革蘭氏陰性益生菌大腸桿菌Nissle 1917益生機(jī)理及其在仔豬方面的應(yīng)用

鄧 歡 賴 星 孫志洪 陳 澄 石寶石 唐志如

(西南大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，生物飼料與分子營養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400715)

1917年，志賀菌痢爆發(fā)，德國醫(yī)生 Alfred Nissle從疫區(qū)一位未患腸炎的士兵糞便中分離了1株無致病性的大腸桿菌(E.coli)菌株，命名為 E.coli Nissle1917(EcN)。隨后，科學(xué)家分離到一些新的益生E.coli菌種，如 SK22(保存于德國菌種中心，編號(hào)為DSM6601)，并探索了它們對動(dòng)物健康的益生機(jī)理［1-2］。作為一種腸道微生物，EcN能定植于腸道中并與其他微生物抗衡。了解EcN特殊的表型、定植機(jī)理、免疫調(diào)節(jié)機(jī)理和在仔豬方面應(yīng)用的研究現(xiàn)狀對其他益生革蘭氏陰性桿菌在腸道中的研究具有重要參考意義。

1 EcN的基本特征

在瓊脂固體營養(yǎng)培養(yǎng)基上，EcN菌落呈半粗糙型，較光滑、透明、黏稠，易挑取，大而平坦，菌落正反面或邊緣與中央部位的顏色一致。EcN的O6抗原聚合酶wzy基因終止子上的點(diǎn)突變使得O6抗原多糖側(cè)鏈很短，由單個(gè)寡糖骨架“重復(fù)單位”組成O6抗原，其低聚糖骨架直接與“重復(fù)單位”相連，而不與長鏈多糖相連［3］。這種古怪脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)結(jié)構(gòu)決定了 EcN的菌落半粗糙表型(圖1)，又稱為半粗糙 O6-LPS表型。這種表型決定了EcN的血清敏感性和免疫調(diào)節(jié)性［4］。EcN具有K5型莢膜(圖1)，在與腸上皮細(xì)胞相互作用時(shí)，K5型莢膜產(chǎn)生特異性趨化因子反應(yīng)［4］。EcN基因組編碼F1A、F1C和卷曲菌毛(圖1)，這3種菌毛替代了P-和S-菌毛(具有血凝反應(yīng)因子，是致病大腸桿菌代表性特征)［4-5］。

雖然EcN血清型為 O6∶K5∶H1，但無致病性。而與尿道感染相關(guān)的大腸桿菌菌種血清型也為O6∶K5∶H1，卻具有致病性。原因在于EcN基因組缺少其他大腸桿菌的毒力因子致病基因［3］。EcN適應(yīng)性因子位于基因組的4個(gè)染色體組小島上，有助于定植于宿主(圖1)。

EcN最大的特點(diǎn)是具有獲取鐵營養(yǎng)素的多重機(jī)制(圖1)。EcN的6種鐵攝取系統(tǒng)能產(chǎn)生鐵螯合劑腸菌素、桿菌素、產(chǎn)氣菌素、鐵攝取有關(guān)氣菌素、枸櫞酸鐵運(yùn)輸系統(tǒng)和儲(chǔ)血紅素運(yùn)輸場所，有利于其利用環(huán)境中的 Fe3+［3，6］。EcN 具有氯高鐵血紅素和檸檬酸鹽依賴性鐵攝取系統(tǒng)［7］。EcN能產(chǎn)生EfeU［一種氧化酶依賴性鐵轉(zhuǎn)運(yùn)(OFeT)家族的亞鐵系統(tǒng)攝取系統(tǒng)］［8］。EcN也能分泌小菌素M、小菌素H47、溶血素和細(xì)胞毒素壞死因子，從而抑制致病微生物［9］。

圖1 EcN的表型特征及其在基因組上的位置Fig.1 Phenotypical characteristics of EcN and its location in genome［3］

2 EcN的益生機(jī)理

2.1 EcN在腸道中的定植機(jī)制

EcN表達(dá)3種菌毛有利于其定植于腸上皮細(xì)胞，形成生物被膜，最終形成自然屏障來抵御致病菌的入侵［4-5］。EcN的K5型莢膜對黏附和定植起重要作用(圖 2)［10］。K5不產(chǎn)生血清抗性，同時(shí)EcN在血清抗性試驗(yàn)中很快被殺死［11］。EcN表達(dá)的K5型莢膜能在腸上皮細(xì)胞和體內(nèi)鼠小腸中激活Toll樣受體5(TLR5)產(chǎn)生化學(xué)增活素［12-13］。

EcN特有的6種鐵攝取系統(tǒng)有利于其在腸道中定植。EcN能提高豬的小腸鈣網(wǎng)蛋白(calprotectin)，這提示了鈣網(wǎng)蛋白可能在EcN的益生作用中發(fā)揮了作用［14］。EcN能促進(jìn)炎癥腸道中抗菌的脂質(zhì)運(yùn)載蛋白-2(lipocalin-2)和鈣網(wǎng)蛋白高表達(dá)，但EcN的定植和益生功能是否增強(qiáng)有待進(jìn)一步研究。高親和力金屬運(yùn)載體可以增強(qiáng)EcN在炎癥的腸道中的定植力，并為其與包括病原菌在內(nèi)的其他微生物之間競爭提供手段。

