秦巴山區(qū)黑木耳主要栽培種內(nèi)原生質(zhì)體分離與融合

陳文強(qiáng) ， 王 進(jìn) ， 鄧百萬(wàn) ， 彭 浩 ， 解修超 ， 蘭阿峰 ，劉開(kāi)輝 ， 丁小維 ， 趙娜娜 ， 錢(qián)雪婷 ， 蘇晨曦

（1.陜西理工學(xué)院 生物科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 漢中723001；2.陜西省食藥用菌工程技術(shù)研究中心，陜西 漢中723001）

黑木耳（Auricularia auricula）俗稱(chēng)木耳、細(xì)木耳、光木耳、云耳，分類(lèi)上屬層菌綱，木耳目，木耳科，木耳屬（Auricularia）。木耳屬食用菌不僅含有極高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和藥用價(jià)值，同時(shí)熱量很低，是一種健康美味食藥用菌[1]。

原生質(zhì)體及其融合技術(shù)是近年來(lái)迅速發(fā)展的生物工程育種新技術(shù)，空間細(xì)胞融合技術(shù)、非對(duì)稱(chēng)細(xì)胞融合技術(shù)、離子束細(xì)胞融合技術(shù)等新進(jìn)展已應(yīng)用于原生質(zhì)體育種，在食用菌遺傳育種上已取得了可喜的成績(jī)[2-3]。迄今，國(guó)內(nèi)外學(xué)者已從杏鮑菇、白靈菇、平菇、雙胞蘑菇、美味牛肝菌、冬蟲(chóng)夏草等50多種食用菌中成功制備原生質(zhì)體，并結(jié)合分子生物學(xué)技術(shù)就食用菌育種進(jìn)行了大量的研究，取得了令人矚目的進(jìn)展[4-12]。近年來(lái)，食用菌原生質(zhì)體融合技術(shù)迅速發(fā)展，關(guān)于種內(nèi)、種間及屬間原生質(zhì)體融合都不斷有新的進(jìn)展。2010年，郭成金等[13]采用雙親滅活標(biāo)記法對(duì)冬蟲(chóng)夏草和蛹蟲(chóng)草進(jìn)行原生質(zhì)體融合的研究，并利用形態(tài)學(xué)、頡頏實(shí)驗(yàn)及分子手段方法對(duì)融合子進(jìn)行鑒定；2011年，江力等[14]采用原生質(zhì)體融合及再生對(duì)茶樹(shù)菇和雞腿菇進(jìn)行融合，并通過(guò)菌落表型的比較和頡頏反應(yīng)驗(yàn)證再生出的為融合子；2012年，全衛(wèi)豐等[15]采用化學(xué)融合方法對(duì)兩株不同性狀的靈芝菌株進(jìn)行原生質(zhì)體融合選育，通過(guò)酯酶同工酶篩選富硒高產(chǎn)靈芝；2013年，陳建中等[16]采用雙親滅活原生質(zhì)體融合技術(shù)選育耐低溫草菇菌株。

目前，木耳屬原生質(zhì)體方面的研究多數(shù)還集中在以黑木耳為材料的原生質(zhì)體制備及再生條件的探究，采用原生質(zhì)體化學(xué)融合技術(shù)對(duì)木耳屬不同的菌種進(jìn)行融合的實(shí)驗(yàn)尚未成功?；趯?duì)秦巴山區(qū)黑木耳新科、耳 268、秦單 4#、耳 2、耳 913、神農(nóng) A8、耳97-2等7個(gè)主要栽培菌株形態(tài)特征和核糖體轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）的序列分析，確定了各菌株之間的親緣關(guān)系[17]，在此基礎(chǔ)上，作者對(duì)秦巴山區(qū)黑木耳主要栽培種神農(nóng)A8與秦單4#的原生質(zhì)體進(jìn)行分離與融合。同時(shí)，優(yōu)化黑木耳菌株原生質(zhì)體制備、再生及融合的條件，為秦巴山區(qū)黑木耳優(yōu)良菌種的選育提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 神農(nóng)A8與秦單4#黑木耳栽培菌株：由陜西省資源生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室食藥用菌菌種保藏中心提供。

