非離子表面活性劑對(duì)泰樂(lè)菌素效價(jià)和A組分含量的影響

謝文靜，張 萍，石彥鵬

（寧夏泰瑞制藥股份有限公司，銀川750101）

泰樂(lè)菌素，又名泰樂(lè)星，是一類16元大環(huán)內(nèi)酯類畜禽專用抗生素，它的產(chǎn)生菌有弗氏鏈霉菌、龜裂鏈霉菌和吸水鏈霉菌，其中弗氏鏈霉菌是泰樂(lè)菌素的主要產(chǎn)生菌，也是其工業(yè)化生產(chǎn)菌株。泰樂(lè)菌素主要由泰樂(lè)菌素A、脫碳霉糖泰樂(lè)菌素B、大菌素C和雷洛菌素D四種組分構(gòu)成，其中泰樂(lè)菌素A為主要組分，且生物活性最高。細(xì)胞膜不僅是高度選擇性的屏障［1］，把細(xì)胞質(zhì)與外界環(huán)境分隔開(kāi)，使細(xì)胞獲得一個(gè)相對(duì)穩(wěn)定的內(nèi)環(huán)境，而且它在細(xì)胞與環(huán)境之間的物質(zhì)交換、能量轉(zhuǎn)換和信號(hào)傳導(dǎo)等過(guò)程中也起著重要作用［2］。在泰樂(lè)菌素的發(fā)酵過(guò)程中，細(xì)胞膜的通透性是影響菌體對(duì)氧及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)利用的重要因素，對(duì)泰樂(lè)菌素產(chǎn)能及產(chǎn)量的提高有很大的影響。非離子表面活性劑可以增加細(xì)胞膜的通透性［3］，減少氧及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞的傳遞阻力，還可以使胞內(nèi)的目標(biāo)產(chǎn)物釋放到胞外，可減少由于產(chǎn)物積累而造成的產(chǎn)物反饋抑制［4］。因此本文在搖瓶條件下研究了非離子表面活性劑對(duì)泰樂(lè)菌素細(xì)胞生長(zhǎng)和泰樂(lè)菌素效價(jià)及A組分轉(zhuǎn)化的影響，以確定泰樂(lè)菌素發(fā)酵過(guò)程中最佳非離子表面活性劑Tween-20的添加時(shí)間和添加量。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要儀器 紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（T6新世紀(jì)），北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；立式壓力蒸汽滅菌鍋（LDZX-30KBS），上海申安醫(yī)療器械廠；高效液相色譜儀（LC20AG），日本島津公司。

1.1.2 主要試劑 PEG 600，化學(xué)純，Tween-20、L-Met，分析純，均購(gòu)自天津大茂化學(xué)試劑廠；乙腈、甲醇，色譜純，美國(guó)Fisher科技公司。

1.1.3 供試菌株 泰樂(lè)菌素產(chǎn)生菌TLG13-48，由本公司提供。

1.1.4 培養(yǎng)基 種子培養(yǎng)基：豆餅粉、玉米漿為本地農(nóng)副產(chǎn)品，酵母膏購(gòu)自北京奧博星試劑公司，碳酸鈣購(gòu)自甘肅天玉化工廠。裝量30 mL／250 mL，三角瓶。

發(fā)酵培養(yǎng)基：棉籽餅粉購(gòu)自甘肅禾麟，玉米蛋白粉、玉米粉為當(dāng)?shù)剞r(nóng)副產(chǎn)品，碳酸鈣購(gòu)自甘肅天玉化工廠，鹽酸甜菜堿、磷酸氫二氨、氯化鈉、氯化鉀都為分析純?cè)噭?。裝量35 mL／250 mL，三角瓶。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)方法 菌株活化：制備數(shù)支斜面，室溫放置2 d，使斜面表面干燥。取斜面保藏的供試菌株一支，用玻璃棒蘸取孢子，均勻的涂布到已制備好的斜面上，29℃培養(yǎng)8 d，供后續(xù)實(shí)驗(yàn)所用。種子制備：取新鮮斜面一支，用接種鏟接種于種子培養(yǎng)基中，在28℃，200 r／min的條件下培養(yǎng)46 h。發(fā)酵培養(yǎng)：將培養(yǎng)好的種子液接種于發(fā)酵搖瓶中，28 ℃，200 r／min 培養(yǎng)160 h。