研究發(fā)現(xiàn)EcN能分泌抵抗菌物質(zhì)(小菌素H47和小菌素M 等)來抵抗病原體［15］。小菌素是一種低分子質(zhì)量的抗菌肽，類似于革蘭氏陽性桿菌的細(xì)菌素，對于補(bǔ)償免疫蛋白不足的細(xì)菌在種族發(fā)育中發(fā)揮了有力的殺菌作用［15］。小菌素H47和小菌素M與鐵螯合劑salmochelin結(jié)合，并為受體所感應(yīng)，從而展示一種進(jìn)入菌體的“Trojan horse”機(jī)制(圖 2)［6，16］。因此小菌素 H47 和小菌素M可增強(qiáng)EcN與腸道中其他微生物之間的競爭力。

圖2 益生菌EcN所具備的多種適應(yīng)性因子Fig.2 The multiple fitness factors of probiotic EcN［16］

2.2 提高黏膜屏障

EcN通過鞭毛蛋白經(jīng)核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)和AP-1-依賴性途徑產(chǎn)生人抗菌肽β-防御素2(β-defensin 2)，從而增強(qiáng)結(jié)腸上皮細(xì)胞化學(xué)防御(圖 3)［14，17-18］。通過上調(diào)腸上皮細(xì)胞緊密連接蛋白 ZO-2水平，EcN 能提高黏膜屏障(圖 3)［19］。EcN能阻礙致腸病的大腸桿菌感染引起ZO-2表達(dá)下降。EcN通過上調(diào)閉鎖小帶(OZ-1、OZ-2)的表達(dá)，增強(qiáng)腸上皮細(xì)胞的緊密連接，減少因?yàn)槟c漏引起的細(xì)菌異位與代謝產(chǎn)物穿過腸上皮細(xì)胞［20］。

2.3 調(diào)節(jié)致炎和抗炎細(xì)胞因子之間的平衡

EcN能下調(diào)炎癥，研究發(fā)現(xiàn)EcN具有調(diào)節(jié)致炎和抗炎的局部細(xì)胞因子的平衡(圖3)［21-22］。體外試驗(yàn)表明，EcN的生物學(xué)功能與在腸道微生物的調(diào)控和腸內(nèi)細(xì)胞因子引起免疫反應(yīng)相關(guān)聯(lián)［23］。EcN抑制炎癥反應(yīng)維持腸道免疫穩(wěn)態(tài)的機(jī)理之一在于EcN能通過激活T細(xì)胞誘導(dǎo)天生性和記憶性外周血CD4+T細(xì)胞同源細(xì)胞的生長(圖3)［24］。EcN也能加速γδT細(xì)胞周期和細(xì)胞因子分泌(圖3)。γδT細(xì)胞的激活和脫噬作用是限制腸道炎癥的一種可能方式［25］。在變應(yīng)原誘導(dǎo)的Th2反氣管炎癥，EcN被發(fā)現(xiàn)通過誘導(dǎo)不產(chǎn)生免疫球蛋白E(IgE)的 Th1模型來減輕癥狀［26］。許多研究發(fā)現(xiàn)，EcN通過提高分泌型免疫球蛋白A(sIgA)［2］，改變致炎和抗炎細(xì)胞因子［27-28］及調(diào)節(jié)T細(xì)胞的分化［29］來進(jìn)行免疫調(diào)控。EcN能減少試驗(yàn)小鼠大腸桿菌數(shù)量，降低通過 Toll樣受體 4(TLR4)和TLR5產(chǎn)生的炎癥細(xì)胞因子和干擾素-γ(IFN-γ)(圖3)［30］?？诜﨓cN能產(chǎn)生黏膜特異性免疫球蛋白G(IgG)與免疫球蛋白M(IgM)抗體而誘導(dǎo)嬰兒體液免疫(圖3)［31］。EcN的免疫調(diào)控作用也被發(fā)現(xiàn)在結(jié)腸上皮細(xì)胞，EcN提取物能促進(jìn)細(xì)胞白介素-8(IL-8)的分泌［2］，降低結(jié)腸致癌指示物環(huán)氧酶-2(COX-2)和前列腺素E2(PGE2)的表達(dá)水平(圖 3)［32］。

