飼糧硝酸鉀對湖羊瘤胃硝態(tài)氮濃度和瘤胃發(fā)酵特性的影響

林 淼 張建剛 王 嚴 姚文成 趙國琦

(揚州大學(xué)動物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，揚州 225009)

反芻動物飼糧氮的來源主要包括真蛋白氮和非蛋白氮，其中非蛋白氮包括硝態(tài)氮、胺類、氨化物、氨基酸氮和尿素氮等。硝態(tài)氮能夠在一定程度上替代尿素和真蛋白質(zhì)飼料，降低飼養(yǎng)成本。國內(nèi)外研究表明，反芻動物飼糧中可以用硝酸鹽)替代尿素和真蛋白質(zhì)飼料作為瘤胃氮來源，同時減少甲烷的生成，改變瘤胃發(fā)酵模式，提高瘤胃微生物氮合成量［1－7］。由于反芻動物復(fù)雜的瘤胃內(nèi)環(huán)境及體外培養(yǎng)法的條件限制，對動物瘤胃發(fā)酵特性的影響仍限于模型模擬，且已有的報道結(jié)果并不一致，因此該模型尚不能準確代表對瘤胃液pH、氨態(tài)氮(NH3-N)產(chǎn)量、揮發(fā)性脂肪酸(VFA)濃度、微生物蛋白質(zhì)產(chǎn)量等影響程度的實際數(shù)據(jù);此外，動物采食后，其瘤胃液和亞硝酸鹽()濃度隨時間的變化趨勢仍有待深入研究。為此，本試驗旨在通過對湖羊直接飼喂不同水平的硝酸鉀(KNO3)，采集各時間點的瘤胃液，研究濃度的動態(tài)變化規(guī)律及其對瘤胃發(fā)酵參數(shù)、血液指標等的影響，探討對反芻動物瘤胃代謝的影響，為生產(chǎn)實踐中合理有效地添加提供一定參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗動物及試驗設(shè)計

采用單因子試驗設(shè)計，選取9頭體況良好、體重相近［(35.0±3.0)kg］、安裝永久性瘤胃瘺管的湖羊，隨機分為3組，每組3頭，分別飼喂含0(對照組)、0.5%、1.0%KNO3的飼糧。適應(yīng)期 30 d，之后為3 d采樣期。

1.2 試驗飼糧及飼養(yǎng)管理

表1 試驗飼糧組成及營養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))Table 1 Composition and nutrient levels of experimental diets(DM basis) %

1.3 樣品的采集與分析

1.3.1 樣品采集及測定指標

適應(yīng)期內(nèi)為達到最終添加濃度，采用逐級遞增的添加方式，每隔5 d升高1個KNO3的梯度，直至分別保持0.5%、1.0%的添加水平。采樣期內(nèi)分別于晨飼后 0、0.5、1、1.5、2、4、6、8 h 通過真空負壓裝置，從瘤胃上下左右不同位點采集約30 mL瘤胃液，經(jīng)4層紗布過濾，立即采用pHS－3C型pH計測定其 pH，之后分裝于10 mL離心管中，－20℃冰箱中保存待測其他指標。采樣期每日晨飼后2 h，頸靜脈采血，分裝，一份加入抗凝劑，待測血液高鐵血紅蛋白濃度;另一份靜止30 min，待析出血清時，3 000 r/min離心10 min，吸取上清液，置于－20℃冰箱保存，待測血清生化指標。

1.3.2 指標測定方法

1)NH3-N濃度:采用酚－次氯酸鈉比色法［8］。

2)微生物蛋白質(zhì)濃度:對 Hall等［9］的方法改進，采用差速離心法，取4 mL瘤胃液放入5 mL的離心管中，離心10 min(500 r/min)，沉淀為原蟲，上清液轉(zhuǎn)移到5 mL離心管中;將裝有上清液的5 mL離心管再經(jīng)過15 min離心(12 000 r/min)，沉淀為細菌;然后分別將兩者的沉淀加4 mL 10%三氯乙酸(TCA)，混合均勻，置室溫30 min，沉淀蛋白質(zhì);在沉淀中加入4 mL 5%氫氧化鈉(NaOH)溶解;離心10 min(4 000 r/min)，取上清液;以5%NaOH作空白，用756型紫外分光光度計測定280和260 nm處的吸光度。

