環(huán)二鳥苷酸（c-di-GMP）作為潛在免疫佐劑的研究進(jìn)展

叢曉燕，時(shí)建立，孫文博，李 俊，杜以軍，吳家強(qiáng)，陳 蕾，陳 智，王金寶?

（1：山東省農(nóng)科院畜牧獸醫(yī)研究所，濟(jì)南250100；2：山東省畜禽疫病防治與繁育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，濟(jì)南250100）

隨著基因工程亞單位疫苗、合成肽疫苗及DNA疫苗研究的興起，人們發(fā)現(xiàn)新型疫苗有許多優(yōu)點(diǎn)，但它們的抗原高度純化，常常不能誘導(dǎo)產(chǎn)生較強(qiáng)的免疫應(yīng)答，很多情況下，即使接種了疫苗，仍然會(huì)有一定的發(fā)病率或死亡率，因此亟需研發(fā)新的疫苗或者有效地疫苗佐劑以提高疫苗的免疫效果。目前，要使新型疫苗的缺點(diǎn)得到彌補(bǔ)，最常用的方法是以適當(dāng)?shù)淖魟┡c之配合使用。傳統(tǒng)獸用疫苗中常用的佐劑有鋁鹽佐劑和油佐劑，但均存在一定的缺陷，如鋁鹽佐劑其在誘導(dǎo)細(xì)胞毒性T細(xì)胞及Th1型反應(yīng)中作用很有限，同高純度的小分子蛋白抗原共同使用時(shí)不能引起足夠的抗體應(yīng)答，因此鋁鹽在新型疫苗中的佐劑效果較差，但鋁鹽佐劑也是目前應(yīng)用最廣的佐劑［1］。油佐劑疫苗在抗體效價(jià)和免疫持久性方面都優(yōu)于鋁鹽佐劑，但其不良反應(yīng)較嚴(yán)重。如弗氏佐劑在注射后易產(chǎn)生局部持久性潰瘍和肉芽腫。目前的研究熱點(diǎn)細(xì)胞因子［2］、脂質(zhì)體［3］、CpG-ODN 佐劑［4-6］、單磷酰基脂質(zhì) A［7］四類新型獸用疫苗佐劑，是得到學(xué)者們公認(rèn)的毒副作用較小而佐劑作用相對(duì)較好的有應(yīng)用前途的佐劑。此外還有近幾年引起廣泛關(guān)注的細(xì)菌第二信使環(huán)二鳥苷酸與TOLL樣受體［8］，主要是刺激與調(diào)節(jié)機(jī)體先天免疫。環(huán)二鳥苷酸（cyclic diguanylate，c-di-GMP）是細(xì)菌中普遍存在的第二信使分子，參與調(diào)節(jié)多種生理功能，研究發(fā)現(xiàn)環(huán)二鳥苷酸作為免疫調(diào)節(jié)劑作用于真核細(xì)胞可產(chǎn)生很好的免疫調(diào)節(jié)作用，實(shí)驗(yàn)研究表明其有可能成為具有潛力的疫苗佐劑［9］。本文著重介紹環(huán)二鳥苷酸作為免疫佐劑的研究。

1 c-di-GMP的結(jié)構(gòu)與代謝

環(huán)二鳥苷酸是細(xì)菌中保守的第二信使分子，參與調(diào)節(jié)多種生理功能，包括細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)，定置，分化、生物被膜形成、致病因子產(chǎn)生，細(xì)胞間通信等［10］。c-di-GMP是由2分子GTP縮合形成的環(huán)狀二核苷酸，其結(jié)構(gòu)如圖1所示。細(xì)胞內(nèi)c-di-GMP合成與降解代謝分別受二鳥苷酸環(huán)化酶（diguanylate cyclase ，DGC）和磷酸二酯酶（phosphodiesterase，PDE）調(diào)控，DGC和PDE活性中心為GGDEF和EAL結(jié)構(gòu)域，GGDEF結(jié)構(gòu)域能夠?qū)?分子GTPs催化合成一分子c-di-GMP，而EAL結(jié)構(gòu)域能夠?qū)-di-GMP降解為pGpG。

