沙棘嫩枝葉對綿羊瘤胃發(fā)酵特性和血清免疫指標(biāo)的影響

劉艷豐 唐淑珍 張文舉 侯廣田*

黃仁慧3 聶存喜2 王文奇1

(1.新疆畜牧科學(xué)院飼料研究所，烏魯木齊 830000;2.石河子大學(xué)動物科技學(xué)院，石河子 832000;3.新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)第二師鐵門關(guān)市畜牧獸醫(yī)站，鐵門關(guān) 841005)

沙棘是一種落葉性灌木，為胡頹子科沙棘屬，是藥食同源植物。沙棘枝葉含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)和生物活性物質(zhì)，沙棘黃酮為其主要活性成分。中國沙棘葉中黃酮含量為86.7 mg/kg，比果實含量高 2.4倍，而且海拔越高，黃酮含量越高［1］。沙棘黃酮具有增強(qiáng)機(jī)體免疫功能的作用，還具有抗炎、抗病毒、抗過敏、抗疲勞等其他作用［2］。大量研究表明，在飼養(yǎng)動物飼糧中應(yīng)用沙棘葉或沙棘葉黃酮，可以促進(jìn)和調(diào)節(jié)生長發(fā)育［3－6］，提高飼料報酬［7］，增強(qiáng)機(jī)體抗病能力，增強(qiáng)機(jī)體免疫性能［8］。另外，沙棘枝葉來源廣，價格低廉，易加工、貯藏和運輸，適合用作飼料添加劑［9］。瘤胃發(fā)酵產(chǎn)生的揮發(fā)性脂肪酸(VFA)是反芻動物重要的能量來源，約占反芻動物能量吸收總量的70%～80%［10］。為此，本試驗通過在阿勒泰羊飼糧中添加不同比例的沙棘嫩枝葉，研究其對綿羊瘤胃發(fā)酵特性及血清免疫指標(biāo)的影響，以期為沙棘嫩枝葉在綿羊飼糧中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

沙棘嫩枝葉采自新疆維吾爾自治區(qū)青河縣，為枝桿直徑少于1 cm沙棘嫩枝條;自然晾干。沙棘嫩枝葉的干物質(zhì)、粗蛋白質(zhì)、粗脂肪、粗灰分、中性洗滌纖維、酸性洗滌纖維、鈣、總磷含量分別為92.62%、11.73%、5.04%、9.14%、29.94%、20.34%、0.41%、0.18%，總能 15.70 MJ/kg，以上測定結(jié)果均為風(fēng)干基礎(chǔ)。

1.2 試驗設(shè)計和飼糧

采用單因素隨機(jī)區(qū)組試驗設(shè)計，選擇體重為(28.0±3.5)kg 的阿勒泰羔羊 60 只，隨機(jī)分成 4組，每組3個重復(fù)，每個重復(fù)5只，重復(fù)之間體重接近。對照(Con)組飼喂基礎(chǔ)飼糧，試驗組以2.5%(SJZY-1 組)、5.0%(SJZY-2 組)和 7.5%沙棘嫩枝葉(SJZY-3組)等量替換基礎(chǔ)飼糧中麥秸。試驗期63 d，其中預(yù)試期7 d，正試期56 d。參照我國《肉羊飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)》(NY/T 816—2004)［11］及試驗羊場的常用飼糧配方，配制育肥羊的全混合粉狀飼料。試驗飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1。

表1 試驗飼糧組成及營養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))Table 1 Composition and nutrient levels of experimental diets(air-dry basis) %

1.3 飼養(yǎng)管理

試驗前對羊舍進(jìn)行消毒。試驗羊按重復(fù)群飼，預(yù)試期按組打好耳號，免疫注射羊痘、口蹄疫和三聯(lián)四防苗，并進(jìn)行驅(qū)蟲。日喂2次，分別為每天的08:00和19:00，每次以吃飽剩料約10%為準(zhǔn)，自由飲水。其他飼養(yǎng)管理措施和免疫接種按羊場的常規(guī)程序進(jìn)行。在預(yù)試期內(nèi)試驗組由基礎(chǔ)飼糧逐漸過渡到試驗飼糧。試驗期間羊舍內(nèi)溫度和濕 度分 別為 (15.78±0.61)℃ 和 (60.12±1.80)%。

1.4 樣本采集與制備

在正試期第56天當(dāng)日早晨空腹，分別從各組每個重復(fù)隨機(jī)選取2只，即每組6只，共24只試驗羊，頸靜脈采集血樣和利用自制活體瘤胃取樣器抽取瘤胃液約50 mL。

用真空采血管頸靜脈采血5 mL，靜置10 min后，于2 700×g離心15 min，分離血清分裝于 Eppendorf管中，置于－20℃冷凍保存，用于血清免疫指標(biāo)的測定。