1.1.2 培養(yǎng)基

CPDA綜合培養(yǎng)基：馬鈴薯200.0 g，葡萄糖20.0 g， 蛋白胨 3.0 g，KH2PO45.0 g，MgSO4·7H2O 3.0 g，VB10.01 g，瓊脂 20.0 g，加水至 1 000 mL。

液體培養(yǎng)基：CPDA綜合培養(yǎng)基（無(wú)瓊脂）。

液體再生培養(yǎng)基：液體培養(yǎng)基+109.3 g甘露醇。

原生質(zhì)體再生培養(yǎng)基 （Regeneration Medium，RM）：RM1：馬鈴薯200.0 g，葡萄糖20.0 g，瓊脂20.0 g，加水至 1 000.0 mL；RM2：馬鈴薯 200.0 g，葡萄糖20.0 g，蛋白胨3.0 g，瓊脂20.0 g，加水至1 000.0 mL；RM3：馬鈴薯 200.0 g，葡萄糖 20.0 g，蛋白胨 3.0 g，KH2PO45.0 g， 瓊脂 20.0 g， 加水至 1 000.0 mL；RM4：馬鈴薯 200.0 g，葡萄糖 20.0 g，蛋白胨 3.0 g，KH2PO45.0 g，MgSO4·7H2O 3.0 g，VB1 0.01 g， 瓊脂20.0 g，加水至 1 000.0 mL；RM5：CPDA 綜合培養(yǎng)基+109.3 g甘露醇。

1.1.3 主要試劑 穩(wěn)滲劑：KCl、MgSO4、蔗糖和甘露醇 （濃度為 0.4、0.5、0.6、0.7 mol/L）， 磷酸鹽緩沖液（0.05 mol/L，pH 5.8）；酶液：先用 0.05 mol/L pH 5.8的磷酸鹽緩沖液配置滲透壓穩(wěn)定劑，再用該穩(wěn)滲劑配置濃度為1%、1.5%、2%、2.5%、3%的酶液，用0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾除菌后備用；融合劑：用滲透壓穩(wěn)定劑（0.5 mol/L甘露醇）將PEG聚乙二醇配置成質(zhì)量濃度為 30、35、40、45、50、55、60 g/dL 的融合劑，且內(nèi)含0.05 mol/L CaCl2。

1.1.4 主要儀器與設(shè)備 恒溫振蕩器：ZHWY-210 2C，上海智誠(chéng)分析儀器制造有限公司；超凈工作臺(tái)：SW-CJ-1F，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；電子天平：BJ100M，上海精科天美科學(xué)儀器有限公司；立式圓形壓力蒸氣滅菌器：LS-B50L，上海醫(yī)用核子儀器廠(chǎng)；人工氣候箱：LRH-800-GS，韶關(guān)市明天環(huán)保儀器有限公司；恒溫水浴鍋：DZKW-S-4，惠州市新旭實(shí)業(yè)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 菌絲培養(yǎng) 向長(zhǎng)滿(mǎn)黑木耳菌絲的試管菌種中加入5.0 mL液體培養(yǎng)基，用接種針刮去菌種表面全部菌絲，將此帶有菌絲的培養(yǎng)液倒入裝有40.0 mL液體培養(yǎng)基的三角瓶中，28℃靜置培養(yǎng)5～9 d，每天輕搖幾次。

1.2.2 菌絲收集 無(wú)菌條件下用尼龍網(wǎng)布過(guò)濾收集菌絲體，無(wú)菌水沖洗一次，無(wú)菌濾紙吸干水分，再用穩(wěn)滲劑沖洗，4℃下5 000 r/min離心10 min，去掉上清液，重復(fù)一次。

1.2.3 原生質(zhì)體的制備 向裝有菌絲的離心管中分別添加1.5 mL蝸牛酶液、溶壁酶液及果膠酶液，振蕩2 min混勻，在20～40℃水浴中酶解2～4.5 h，每隔一段時(shí)間振蕩混勻一次。吸取少量酶液，40倍光學(xué)顯微鏡下用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。

1.2.4 原生質(zhì)體的再生 酶解結(jié)束后過(guò)濾掉菌絲，無(wú)菌管收集濾液，用穩(wěn)滲劑洗滌離心兩次，3 000 r/min離心10 min。向?yàn)V液中加入等體積的穩(wěn)滲劑搖勻，吸取0.1 mL原生質(zhì)體懸液涂布于再生培養(yǎng)基上。25℃下靜置培養(yǎng)10～15 d，觀(guān)察平皿中的再生菌落數(shù)，挑取再生菌株備用。