圖1 c-di-GMP的化學(xué)結(jié)構(gòu)及其類似物

2 c-di-GMP的免疫特性與作用機(jī)理

c-di-GMP對(duì)某些嚴(yán)重的細(xì)菌感染有著驚人的保護(hù)效果，Karaolis等［11］利用小鼠模型感染肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae），發(fā)現(xiàn) c-di-GMP通過協(xié)同作用，可顯著降低肺臟中細(xì)菌濃度。該實(shí)驗(yàn)同時(shí)證明，c-di-GMP的抗菌作用，是由于c-di-GMP的免疫調(diào)節(jié)，而非直接的殺菌作用。免疫調(diào)節(jié)作用不僅限于機(jī)體系統(tǒng)免疫反應(yīng)，其在采用滴鼻的免疫方式時(shí)也可產(chǎn)生一系列的免疫調(diào)節(jié)作用，而消滅部分入侵的細(xì)菌。Ogunniyi AD與Yan H在研究以小鼠為模型感染肺炎球菌的治療時(shí)均證明，在滴鼻初始的保護(hù)療效對(duì)呼吸道病原體盡管沒有直接殺菌作用，但能顯著降低肺部的細(xì)菌濃度和減少傳播［12-13］，也間接說明c-di-GMP是通過免疫調(diào)節(jié)作用降低了細(xì)菌的感染。

c-di-GMP可刺激機(jī)體的先天免疫是一種有效的免疫調(diào)節(jié)劑。c-di-GMP確實(shí)有強(qiáng)大的免疫刺激特性，能夠初步刺激人未成熟樹突狀細(xì)胞表面組織相容性復(fù)合物MHCⅡ類抗原的表達(dá)，刺激分子CD 80／CD 86和成熟標(biāo)志CD 83，增加分泌細(xì)胞因子和趨化因子（白細(xì)胞介素-12，干擾素-γ等），調(diào)節(jié)激活正常T細(xì)胞表達(dá)和分泌，并改變表達(dá)趨化因子受體。此外，c-di-GMP可增強(qiáng)細(xì)胞刺激活動(dòng)［12-14］。 Yan H 等［13］證明 c-di-GMP 經(jīng)腹腔注射或滴鼻免疫小白鼠，可誘導(dǎo)單核細(xì)胞、粒性白細(xì)胞、樹突細(xì)胞的聚集、增強(qiáng)T細(xì)胞活化的協(xié)同調(diào)節(jié)因子CD40和CD80的表達(dá)，且c-di-GMP滴鼻免疫小鼠24 h后，肺部樹突狀細(xì)胞數(shù)量明顯增加。

c-di-GMP有很好的免疫保護(hù)效果，但其作用機(jī)理近期才得以初步了解。先天免疫系統(tǒng)組成了機(jī)體對(duì)抗致病菌的第一道防線。當(dāng)有致病菌入侵機(jī)體時(shí)，先天免疫系統(tǒng)中的模式識(shí)別受體可以感受致病菌中的一些核苷酸類的保守結(jié)構(gòu)，從而激活機(jī)體合成多種細(xì)胞因子包括I型干擾素來對(duì)抗病原菌。病原菌侵入機(jī)體細(xì)胞后，在遺傳物質(zhì)復(fù)制的過程中，會(huì)有游離的雙鏈DNA（dsDNA）釋放到胞內(nèi)，而這些外源的DNA會(huì)引起細(xì)胞的免疫反應(yīng)。在這個(gè)過程中，干擾素刺激因子 STING（stimulator of interferon gnens）跨膜蛋白起著重要的作用，它能夠促進(jìn)干擾素的產(chǎn)生，并且在dsDNA從被檢測出到TBK-IRF3的信號(hào)通路中起著連接作用。2011年9月，Burdette等［15］人發(fā)現(xiàn)，STING 在病原菌和病毒感染時(shí)角色不同：既是病原菌所分泌的第二信使c-di-GMP的感受因子（sensor），又是宿主感知病毒核酸產(chǎn)生I型干擾素反應(yīng)的信號(hào)接頭分子（adaptor）。