采集的瘤胃液迅速測定pH，用4層乳酪布過濾，部分2 700×g 離心15 min，取0.5 mL 上清液用來測定氨態(tài)氮(NH3-N)濃度;另取10 mL上清液加25%的偏磷酸1 mL，放入液氮中帶回實驗室，置于－70℃冷凍保存，待測定VFA濃度。

1.5 指標(biāo)檢測及方法

1.5.1 生長性能的測定

試驗過程詳細(xì)觀察與記錄試驗羊的健康和生長狀況，分別在預(yù)試期、正試期第1和56天，以個體為單位對所有試驗羊進(jìn)行空腹稱重，試驗過程以重復(fù)為單位詳細(xì)記錄采食量，計算平均日增重、平均日采食量。營養(yǎng)水平的測定均采用國標(biāo)或行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)方法，GB/T 6435—1986測定干物質(zhì)含量，GB/T 6432—1994測定粗蛋白質(zhì)含量，GB/T 6433—2006測定粗脂肪含量，GB/T 6438—1992測定粗灰分含量，GB/T 20806—2006測定中性洗滌纖維含量，NY/T 1459—2007測定酸性洗滌纖維含量，GB/T 6436—2002測定鈣含量，GB/T 6437—2002測定總磷含量，GB/T 5009.10—2003測定粗纖維含量。氧彈式熱量計法測定總能。

1.5.2 瘤胃液 pH

瘤胃液pH用便攜式pH計測定。

1.5.3 瘤胃液 VFA 濃度

瘤胃液VFA濃度的測定參照秦為琳［12］的方法進(jìn)行。

色譜條件:安捷倫6890N氣相色譜儀，配氫火焰離子化檢測器(FID)。進(jìn)樣口溫度250℃，分流進(jìn)樣，分流比為10∶1，進(jìn)樣量1μL。色譜柱 DBWAX 石英毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，載氣流量1.2 mL/min。程序升溫為120℃保持1 min，以5℃/min的速率升至200℃，F(xiàn)ID溫度300℃，氫氣流量 40 mL/min，空氣流量400 mL/min，尾吹流量 30 mL/min。

1.5.4 瘤胃液 NH3-N 濃度

瘤胃液NH3-N濃度用酚－次氯酸鈉比色法［13］測定。

1.5.5 血清免疫因子濃度

血清CD4、白細(xì)胞介素1(IL-1)、白細(xì)胞介素2(IL-2)、γ干擾素(γ-IFN)濃度采用綿羊?qū)Ｓ迷噭┖?美國Blue Gene公司)進(jìn)行測定，檢測儀器為Varioskan Flash全波長多功能酶標(biāo)儀(美國Thermo公司)。

1.6 數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)用Excel 2007初步整理和計算后，采用SPSS 19.00統(tǒng)計軟件中ANOVE進(jìn)行單因子方差分析，并進(jìn)行Duncan氏法多重比較，以 P＜0.05、P＜0.01 為差異顯著、極顯著的判斷標(biāo)準(zhǔn)。結(jié)果表示以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 沙棘嫩枝葉對綿羊生長性能的影響

由表2可知，各組間初始重、末重和平均日采食量均差異不顯著(P＞0.05)。SJZY-3組平均日增重最高，SJZY-3組、SJZY-1組平均日增重均與Con組差異顯著(P＜0.05)，分別提高 22.58%和21.82%。

2.2 沙棘嫩枝葉對綿羊瘤胃發(fā)酵特性的影響

由表3可知，隨著沙棘嫩枝葉添加量的增加，瘤胃液 pH、乙酸/丙酸和乙酸/總揮發(fā)性脂肪酸(TVFA)、NH3-N濃度呈下降趨勢，乙酸、丙酸、丁酸和TVFA的濃度呈上升趨勢。瘤胃液pH、乙酸/丙酸和乙酸/TVFA組間差異不顯著(P＞0.05)。試驗組乙酸、丙酸、丁酸和TVFA濃度均極顯著高于 Con組(P＜0.01)，SJZY-3 組最高，顯著或極顯著高于其他各組(P＜0.05 或 P＜0.01)。SJZY-2 組和SJZY-3組NH3-N濃度分別顯著(P＜0.05)和極顯著(P＜0.01)低于 Con 組。

表2 沙棘嫩枝葉和沙棘提取物對綿羊生長性能的影響Table 2 Effects of shoots and leaves of sea buckthorn on growth performance of sheep

表3 沙棘嫩枝葉對綿羊瘤胃發(fā)酵特性的影響Table 3 Effects of shoots and leaves of sea buckthorn on rumen fermentation characteristics of sheep