1.2.5 單核原生質(zhì)體再生菌株的篩選 光學(xué)鏡檢：配置10%的KOH和3%的剛果紅，各滴一滴在載玻片上，加18 mm×18 mm的長(zhǎng)有黑木耳菌絲的蓋玻片。光學(xué)顯微鏡下觀(guān)察再生菌株的菌絲，鑒定鎖狀聯(lián)合的有無(wú)，篩選出沒(méi)有鎖狀聯(lián)合的單核再生菌株。熒光鏡檢：在長(zhǎng)滿(mǎn)黑木耳菌絲的蓋玻片上加入DAPI進(jìn)行染色，染色時(shí)間為40 min，用蒸餾水沖洗，然后加入熒光增白劑染色4～5 min，再次用蒸餾水沖洗。置于熒光顯微鏡下，觀(guān)察染色情況，對(duì)樣品進(jìn)行快速照相備用。此方法再次確定再生菌株鎖狀聯(lián)合的有無(wú)，篩選出沒(méi)有鎖狀聯(lián)合的單核再生菌株。

1.2.6 親本原生質(zhì)體的滅活 熱滅活標(biāo)記親本神農(nóng)A8：將篩選出來(lái)的單核再生菌株神農(nóng)A8制成的原生質(zhì)體懸液分別置于40～50℃水浴保溫10～30 min，結(jié)束后涂布于再生培養(yǎng)基上，25℃避光靜置培養(yǎng)10～15 d，記錄再生菌落數(shù)。每個(gè)處理3次重復(fù)，設(shè)置一組未做熱處理的原生質(zhì)體作對(duì)照，確定原生質(zhì)體熱滅活致死臨界點(diǎn)；紫外滅活標(biāo)記秦單4#：將篩選出來(lái)的單核再生菌株秦單4#制成的原生質(zhì)體懸液200 uL涂布于再生培養(yǎng)基上，15 W紫外燈下30 cm處開(kāi)蓋，分別照射1～5 min，照射結(jié)束后立即蓋緊，黑紙包裹好，25℃避光靜置培養(yǎng)10～15 d，記錄再生菌落數(shù)。每個(gè)處理3次重復(fù)，設(shè)置一組未做紫外滅活處理的原生質(zhì)體作對(duì)照，確定原生質(zhì)體紫外滅活致死臨界點(diǎn)。

1.2.7 原生質(zhì)體的融合 將兩個(gè)用不同方式滅活標(biāo)記的親本原生質(zhì)體懸液各1.0 mL混勻離心，棄上清液，加入1.5 mL質(zhì)量濃度為30～55 g/dL內(nèi)含0.05 mol/L CaCl2，融合溫度為25～40℃，融合時(shí)間10～40 min。融合結(jié)束立即用穩(wěn)滲劑洗滌離心兩次，稀釋后涂布于再生培養(yǎng)基上，記錄再生菌落數(shù)。

融合率=融合子再生菌落數(shù)/原生質(zhì)體總數(shù)。

1.2.8 融合子的鑒定 根據(jù)擷抗反應(yīng)對(duì)融合子進(jìn)行篩選，通過(guò)觀(guān)察菌落表型進(jìn)行初步鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 原生質(zhì)體的制備

試驗(yàn)在溶壁酶作用下原生質(zhì)體的釋放量效果最好，釋放量神農(nóng)A8為0.94×107個(gè)/mL，秦單4#為1.44×107個(gè)/mL，其次為蝸牛酶、果膠酶。因此，選用溶壁酶進(jìn)行試驗(yàn)。

2.1.1 溶壁酶濃度 選擇溶壁酶濃度分別為1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mol/L 進(jìn)行試驗(yàn)。結(jié)果見(jiàn)圖 1。 2.0 mol/L時(shí)原生質(zhì)體釋放量達(dá)最大，黑木耳秦單4#和神農(nóng)A8原生質(zhì)體釋放量分別為1.44×107、0.94×107個(gè)/mL。在一定范圍內(nèi)，原生質(zhì)體釋放量隨溶壁酶的濃度增加而升高，當(dāng)溶壁酶濃度為2.0 mol/L時(shí)，原生質(zhì)體釋放量最高，隨后隨著溶壁酶濃度的增加而降低。因此，黑木耳原生質(zhì)體制備的最佳溶壁酶濃度為2.0 mol/L。