計算公式:蛋白質(zhì)濃度(mg/mL)=(1.45A280－0.74A260)×稀釋倍數(shù)。

3)VFA濃度:發(fā)酵液經(jīng)10 000 r/min離心10 min，取上清液 1 mL，加 0.2 mL 20%的偏磷酸(含60 mmol/L巴豆酸)，10 000 r/min再次離心15 min，取上清液1μL，以巴豆酸為內(nèi)標物，采用日本島津GC－14B氣相色譜儀測定乙酸、丙酸、丁酸和總揮發(fā)性脂肪酸(TVFA)濃度［10］。測定條件:毛細管柱CP-WAX(柱長30 m，內(nèi)徑0.53 mm，膜厚 1 μm);載氣為高純 N2(壓力 0.7 MPa，流量30 mL/min);燃氣為 H2(流量30 mL/min);氣化室溫度200℃，火焰離子化檢測儀(FID)檢測器溫度200℃;柱溫采用程序升溫法，初溫100℃，末溫130℃，升溫速率3℃/min，靈敏度為10，衰減為25。

6)血液指標:血清生化指標由全自動生化分析儀測定;血液高鐵血紅蛋白濃度按照Benesch等［12］的方法進行。

1.4 統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)采用 Excel軟件整理，采用 SPSS 13.0軟件的one-way ANOVA進行方差分析，并用Duncan氏法進行差異顯著性比較，結(jié)果以“平均值±標準差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 湖羊瘤胃液和濃度的動態(tài)變化

圖1 湖羊瘤胃液和濃度的動態(tài)變化Fig.1 Dynamic changes of nitrate and nitrite concentrations in rumen fluid of Hu sheep

圖2 對湖羊瘤胃液p H和NH 3-N濃度的影響Fig.2 Effects of nitrate on pH and NH3-N concentration in rumen fluid of Hu sheep

表2 對湖羊瘤胃液微生物蛋白質(zhì)濃度的影響Table 2 Effects of nitrate on concentration of microbial protein in rumen fluid of Hu sheep mg/mL

表2 對湖羊瘤胃液微生物蛋白質(zhì)濃度的影響Table 2 Effects of nitrate on concentration of microbial protein in rumen fluid of Hu sheep mg/mL

項目Items時間Time/h硝酸鉀添加水平KNO3supplemental level/%0 0.5 1.0 0細菌蛋白BCP 0.55±0.10 0.65±0.21 0.69±0.18 0.5 0.59±0.10 0.71±0.38 0.74±0.02 1 0.69±0.16 0.68±0.14 0.83±0.02 1.5 0.66±0.12 1.08±0.21 0.95±0.09 2 0.66±0.09 0.77±0.30 0.96±0.10 4 0.98±0.01 1.09±0.12 1.05±0.02 6 0.74±0.01 0.78±0.25 0.85±0.58 8 0.91±0.03 0.84±0.30 0.92±0.42 0原蟲蛋白PCP 0.65±0.22 0.69±0.14 0.72±0.12 0.5 0.86±0.32 0.92±0.12 0.96±0.30 1 1.00±0.20 1.03±0.44 1.19±0.03 1.5 0.96±0.15b 1.24±0.04a 1.23±0.28a 2 0.71±0.13 1.04±0.28 0.82±0.09 4 0.67±0.10 0.95±0.07 0.71±0.03 6 1.08±0.08b 1.49±0.25a 1.17±0.19b 8 0.64±0.04 1.05±0.32 1.56±0.51

續(xù)表2

表3 對湖羊瘤胃液VFA濃度的影響Table 3 Effects of nitrate on concentrations of volatile fatty acids in rumen fluid of Hu sheep

表3 對湖羊瘤胃液VFA濃度的影響Table 3 Effects of nitrate on concentrations of volatile fatty acids in rumen fluid of Hu sheep

項目Items時間Time/h硝酸鉀添加水平KNO3supplemental level/%0 0.5 1.0 0 76.98±5.02b 89.05±1.84ab 99.95±10.49總揮發(fā)性脂肪酸TVFA/(mmol/L)a 0.5 81.78±6.40 91.68±6.97 98.83±17.96 1 82.91±3.98 90.67±14.09 107.10±2.78 1.5 90.53±4.35 97.48±6.53 113.19±25.65 2 104.91±1.27 115.89±17.80 119.73±24.32 4 91.76±0.66c 116.59±0.83a 109.88±1.77b 6 96.99±0.52 111.97±13.05 103.65±12.95 8 70.37±3.44b 90.72±1.55a 94.28±3.28 0乙酸Acetate/(mmol/L)a 53.33±4.95b 59.96±9.05ab 79.56±6.62a 0.5 59.38±5.50 70.00±5.55 79.96±17.16 1 60.07±1.09b 69.41±10.03ab 82.44±2.20a 1.5 65.92±2.93 73.09±4.77 89.47±20.08 2 76.55±0.72 86.55±11.59 96.10±23.22 4 64.50±0.45b 86.03±0.29a 87.53±3.94a 6 68.66±0.28 82.78±12.44 79.24±11.53 8 50.49±1.41c 66.99±0.25b 75.74±1.19a 0丙酸Propionate/(mmol/L)14.35±0.88 16.83±4.72 14.78±2.92 0.5 13.68±1.12 13.38±0.40 13.67±0.73 1 14.01±0.65 13.57±2.63 16.99±0.32 1.5 14.78±0.16 15.12±1.42 16.61±4.02 2 16.41±0.45 18.27±3.80 16.81±1.21 4 15.76±0.14 18.51±1.04 16.34±1.53 6 16.45±0.09 17.38±1.40 16.82±0.49 8 11.94±0.59 14.07±0.16 13.23±1.48