2.3 沙棘嫩枝葉對綿羊血清免疫指標(biāo)的影響

由表4可知，SJZY-3組血清CD4濃度顯著高于 Con組和 SJZY-2組(P＜0.05)，極顯著高于SJZY-1組(P＜0.01)。SJZY-2組血清 IL-1濃度顯著高于 Con組(P＜0.05)，極顯著高于 SJZY-1組(P＜0.01)。SJZY-3組血清 IL-2濃度顯著高于SJZY-1組(P＜0.05)。SJZY-1組血清 γ-IFN 濃度顯著高于 Con 組(P＜0.05)。

表4 沙棘嫩枝葉對綿羊血清免疫指標(biāo)的影響Table 4 Effects of shoots and leaves of sea buckthorn on serum immune indices of sheep

3 討 論

3.1 沙棘嫩枝葉對綿羊生長性能的影響

本試驗中用沙棘嫩枝葉等量替換麥秸后，平均日增重顯著比對照組高。沙棘枝葉提高綿羊生產(chǎn)性能的作用與其富含的營養(yǎng)物質(zhì)和生物活性成分密切相關(guān)。沙棘嫩枝葉的粗蛋白質(zhì)含量達(dá)11.73%，優(yōu)于麥草和玉米秸等，同時，沙棘葉還富含大量的沙棘黃酮、微量元素、氨基酸和維生素(其中維生素 C含量為1 270 mg/kg)［14］等，這些物質(zhì)對動物的生長和發(fā)育具有良好的促進(jìn)作用。郭福存等［4］研究表明，每只奶山羊添加飼喂25 g/d沙棘葉，可提高產(chǎn)奶量6.24%，提高飼料轉(zhuǎn)化率6.14%;添加飼喂50 g/d沙棘葉，可使奶山羊產(chǎn)奶量提高6.88%。邵淑麗等［15］研究表明，5%沙棘嫩枝葉可使雞對飼糧中蛋白質(zhì)利用率提高6.82%，平均日增重提高5.50%，飼料報酬提高19.48%。本試驗中，飼糧添加7.5%沙棘嫩枝葉可顯著提高綿羊平均日增重，提高了22.58%。與習(xí)文東等［16］報道基本一致。而程文杰等［7］在綿羊飼糧中添加500 g/d沙棘嫩枝葉，對試驗羊的采食量、平均日增重沒有影響，可能與飼喂量較大，而枝葉有酸澀味有關(guān)。綜合前人研究成果，飼糧添加適量沙棘枝葉在反芻動物和蛋雞中應(yīng)用效果都優(yōu)于常規(guī)飼料。

3.2 沙棘嫩枝葉對綿羊瘤胃發(fā)酵特性的影響

瘤胃液pH是反映反芻動物瘤胃發(fā)酵狀態(tài)最直觀的一項指標(biāo)，可以綜合反映瘤胃微生物、代謝產(chǎn)物、有機(jī)酸的產(chǎn)生、吸收、排除及中和的狀況，穩(wěn)定的pH對維持瘤胃內(nèi)環(huán)境具有主導(dǎo)作用。保持pH在一個正常的范圍是確保瘤胃正常發(fā)酵的前提［17］，本試驗中，添加沙棘嫩枝葉后 pH 在 6.25～6.45，相對恒定，沙棘嫩枝葉對綿羊瘤胃液pH沒有顯著的影響。

瘤胃內(nèi)VFA濃度和比例是綿羊瘤胃發(fā)酵的重要指標(biāo)，能夠反映瘤胃內(nèi)部的環(huán)境狀況及飼料在瘤胃內(nèi)的發(fā)酵程度和模式［18］。乙酸、丙酸和丁酸占到TVFA的95%以上，其濃度和比例是反映瘤胃消化代謝活動的重要指標(biāo)。乙酸是重要的中間代謝產(chǎn)物，是體內(nèi)許多重要物質(zhì)的前體物，其作為葡萄糖前體物對反芻動物是非常重要的。在飼糧中添加沙棘嫩枝葉使VFA濃度顯著增加，表明沙棘嫩枝葉對瘤胃微生物類群數(shù)量或者代謝能力有一定程度的提高。瘤胃液VFA濃度與瘤胃微生物對飼糧中碳水化合物的降解有密切關(guān)系。本試驗結(jié)果表明，飼糧中添加沙棘嫩枝葉可提高瘤胃液VFA濃度，說明沙棘嫩枝葉能夠提高飼糧中碳水化合物在瘤胃中的降解程度。

丙酸是反芻動物體內(nèi)糖異生的重要前體物質(zhì)。本試驗中，飼糧中添加沙棘嫩枝葉能夠提高瘤胃液丙酸濃度，而且瘤胃液乙酸濃度并不是因丙酸濃度的增加而降低，乙酸/丙酸有下降趨勢，從側(cè)面說明丙酸產(chǎn)生菌受到的刺激效應(yīng)要大于乙酸產(chǎn)生菌，進(jìn)一步表明綿羊飼糧中添加了沙棘嫩枝葉促進(jìn)乙酸和丙酸的代謝。