1.2.2 分析方法

1.2.2.1 泰樂(lè)菌素標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制［5］精密稱取適量的泰樂(lè)菌素標(biāo)準(zhǔn)品，用純化水稀釋制得1000 U／mL的溶液，分別用純化水稀釋成 700、600、500、400、300 U／mL的標(biāo)準(zhǔn)液，各吸取1 mL加入25 mL的容量瓶，用 0.1 mol／L鹽酸定容，搖勻后靜置。以0.1 mol／L鹽酸做空白對(duì)照試驗(yàn)，用分光光度計(jì)在290 nm處測(cè)量吸光值，以該標(biāo)準(zhǔn)液的濃度為縱坐標(biāo)，吸光值為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖1）。

圖1 泰樂(lè)菌素標(biāo)準(zhǔn)曲線

泰樂(lè)菌素濃度在吸光值為0.3～0.7的范圍內(nèi)線性相關(guān)，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行線性回歸，得到方程：y＝41.715x+0.3159 （R2＝ 0.9949） 。

1.2.2.2 泰樂(lè)菌素效價(jià)測(cè)定［6］取發(fā)酵液5 mL，加入20%硫酸鋁溶液1.5 mL，攪拌，過(guò)濾，根據(jù)估計(jì)效價(jià)稀釋至可檢測(cè)范圍，吸取稀釋過(guò)的溶液1 mL至25 mL容量瓶中，加0.1 mol／L的鹽酸溶液稀釋至刻度，搖勻，以0.1 mol／L的鹽酸溶液做空白對(duì)照，用分光光度計(jì)在290 nm處測(cè)量吸光值，查標(biāo)準(zhǔn)曲線相對(duì)應(yīng)的數(shù)據(jù)乘以稀釋倍數(shù)即可。

1.2.2.3 泰樂(lè)菌素組分測(cè)定［7］HPLC色譜條件：色譜柱 C18 柱（4.6 mm×200 mm，5 μm）；流動(dòng)相0.85 mol／L高氯酸鈉溶液-乙腈（18 ∶13）；檢測(cè)波長(zhǎng) 290 nm；流速 1 mL／min；進(jìn)樣量 10 μL。 用HPLC測(cè)定、計(jì)算萃取分離過(guò)程中溶劑相與水相中的各組分純度與含量。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度的PEG 600對(duì)泰樂(lè)菌素效價(jià)和組分A的影響

2.1.1 搖瓶發(fā)酵0 h時(shí)添加不同濃度的PEG 600對(duì)泰樂(lè)菌素效價(jià)和組分A的影響 以不添加表面活性劑為對(duì)照，不同濃度的PEG 600對(duì)泰樂(lè)菌素效價(jià)及組分的影響結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 搖瓶發(fā)酵0 h添加不同濃度的PEG 600后泰樂(lè)菌素的效價(jià)和組分

由表1可知，搖瓶發(fā)酵0 h時(shí)添加3.0%的PEG 600，效價(jià)提高幅度最大，比對(duì)照提高了11.7%。添加濃度為3.5%的PEG 600，其效價(jià)與對(duì)照基本一致，但組分A提高幅度最大，比對(duì)照提高了9.0%。

2.1.2 搖瓶發(fā)酵50 h時(shí)添加不同濃度的PEG 600對(duì)泰樂(lè)菌素效價(jià)和組分A的影響 發(fā)酵搖瓶培養(yǎng)至50 h時(shí)，添加不同濃度的PEG 600 2 mL，終濃度分別為0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%、3.5%、4%、4.5%、5%，以不添加表面活性劑為對(duì)照，對(duì)泰樂(lè)菌素效價(jià)及組分的影響結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 搖瓶發(fā)酵50 h時(shí)添加不同濃度的PEG 600后泰樂(lè)菌素的效價(jià)和組分

由表2可知，發(fā)酵培養(yǎng)50 h時(shí)添加不同濃度的PEG 600，效價(jià)均有提高，添加濃度為4.0%的PEG 600，效價(jià)提高幅度最大，比對(duì)照提高了20.8%。組分A的含量比對(duì)照均降低，添加濃度為4.0%的PEG 600，組分A下降幅度最大，比對(duì)照降低了27%。

2.2 搖瓶發(fā)酵50 h時(shí)添加不同濃度的L-Met對(duì)泰樂(lè)菌素效價(jià)和組分A的影響 發(fā)酵搖瓶培養(yǎng)至50 h時(shí)，添加不同濃度的L-Met 2 mL，終濃度分別為0.01%、0.05%、0.1%、0.15%、0.2%，以不添加表面活性劑L-Met為對(duì)照，對(duì)泰樂(lè)菌素效價(jià)及組分的影響結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 搖瓶發(fā)酵50 h時(shí)添加不同濃度L-Met后泰樂(lè)菌素的效價(jià)及組分