圖1 溶壁酶濃度對(duì)原生質(zhì)體釋放量的影響Fig.1 Effect of lywallzyme’s concentration on protoplast yield

2.1.2 酶解時(shí)間 選擇酶解時(shí)間分別為2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5 h 進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)圖 2。 酶解時(shí)間為3.5 h時(shí)原生質(zhì)體釋放量達(dá)最大，黑木耳秦單4#和神農(nóng)A8原生質(zhì)體釋放量分別為1.38×107、0.88×107個(gè)/mL。一定時(shí)間范圍內(nèi)，原生質(zhì)體釋放量隨酶解時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，酶解時(shí)間達(dá)到3.5 h后反而會(huì)導(dǎo)致原生質(zhì)體釋放量下降。因此，黑木耳原生質(zhì)體制備的最佳酶解時(shí)間為3.5 h。

圖2 酶解時(shí)間對(duì)原生質(zhì)體釋放量的影響Fig.2 Effect of digesting time on protoplast yield

2.1.3 酶解溫度 選擇酶解溫度分別為20、25、30、35、40℃進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)圖3。酶解溫度為30℃時(shí)原生質(zhì)體釋放量達(dá)最大，黑木耳秦單4#和神農(nóng)A8原生質(zhì)體釋放量分別為 1.38×107、0.88×107個(gè)/mL。對(duì)于大多數(shù)食藥用菌，最佳酶解溫度范圍是28～34℃。在一定溫度范圍內(nèi)，原生質(zhì)體的釋放量呈先上升后下降之趨勢(shì)，在30℃時(shí)達(dá)到最大值。低于或高于此溫度，酶活力均受影響，從而原生質(zhì)體的釋放量也受影響。 因此，黑木耳原生質(zhì)體制備的最佳酶解溫度為30℃。

圖3 酶解溫度對(duì)原生質(zhì)體釋放量的影響Fig.3 Effect of digesting temperature on protoplast yield

2.1.4 出發(fā)菌齡 選擇出發(fā)菌齡分別為5、6、7、8、9 d進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)圖4。香菇菌株菌齡為7 d時(shí)原生質(zhì)體釋放量達(dá)最大，黑木耳秦單4#和神農(nóng)A8原生質(zhì)體釋放量分別達(dá) 1.44×107、0.94×107個(gè)/mL。 在一定范圍內(nèi)，隨著菌齡的延長(zhǎng)，原生質(zhì)體釋放量先增加后下降，在第7天原生質(zhì)體釋放量達(dá)最高值。培養(yǎng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，原生質(zhì)體釋放量隨之下降，這與菌體細(xì)胞老化以及細(xì)胞壁上不易被酶解的物質(zhì)的沉積及發(fā)酵后其細(xì)胞活力下降，產(chǎn)生很大比例的非活性個(gè)體有關(guān)[18]。因此，黑木耳原生質(zhì)體制備的最佳出發(fā)菌齡為7 d。

圖4 出發(fā)菌齡對(duì)原生質(zhì)體釋放量的影響Fig.4 Effect of mycelial age on protoplast yield

2.1.5 滲透壓穩(wěn)定劑種類(lèi)及濃度 選擇滲透壓穩(wěn)定劑分別為KCl、MgSO4、蔗糖和甘露醇，再將最佳的滲透壓穩(wěn)定劑配制成 0.4、0.5、0.6、0.7 mol/L進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)圖5。利用不同滲透壓穩(wěn)定劑制得的原生質(zhì)體釋放量由多到少的順序依次為：甘露醇＞MgSO4＞蔗糖＞KCl。圖6所示，以甘露醇作為滲透壓穩(wěn)定劑，在0.5 mol/L原生質(zhì)體釋放量達(dá)最大。在一定范圍內(nèi)，原生質(zhì)體釋放量隨濃度的增加而升高，再隨著濃度的增加原生質(zhì)體釋放量反而減少。因此，黑木耳原生質(zhì)體制備的最佳滲透壓穩(wěn)定劑種類(lèi)及濃度分別為甘露醇和0.5 mol/L。

圖5 滲透壓穩(wěn)定劑對(duì)原生質(zhì)體釋放量的影響Fig.5 Effect of osmotic pressure stabilizer on protoplast yield