針對(duì)細(xì)菌的入侵，STING蛋白能夠直接感應(yīng)環(huán)二鳥苷酸的信號(hào)分子，從而激活下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，進(jìn)而產(chǎn)生細(xì)胞因子及其它固有免疫反應(yīng)。2012年，蘇曉東［16］通過對(duì)STING及其與c-di-GMP復(fù)合物結(jié)構(gòu)的解析，非常清楚地展示了STING感受和結(jié)合c-di-GMP的分子機(jī)制，為進(jìn)一步的免疫治療，及c-di-GMP作為疫苗佐劑的開發(fā)應(yīng)用提供了非常重要的線索。同時(shí)，谷立川［17］揭示了先天免疫相關(guān)蛋白STING與細(xì)菌信號(hào)分子c-di-GMP的相互作用關(guān)系，STING以對(duì)稱二體的形式存在，形成一個(gè)適合結(jié)合c-di-GMP的具有對(duì)稱性的疏水腔；結(jié)合c-di-GMP后，STING的一個(gè)單體的β2-β3 loop會(huì)發(fā)生構(gòu)象變化，這個(gè)構(gòu)象變化能夠讓STING二體更緊密地結(jié)合c-di-GMP。這種結(jié)合方式與細(xì)菌蛋白結(jié)合c-di-GMP有著很大差別，前者主要以疏水相互作用為主，而后者則主要通過兩個(gè)精氨酸的正電荷與c-di-GMP兩個(gè)磷酸基團(tuán)的負(fù)電荷的相互吸引結(jié)合在一起。這為理解內(nèi)源免疫系統(tǒng)如何感應(yīng)及防御微生物的感染提供了重要信息，也從分子水平上證明c-di-GMP可以作為優(yōu)良的疫苗佐劑，在臨床上具有很好的應(yīng)用前景。

3 c-di-GMP作為免疫佐劑的研究

c-di-GMP刺激和調(diào)節(jié)宿主的先天免疫反應(yīng)表明，c-di-GMP及其類似物可以是一個(gè)潛在的疫苗佐劑，2006年第一次由Karaolis［14］正式的提出這一概念。 隨后，2007年 Ebensen T［18］首次評(píng)估了c-di-GMP及其類似物作為佐劑的可能性。采用標(biāo)準(zhǔn)的免疫程序模式抗原半乳糖苷酶與c-di-GMP的混合物皮下免疫小鼠，和單免抗原相比，其產(chǎn)生很強(qiáng)的體液免疫與細(xì)胞免疫，引起淋巴細(xì)胞增殖和干擾素，IL-2，IL-4和腫瘤壞死因子等的分泌。血清中檢測出IgG1與IgG2a亞型和脾細(xì)胞中細(xì)胞因子，說明 c-di-GMP作為疫苗佐劑可以誘導(dǎo)Th 1、Th 2平衡免疫反應(yīng)，c-di-GMP可以作為好的疫苗佐劑。Hu DL等［19］建立小鼠感染模型，小鼠在2周的時(shí)間內(nèi)間隔免疫三次，以鋁膠或c-di-GMP作為佐劑，1：1混合抗原耐甲氧西林金黃色葡萄球菌，粘附素或金黃色葡萄球菌腸毒素。實(shí)驗(yàn)表明以c-di-GMP作為佐劑的疫苗免疫的小鼠有更好地存活率，與鋁膠佐劑相比，脾臟與肝臟細(xì)菌的感染量明顯降低。另一小鼠模型，肺炎球菌PdB+c-di-GMP佐劑與肺炎球菌PdB+鋁膠佐劑相比產(chǎn)生較高的特異性抗體，且產(chǎn)生很好的免疫保護(hù)［12］。