瘤胃內(nèi)的NH3-N是瘤胃微生物合成菌體蛋白的原料。其濃度反映了瘤胃內(nèi)微生物氮的供應(yīng)狀況。瘤胃內(nèi)NH3-N濃度較低，表明瘤胃微生物合成作用較強(qiáng)。本試驗中隨著飼糧沙棘嫩枝葉添加量的增加，NH3-N濃度降低，表明沙棘嫩枝葉有促進(jìn)瘤胃微生物合成的作用。

3.3 沙棘嫩枝葉對綿羊血清免疫指標(biāo)的影響

細(xì)胞因子具有免疫調(diào)節(jié)作用，而且淋巴細(xì)胞亞群的穩(wěn)定是維持機(jī)體正常免疫調(diào)節(jié)功能所必需的［19］。CD細(xì)胞的數(shù)量直接反映外周免疫器官中總T細(xì)胞的水平，而CD4、CD4/CD8高，表明機(jī)體處于高的免疫狀態(tài)。沙棘的乙醇提取物可恢復(fù)由輻射(60Co-γ)導(dǎo)致的 CD4+/CD8+降低，從而通過調(diào)節(jié)T細(xì)胞亞群對細(xì)胞免疫功能產(chǎn)生特殊的調(diào)節(jié)作用［8］。本試驗結(jié)果表明，添加沙棘嫩枝葉可以顯著提高CD4濃度，可能是由于刺激和促進(jìn)了T細(xì)胞亞群的分泌［20］，從而提高了綿羊的免疫功能。

IL-1是炎癥反應(yīng)早期最具影響的介質(zhì)之一，主要由單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生、釋放。它不僅能夠協(xié)同其他細(xì)胞因子促進(jìn)B、T細(xì)胞活化，而且能夠誘導(dǎo)其他炎性介質(zhì)產(chǎn)生，加強(qiáng)白細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的黏附。本試驗中，沙棘嫩枝葉能夠增加IL-1濃度，而且IL-2、γ-IFN濃度也隨之增加，表明機(jī)體免疫功能得到改善。

IL-2的主要生物活性是促進(jìn)T細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞的增殖，促進(jìn)B細(xì)胞分化和增殖，促進(jìn)抗體生成等。因此IL-2在機(jī)體免疫應(yīng)答、免疫調(diào)節(jié)和抗腫瘤免疫中具有重要作用，是機(jī)體細(xì)胞免疫功能的重要指標(biāo)之一。在斷奶仔豬飼糧中添加0.1%沙棘提取物可以提高血清IL-2、γ-IFN濃度，促進(jìn)免疫器官增重，提高T細(xì)胞中CD4的比例，增強(qiáng)斷奶仔豬的免疫功能［21］。IL-2和 γ-IFN 在促進(jìn)CD4+和CD8+的增殖方面表現(xiàn)出顯著的協(xié)同作用［22］，IL-1 和 γ-IFN 能 促 進(jìn)抗體的生成［23－24］。IL-2誘導(dǎo)產(chǎn)生細(xì)胞毒性T細(xì)胞(TC)也可使致敏的TC活性加強(qiáng)，同樣也可促進(jìn)T輔助細(xì)胞增殖并維持其在體外長期增長，還能顯著增強(qiáng)免疫干擾素和腫瘤壞死因子的生成，增強(qiáng)自然殺傷細(xì)胞和TC的功能［25］。Geetha 等［26］研究發(fā)現(xiàn)，在沒有刀豆蛋白A的情況下，沙棘提取物(100μg/mL)能單獨地刺激IL-2和γ-IFN的產(chǎn)生，能抑制由鉻導(dǎo)致的IL-2和γ-IFN產(chǎn)生量減少。本試驗中，SJZY-3組血清IL-2濃度高于對照組，表明沙棘嫩枝葉能誘導(dǎo)T細(xì)胞增殖，調(diào)控綿羊免疫器官的生長發(fā)育，產(chǎn)生增殖反應(yīng)和分泌細(xì)胞因子，因而自然殺傷活性得到增強(qiáng)，而且促進(jìn)了B細(xì)胞的增殖和巨噬細(xì)胞的活化［27］，這在綿羊的生長發(fā)育過程中，起到了積極的防御和調(diào)控作用，達(dá)到加強(qiáng)機(jī)體整體免疫機(jī)能的作用。

4 結(jié)論

①沙棘嫩枝葉能提高綿羊平均日增重，增加瘤胃液中VFA濃度和降低NH3-N濃度，提高血清CD4、IL-1、IL-2、γ-IFN 濃度。

②綜合考慮，建議沙棘嫩枝葉在綿羊飼糧中以 5.0%～7.5%添加。

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