由表3可知，發(fā)酵培養(yǎng)50 h時(shí)添加不同濃度的L-Met，隨著L-Met濃度的增大，效價(jià)降低，組分A增高。只有0.01%的L-Met能夠提高效價(jià)，比對(duì)照提高了2.3%，但組分A比對(duì)照降低了6.5%。

2.3 搖瓶發(fā)酵50 h時(shí)添加不同濃度的Tween-20對(duì)泰樂(lè)菌素效價(jià)和組分A的影響 發(fā)酵搖瓶培養(yǎng)至50 h時(shí)，添加不同濃度的Tween-20 2 mL，終濃度分別為2.0%、2.5%、3.0%、3.5%、4.0%，以不添加表面活性劑Tween-20為對(duì)照，對(duì)泰樂(lè)菌素效價(jià)及組分的影響結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 搖瓶發(fā)酵50 h時(shí)添加不同濃度的Tween-20后泰樂(lè)菌的效價(jià)和組分

由表4可知，發(fā)酵培養(yǎng)50 h時(shí)添加不同濃度的Tween-20，效價(jià)均比對(duì)照有所提高，其中添加濃度為3.5%時(shí)，效價(jià)提高幅度最大，比對(duì)照提高了53.5%，但組分A的含量比對(duì)照均降低，添加濃度為3.5%時(shí)，組分A下降最大，比對(duì)照下降了42.7%。

3 討論與小結(jié)

非離子表面活性劑可以改變氣-液、液-液及液-固界面性質(zhì)，使其具有起泡、消泡、乳化、分散、滲透、助溶等多方面的性能，因此非離子表面活性劑廣泛應(yīng)用于人類活動(dòng)的各個(gè)領(lǐng)域，從化妝品調(diào)和、食品與飼料加工、皮革制品加工、化學(xué)纖維加工、紡織品印染及整理、醫(yī)藥的加工、礦物浮選、石油開(kāi)采、油品處理、工業(yè)洗滌等各個(gè)工業(yè)部門(mén)，被譽(yù)為“最高效的工業(yè)味精”。

本實(shí)驗(yàn)在泰樂(lè)菌素發(fā)酵中添加非離子型的表面活性劑 PEG 600、Tween-20、L-Met，結(jié)果表明 PEG 600、Tween-20兩種非離子表面活性劑均能促進(jìn)泰樂(lè)菌素效價(jià)的提高，但對(duì)泰樂(lè)菌素組分A的轉(zhuǎn)化有抑制作用；L-Met對(duì)泰樂(lè)菌素產(chǎn)效價(jià)能力有抑制作用，但對(duì)泰樂(lè)菌素A的轉(zhuǎn)化有促進(jìn)作用，可以促進(jìn)大菌素C向泰樂(lè)菌素A的轉(zhuǎn)化。因此，在泰樂(lè)菌素發(fā)酵中添加非離子型表面活性劑主要可以對(duì)菌體細(xì)胞膜的通透性進(jìn)行調(diào)控，以利于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的進(jìn)入或代謝產(chǎn)物的釋放，從而達(dá)到提高產(chǎn)量的目的。

［1］張星元.發(fā)酵原理［M］.北京：科學(xué)出版社，2005：416-417.

［2］劉永康，陳國(guó)民.細(xì)胞膜對(duì)大分子物質(zhì)及顆粒物質(zhì)的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)［J］.現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生.2006，22（5）：674-675.

［3］袁麗紅，周名立，歐陽(yáng)平凱.表面活性劑Tween20對(duì)紫草細(xì)胞生產(chǎn)紫草素的影響［J］.南京化工學(xué)院學(xué)報(bào)，1994，16（3） ： 16-19.

［4］Guo W J， Cande las L G， Kolattukudy PE1.Cloning of a novel constitutively expressed pectatelyase gene pelB from Fusar iumsolanif1 sp1 p is i（Nectria haema tococca， mating type V I）and characterization of the gene product expressed in Pichiapastoris［J］.J Bacteriol，1995， 177（24）： 7070-70771.

［5］石彥鵬，張 麗，張 萍.硫酸亞鐵對(duì)泰樂(lè)菌素發(fā)酵的影響［J］.中國(guó)獸藥雜志，2009，43（6）：30-31.

［6］戚 薇，王建玲，韓英素，等.發(fā)酵液中泰樂(lè)菌素測(cè)定方法的研究［J］.天津輕工業(yè)學(xué)院學(xué)報(bào)，1999，14（1）：1-4.

［7］Klug-Santnera B G， Schnitzhofera W， Vrs anskM， et al.Purificationand characterization of a new b ioscouring pectatelyase from Bacillus pumilus BK［J］.J Biotechno1， 2006， 121：390-401.