c-di-GMP在作為全身免疫佐劑研究的同時(shí)，發(fā)現(xiàn)其作為粘膜佐劑有著不錯(cuò)的免疫效果。Yan H等［20］首次證明c-di-GMP作為佐劑，可提高粘膜免疫反應(yīng)，產(chǎn)生針對(duì)病菌入侵的保護(hù)性免疫。小鼠通過滴鼻免疫肺炎球菌表面黏附素A與c-di-GMP的混合物可刺激機(jī)體產(chǎn)生特異性抗體IgA、IgG1和IgG2a。粘膜和血清中的含有較高的特異抗體肺炎球菌表面黏附素A。McWhirter SM等［21］在哺乳動(dòng)物細(xì)胞漿中發(fā)現(xiàn)c-di-GMP，其引發(fā)的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)與細(xì)胞內(nèi)的DNA刺激機(jī)體產(chǎn)生的反應(yīng)相似，通過調(diào)控基因TANK激酶1，干擾素調(diào)整因子3，核因子B和有活性的蛋白激酶，引發(fā)誘導(dǎo)產(chǎn)生Ⅰ型干擾素。這個(gè)反應(yīng)與胞漿DNA引發(fā)的反應(yīng)一樣，可能會(huì)增加c-di-GMP作為小分子佐劑的價(jià)值。Madhun AS等［22］利用植源性的流感疫苗 H5N1，混合c-di-GMP作為佐劑。采用滴鼻或肌注的方式免疫小鼠，以肌注的方式免疫的小鼠沒有提高H5N1的免疫應(yīng)答，而以滴鼻方式免疫的小鼠引起強(qiáng)烈的粘膜免疫與體液免疫，另外，滴鼻的方式引起 Th1／Th2的平衡變化，出現(xiàn)大量多功能的Th1CD4細(xì)胞，說明c-di-GMP對(duì)植源性的流感疫苗H5N1是一種很有前途的粘膜佐劑。Pedersen GK等［23］應(yīng)用小鼠模型免疫H5N1減毒活疫苗，混合c-di-GMP作為佐劑，采用滴鼻、舌下注射與肌注的方式免疫小鼠。舌下免疫可有效地誘導(dǎo)局部與全身的體液免疫和細(xì)胞免疫反應(yīng)，但免疫效果明顯低于滴鼻免疫，但高于肌注免疫。值得一提的是舌下免疫可產(chǎn)生大量針對(duì)H5N1的特異多功能CD4+細(xì)胞。三種免疫方式均產(chǎn)生了較高的血凝抑制抗體，其中唾液中的HI抗體僅由滴鼻與舌下注射免疫產(chǎn)生。通過對(duì)比一系列的免疫方式，滴鼻免疫的方式是最能提高c-di-GMP免疫效果的免疫方式，這也間接證實(shí)c-di-GMP作為佐劑，在粘膜免疫方面具有很好的效果。與目前佐劑研究的熱點(diǎn)細(xì)胞因子，脂質(zhì)體，CpG-ODN佐劑，單磷?；|(zhì) A相比c-di-GMP可以明顯提高抗體IgG1、IgG2a，干擾素-γ的水平與含量［24］。

4 結(jié)語

c-di-GMP能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)，而啟動(dòng)了探討其作為新型免疫增強(qiáng)劑的研究，新型疫苗佐劑一般具有來源廣泛、價(jià)格低廉、高效低毒、作用機(jī)理研究比較清楚等特點(diǎn)［25-26］。c-di-GMP要成為切實(shí)可行的免疫佐劑還需大量的數(shù)據(jù)支持：體外的實(shí)驗(yàn)表明c-di-GMP對(duì)正常大鼠腎細(xì)胞或人類神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞沒有致死毒性，也沒有不良的反應(yīng)或是致癌作用［14-20］，但在體內(nèi)的安全性需要進(jìn)行評(píng)估；c-di-GMP強(qiáng)大的免疫刺激特性可能導(dǎo)致對(duì)機(jī)體有害的炎癥反應(yīng)［27］，這就需要對(duì)c-di-GMP進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾防止過度組織炎癥。粘膜表面（如呼吸道，消化道和泌尿生殖道）是病原菌主要的入侵途徑和定居部位。因此，發(fā)展佐劑和疫苗引起有效和持續(xù)的粘膜免疫反應(yīng)，防止病原體的附著，入侵和復(fù)制，將在預(yù)防和治療許多重要的傳染病方面起到重要作用。c-di-GMP能否成為一種有效地粘膜佐劑必須經(jīng)過更多方面的評(píng)估。另外，對(duì)c-di-GMP的作用機(jī)制的深入研究，是c-di-GMP成為粘膜免疫佐劑關(guān)鍵的一步。雖然，c-di-GMP或其相關(guān)衍生物成為切實(shí)可行的免疫佐劑任重而道遠(yuǎn)，但其值得期待。

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