圖6 滲透壓穩(wěn)定劑濃度對(duì)原生質(zhì)體釋放量的影響Fig.6 Effect of osmotic pressure stabilizer’concentration on protoplast yield

2.2 原生質(zhì)體的再生

選擇原生質(zhì)體再生培養(yǎng)基分別為RM1、RM2、RM3、RM4、RM5進(jìn)行試驗(yàn)。表1表明，在最佳條件下得到的原生質(zhì)體分別在供試的5種培養(yǎng)基中均能再生，在RM5培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的神農(nóng)A8和秦單4#菌落數(shù)分別為9和11，再生率分別為1.91%和1.53%；在RM1培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的神農(nóng)A8和秦單4#菌落數(shù)分別為1和2，再生率分別為0.21%和0.28%。因此，黑木耳原生質(zhì)體再生的最佳培養(yǎng)基為RM5。

表1 再生培養(yǎng)基對(duì)原生質(zhì)體再生的影響Table 1 Effect of different regeneration medium on the regeneration rate of protoplast

2.3 原生質(zhì)體單核化

2.3.1 光學(xué)鏡檢 取黑木耳原生質(zhì)體再生菌株在光學(xué)顯微鏡（40×）下觀(guān)察菌絲鎖狀聯(lián)合的有無(wú)，結(jié)果見(jiàn)圖7。黑木耳菌株秦單4#和神農(nóng)A8菌絲均無(wú)鎖狀聯(lián)合。

圖7 單核菌絲顯微鏡檢Fig.7 Monocyte hyphae by microscope

2.3.2 熒光鏡檢 由于木耳菌絲極細(xì)，普通光鏡下很難確定判斷鎖狀聯(lián)合。通過(guò)熒光染色方法對(duì)單核再生菌株進(jìn)行確定，結(jié)果見(jiàn)圖8。進(jìn)一步確定黑木耳菌株秦單4#和神農(nóng)A8菌絲均無(wú)鎖狀聯(lián)合。

圖8 單核菌絲熒光鏡檢Fig.8 Monocyte hyphae by fluoroscope

2.4 原生質(zhì)體滅活標(biāo)記

目前，滅活標(biāo)記法被認(rèn)為是最有適用的通用標(biāo)記方法。熱滅活使核糖體16S亞基受損，細(xì)胞內(nèi)功能蛋白、酶蛋白的結(jié)構(gòu)變形或合成受到影響，從而使原生質(zhì)體失去再生能力，產(chǎn)生致死作用；紫外滅活破壞細(xì)胞核，造成DNA分子結(jié)構(gòu)扭曲，使細(xì)胞核變形失活，同時(shí)保留其細(xì)胞質(zhì)、蛋白質(zhì)、氨基酸等活性物質(zhì)。在原生質(zhì)體融合時(shí)，損傷部位不同的雙親原生質(zhì)體通過(guò)遺傳互補(bǔ)相結(jié)合，從而達(dá)到育種選育之目的[13]。

2.4.1 熱滅活標(biāo)記 取神農(nóng)A8單核再生菌株原生質(zhì)體進(jìn)行熱滅活試驗(yàn)，滅活溫度分別選擇40、45、50℃，滅活時(shí)間分別為 10、20、30 min，觀(guān)察不同熱滅活溫度、不同滅活時(shí)間的原生質(zhì)體的再生。表2結(jié)果表明，當(dāng)溫度達(dá)到50℃、時(shí)間超過(guò)20 min時(shí)，沒(méi)有再生菌落萌發(fā)，原生質(zhì)體可達(dá)100%致死效果。因此，神農(nóng)A8單核再生菌株原生質(zhì)體熱滅活致死臨界溫度和時(shí)間分別為50℃、20 min。

表2 熱滅活標(biāo)記原生質(zhì)體再生菌落數(shù)Table 2 Heat inactivated marker of protoplast regeneration strains

2.4.2 紫外滅活標(biāo)記 取秦單4#單核再生菌株原生質(zhì)體進(jìn)行紫外滅活試驗(yàn)，將原生質(zhì)體懸液暴露于15 W 紫外燈下分別照射 1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0 min，結(jié)果見(jiàn)圖9。當(dāng)紫外滅活時(shí)間超過(guò)3.5 min時(shí)，原生質(zhì)體即可全部致死。因此，秦單4#單核再生菌株原生質(zhì)體紫外滅活致死臨界時(shí)間為3.5 min。