續(xù)表3

表4 對湖羊血液指標的影響Table 4 Effects of nitrate on blood indices of Hu sheep

表4 對湖羊血液指標的影響Table 4 Effects of nitrate on blood indices of Hu sheep

項目Items硝酸鉀添加水平KNO3supplemental level/%0 0.5 1.0總蛋白TP/(g/L)71.53±4.48 68.30±3.32 71.13±2.40白蛋白 ALB/(g/L) 34.10±3.96 33.68±1.75 34.03±2.39球蛋白 GLB/(g/L) 37.43±3.55 34.63±4.64 37.10±0.56葡萄糖 GLU/(mmol/L) 3.99±0.63 3.89±0.56 4.14±0.05尿素氮 UN/(mmol/L) 5.78±0.80 5.80±0.88 5.47±0.33甘油三酯 TG/(mmol/L) 0.35±0.09 0.21±0.10 0.28±0.07總膽固醇 TCH/(mmol/L) 2.10±0.30 1.94±0.36 1.82±0.40高鐵血紅蛋白BM/% ＜0.1 ＜0.1 ＜0.1

3 討論

各組的pH變化在正常范圍內(nèi)(6.55～7.09)，喂后2、6、8 h的1.0%組pH顯著高于對照組，其他時間點3個組間無顯著差異。結(jié)果與Guo等［4］類似，但與其他結(jié)果不同。Phuc等［14］研究指出，給每頭山羊每天飼喂 0、2、4、6 g 的 KNO3，對瘤胃液pH仍無顯著影響。代俊芳等［7］通過體外法發(fā)現(xiàn)在飼糧中添加含不同比例硝態(tài)氮的顆粒料未對瘤胃液pH產(chǎn)生顯著影響。Lin等［2，15］比較不同氮源和適應(yīng)前后的體外瘤胃pH均無顯著差異。與前人研究結(jié)果不同的可能原因是本試驗采用活體研究且添加水平與前人略有不同。

從發(fā)酵時間來看，NH3-N濃度的變化主要是由于飼糧中含氮物質(zhì)不斷降解產(chǎn)生氨，導(dǎo)致NH3-N濃度快速上升;之后瘤胃微生物以氨為原料合成細菌蛋白，導(dǎo)致NH3-N濃度逐漸下降。Sar等［16］報道，當(dāng)綿羊飼糧組成為提摩西草∶苜蓿干草∶精料=400∶400∶200時，按每頭綿羊每 kg代謝體重(BW0.75)添加 1.3 g 硝酸鈉(NaNO3)，也引起了NH3-N濃度的增加。同時，1.0%組顯著高于對照組，這與Kemp等［17］研究結(jié)果相近。

本試驗關(guān)于VFA濃度的結(jié)果與 Guo等［4］研究結(jié)果相近，表明的添加使得瘤胃發(fā)酵模式更傾向于乙酸發(fā)酵，可能是由于還原過程中改變了瘤胃微生物的某些代謝途徑，在一定程度上阻斷了乙酸向丙酸合成的過程［12］;或者是的快速降解使得電子從丁酸形成轉(zhuǎn)移到還原的方向［2］。但也有報道認為可以提高瘤胃液丙酸和丁酸產(chǎn)量，使發(fā)酵模式更傾向于丙酸發(fā)酵［6］。差異的原因可能是不同試驗中采用的試驗方法的添加水平以及動物的耐受程度不同。

本試驗中發(fā)現(xiàn)各組間血清生化指標差異不顯著，說明1.0%的添加水平不影響湖羊的代謝。同時，各組均未檢測到高鐵血紅蛋白濃度(＜0.1%)，可能是由于添加水平較低。

4 結(jié)論

① 在湖羊飼糧中添加KNO3，瘤胃液和濃度分別在1和2 h達到最大值，喂后6～8 h趨近于0。

② 與對照組相比，1.0%組的喂后2、6和8 h的pH顯著提高，1、1.5和2 h的氨態(tài)氮濃度顯著增加;同時，喂后1.5 h原蟲蛋白和總微生物蛋白質(zhì)濃度及喂后4、8 h乙酸和總揮發(fā)性脂肪酸的濃度顯著提高，喂后 0.5 h、2～6 h丁酸濃度顯著降低，瘤胃發(fā)酵模式傾向于乙酸發(fā)酵。

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