3 EcN在仔豬方面的應(yīng)用現(xiàn)狀

3.1 在腸道黏膜屏障方面

Kleta等［33］從仔豬腸內(nèi)容物中篩選到EcN，證實(shí)了EcN也存在于豬小腸中，表明EcN是豬腸道微生物的一部分。同時(shí)Kleta等［33］研究了EcN對仔豬腸相關(guān)淋巴組織的影響，試驗(yàn)中采用109和1011CFU/d EcN飼喂仔豬21 d，定量分析了腸免疫細(xì)胞(粒性白細(xì)胞、肥大細(xì)胞 CD4+、CD8+、CD25+、IgA+淋巴細(xì)胞)的數(shù)量和分布及黏膜細(xì)胞因子［IFN-γ、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、轉(zhuǎn)化生子因子-β(TGF-β)、細(xì)胞白介素-10(IL-10)］和抗菌肽 (PR-39、NK-lysin、pre-defensin-β1、protegrins)mRNA的表達(dá)水平，結(jié)果表明，各組中腸免疫細(xì)胞(粒性白細(xì)胞、肥大細(xì)胞 CD4+、CD8+、CD25+和IgA+淋巴細(xì)胞)的數(shù)量和分布小腸與結(jié)腸存在較大的差異，低劑量EcN各組間差異不顯著，高劑量EcN(1011CFU/d)使結(jié)腸升段黏膜CD8+細(xì)胞數(shù)量顯著增加。mRNA分析表明，飼喂EcN對黏膜細(xì)胞因子(IFN-γ、TNF-α、TGF-β、IL-10)和抗菌肽(PR-39、NK-lysin、pre-defensin-β1、protegrins)mRNA的表達(dá)水平無顯著影響，EcN對健康仔豬腸免疫細(xì)胞的分布影響較小。EcN的預(yù)防作用可能與除腸免疫細(xì)胞的分布的單一調(diào)節(jié)以外的其他機(jī)制有關(guān)。仔豬口服109CFU/d的EcN不會(huì)引起小豬結(jié)腸炎和泌尿生殖器感染［34］。唐志如等［35］研究發(fā)現(xiàn)，在大腸桿菌Abbottstown攻毒的斷奶仔豬中，口服1010CFU/d的EcN顯著下調(diào)空腸黏膜雙鏈RNA依賴的蛋白質(zhì)激酶(PKR)、真核生物翻譯起始因子5A(eIF-5A)和TLR2 mRNA相對表達(dá)豐度，顯著降低空腸黏膜淋巴細(xì)胞數(shù)量，顯著提高空腸黏膜occludin蛋白水平，顯著上調(diào)空腸黏膜胰島素樣生長因子-Ⅰ(IGF-Ⅰ)、肝細(xì)胞生長因子(HGF)、三葉草肽-3(TFF-3)和表皮生長因子(EGF)mRNA相對表達(dá)豐度，提示EcN能維持腸道功能完整性，并保護(hù)腸道屏障。

圖3 益生菌EcN對宿主免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)途徑Fig.3 The probiotic EcN modulates the host immune system in multiple ways［31］

3.2 在促進(jìn)生長與治療腹瀉方面

EcN對傳染性腹瀉具有良好的治療效果。Duncker等［36］對EcN預(yù)防21日齡斷奶仔豬急性分泌性腹瀉進(jìn)行研究，試驗(yàn)分為以下4組:1組［-腸毒性大腸桿菌(EcA)/-EcA，n=6］、2組(-EcN/+EcA，n=7)、3 組(+EcN/-EcA，n=4)和4組(+EcN/+EcA，n=4);將 1010CFU/d EcA 和EcN通過口胃管飼喂21日齡斷奶仔豬，攻毒48 h后，屠宰取空腸上皮置于Ussing chambers上測定空腸上皮電生理的參數(shù)的變化，結(jié)果表明，EcN預(yù)處理后的仔豬能完全控制仔豬急性分泌性腹瀉。唐志如等［35］研究發(fā)現(xiàn)，在大腸桿菌Abbottstown攻毒的斷奶仔豬中，口服1010CFU/d的EcN能顯著降低腹瀉率，顯著改善生長性能。Splichalova等［37］研究發(fā)現(xiàn)，豬感染沙門氏菌后血漿中 IL-10、TNF-α和腸道TNF-α濃度顯著增加，但在感染沙門氏菌前口服 EcN，血漿中IL-10、TNF-α和腸道TNF-α濃度無顯著影響，這提示了EcN能競爭性阻礙沙門氏菌的入侵。Schroeder等［38］研究表明提前口服EcN能預(yù)防斷奶仔豬受產(chǎn)毒型大腸桿菌的感染。

4 小結(jié)

EcN由于其特殊的基因型，決定了其半粗糙O6-LPS 表型、O6∶K5∶H1F1A 的血清型、特殊的菌毛與莢膜、適應(yīng)性因子和鐵攝取系統(tǒng)，從而使得EcN在腸道中具有穩(wěn)定定植機(jī)制和免疫調(diào)節(jié)功能。以仔豬為對象的研究發(fā)現(xiàn)口服EcN能維護(hù)腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)，提高腸黏膜緊密連接性，維持腸道功能完整性，保護(hù)腸道屏障，進(jìn)而提高斷奶仔豬生長性能和降低斷奶仔豬腹瀉率。

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