圖9 紫外滅活致死率Fig.9 Death rate of ultraviolet inactivation

2.5 原生質(zhì)體融合

2.5.1 PEG質(zhì)量濃度 選擇PEG質(zhì)量濃度分別為30、35、40、45、50、55 g/dL 內(nèi) 含 0.05 mol/L CaCl2PEG進(jìn)行試驗(yàn)，研究其對(duì)黑木耳神農(nóng)A8和秦單4#原生質(zhì)體融合的影響，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 PEG質(zhì)量濃度對(duì)原生質(zhì)體融合的影響Table 3 Effect of PEG concentration on protoplast fusion

表3結(jié)果表明，PEG質(zhì)量濃度為30 g/dL時(shí)原生質(zhì)體融合成功率較高，融合子再生菌落數(shù)為78個(gè)。PEG質(zhì)量濃度在30～60 g/dL間，較適合真菌原生質(zhì)體的融合。在一定范圍內(nèi)，PEG質(zhì)量濃度過(guò)高時(shí)，雖然原生質(zhì)體的融合機(jī)會(huì)大增，但質(zhì)量濃度的增加也使得更多的融合子受到毒害，質(zhì)量濃度過(guò)高會(huì)導(dǎo)致原生質(zhì)體皺縮甚至中毒，融合子存活率降低。因此，原生質(zhì)體融合的最佳PEG質(zhì)量濃度為30 g/dL。

2.5.2 融合時(shí)間 選擇融合時(shí)間分別為10、20、30、40 min進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 融合時(shí)間對(duì)原生質(zhì)體融合的影響Table 4 Effect of fusion time on protoplast fusion

表4表明，PEG融合30 min時(shí)，融合子再生菌落數(shù)為65個(gè)。PEG融合時(shí)間是融合的最關(guān)鍵因素之一，尤其是PEG結(jié)合高Ca2+、高pH溶液處理時(shí)，時(shí)間長(zhǎng)短非常重要。PEG溶液加入后，原生質(zhì)體間即強(qiáng)烈地發(fā)生黏著，融合能長(zhǎng)時(shí)間有效進(jìn)行。由于PEG有一定的毒性，處理時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，會(huì)導(dǎo)致原生質(zhì)體失活；時(shí)間過(guò)短原生質(zhì)體融合不穩(wěn)定。因此，在原生質(zhì)體充分融合后，必須用穩(wěn)滲劑及時(shí)對(duì)其進(jìn)行離心洗滌。因此，原生質(zhì)體融合的最佳時(shí)間為30 min。

2.5.3 融合溫度 選擇融合溫度分別為25、30、35、40℃進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 融合溫度對(duì)原生質(zhì)體融合的影響Table 5 Effect of fusion temperature on protoplast fusion

表5表明，35℃時(shí)融合子再生菌落數(shù)為72個(gè)。在一定范圍內(nèi)，細(xì)胞膜在較高溫度下流動(dòng)性增加，PEG黏度下降，有利于原生質(zhì)體融合；溫度超過(guò)35℃反而會(huì)影響原生質(zhì)體融合[14]。因此，原生質(zhì)體融合的最佳溫度為35℃。

2.6 融合子的鑒定

2.6.1 融合子與親本的擷抗反應(yīng) 黑木耳兩親本菌株和融合子于CPDA培養(yǎng)基中，28℃培養(yǎng)，10～15 d后觀(guān)察菌絲的擷抗反應(yīng)，結(jié)果見(jiàn)圖10。

圖10 融合子與親本的擷抗反應(yīng)Fig.10 Antagonism of fusant and parents

由圖10融合子與親本的擷抗反應(yīng)可知，融合子與親本之間產(chǎn)生了明顯的擷抗現(xiàn)象，可以確定融合子在原生質(zhì)體滅活和融合過(guò)程中發(fā)生了核遺傳要素的變異。

2.6.2 融合子再生菌落的表型觀(guān)察 黑木耳兩親本菌株和融合子于CPDA培養(yǎng)基中，28℃培養(yǎng)，觀(guān)察菌絲的生長(zhǎng)速度、色澤及菌絲密度并記錄，結(jié)果見(jiàn)表6和圖11。

