺苷產(chǎn)生菌枯草芽孢桿菌Bacillus.subtilis jsim-1277能在某些磷酸二酯酶同工酶抑制劑的存在下，提高環(huán)磷腺苷的產(chǎn)量。其中西馬多丁和氨茶堿聯(lián)用，最多可以增產(chǎn)28%，達到9.14 g/L，提高非常顯著。

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