表6 黑木耳菌株菌絲的形態(tài)觀(guān)察Table 6 Mycelia morphology investigation in different Auricularia auricular strains

圖11 融合子及兩親本的菌落表型Fig.11 Colonial phynotype observations of the fusant and its parents

表6和圖11結(jié)果表明，神農(nóng)A8的菌落邊緣較整齊，菌絲較粗，生長(zhǎng)速度5.2 mm/d；秦單4#的菌落邊緣不規(guī)整，菌絲較細(xì)，生長(zhǎng)速度6.2 mm/d；融合子生長(zhǎng)速度6.0 mm/d，介于兩者之間。

3 結(jié)語(yǔ)

影響原生質(zhì)體數(shù)量的因素很多，包括出發(fā)菌齡、溶壁酶濃度、酶解溫度及時(shí)間、滲透壓穩(wěn)定劑種類(lèi)及濃度等。研究表明，培養(yǎng)了7 d的黑木耳菌絲體用0.5 mol/L甘露醇做穩(wěn)滲劑，2.0 mol/L的溶壁酶酶解，30℃下水浴3.5 h所產(chǎn)生的原生質(zhì)體釋放量達(dá)最大，神農(nóng) A8和秦單 4#分別 0.94×107、1.44×107個(gè)/mL。

原生質(zhì)體的再生受很多因素影響，其中再生培養(yǎng)基組分對(duì)其影響最大。研究表明，當(dāng)再生培養(yǎng)選擇RM5時(shí)，原生質(zhì)體再生率達(dá)最高。其培養(yǎng)基組分為：馬鈴薯200.0 g，葡萄糖20.0 g，蛋白胨3.0 g，KH2PO45.0 g，MgSO4·7H2O 3.0 g，VB10.01 g， 瓊脂20.0 g，109.3 g甘露醇加水至1 000 mL。

采用雙滅活手段對(duì)親本進(jìn)行遺傳標(biāo)記的關(guān)鍵在于方便挑選融合子和篩選損傷程度最小的臨界致死劑量。研究表明，黑木耳原生質(zhì)體熱滅活致死臨界溫度為50℃，時(shí)間為20 min，原生質(zhì)體紫外滅活致死臨界時(shí)間為3.5 min。孫露[19]的研究表明，木耳原生質(zhì)體熱滅活致死臨界溫度為50℃，時(shí)間為10 min，原生質(zhì)體紫外滅活致死臨界時(shí)間為3 min；賀建超[20]的研究表明，木耳原生質(zhì)體熱滅活致死臨界溫度為65℃，時(shí)間為30 min，原生質(zhì)體紫外滅活致死臨界時(shí)間為3 min。這可能是由于黑木耳不同品種的遺傳差異所致，所以在應(yīng)用雙親滅活法進(jìn)行原生質(zhì)體融合前要篩選出最適的雙親滅活臨界點(diǎn)。

影響原生質(zhì)體融合的主要因素包括融合劑PEG質(zhì)量濃度、融合時(shí)間及融合溫度等。研究表明，使用30%聚乙二醇（PEG4000）和 0.05 mol/L CaCl2溶液 （pH 10）為助融劑，35℃融合30 min效果最好。楊國(guó)良采用的電融合法得到毛木耳與黑木耳的融合率為1.7×10-4，是PEG法的50倍左右。但是，電融合法的成本極高，而且操作技術(shù)要求比較高，而二者融合的效果基本一致。

根據(jù)菌落表現(xiàn)及擷抗反應(yīng)分析，可得出融合子確系經(jīng)熱滅活標(biāo)記和紫外滅活標(biāo)記的黑木耳原生質(zhì)體融合產(chǎn)物說(shuō)明，以單核再生菌株原生質(zhì)體作為親本，分別采用熱滅活和紫外滅活時(shí)雙親原生質(zhì)體進(jìn)行遺傳標(biāo)記，利用PEG在適宜條件下進(jìn)行原生質(zhì)體融合，可得到與雙親遺傳性狀不同的融合子。作者對(duì)秦巴山區(qū)黑木耳主要栽培種神農(nóng)A8和秦單4#進(jìn)行了原生質(zhì)體的分離和融合，得到的融合子是否適宜于秦巴山區(qū)栽培并表現(xiàn)出優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)性狀有待進(jìn)一步研究。

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