QuEChERS樣品前處理-高效液相色譜法測定動(dòng)物組織中那西肽殘留量

陳慧華，應(yīng)永飛，杜旭奕，羅成江，周芷錦

（浙江省獸藥飼料監(jiān)察所，杭州310020）

那西肽（Nosiheptide）是一種含硫多肽類抗生素，其結(jié)構(gòu)式見圖1。那西肽對(duì)畜禽有明顯的促生長作用，對(duì)環(huán)境影響小、對(duì)人畜安全，且不易產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)點(diǎn)，目前歐美和日本均已批準(zhǔn)其在畜禽養(yǎng)殖中使用［1-2］。1998年我國將其批準(zhǔn)為國家三類新獸藥［3］，被農(nóng)業(yè)部168號(hào)公告列為可在飼料中長期添加使用的藥物添加劑［4］，已廣泛應(yīng)用于畜禽養(yǎng)殖業(yè)。為保障動(dòng)物源性食品的安全性，國際上紛紛制定了那西肽的殘留限量和檢測方法，如日本肯定列表制定規(guī)定了雞和豬肌肉、肝臟等組織中那西肽的最高殘留限量均為 30 μg／kg［5］，美國 AOAC 已制定了動(dòng)物組織中那西肽的檢測方法［6］。由于我國還未制定動(dòng)物組織中那西肽殘留限量和檢測方法標(biāo)準(zhǔn)，為完善那西肽安全用藥體系，迫切需要建立動(dòng)物組織中那西肽殘留的檢測方法。

圖1 那西肽的分子結(jié)構(gòu)式

目前，針對(duì)動(dòng)物組織中那西肽殘留檢測的研究很少，主要以飼料和獸藥檢測為主，包括微生物檢定法［3］、氣質(zhì)聯(lián)用法［7］和液相色譜法［3，6，8-9］，其中氣質(zhì)聯(lián)用法需要進(jìn)行衍生化等復(fù)雜前處理；液相色譜法不需要進(jìn)行衍生化處理，操作更為簡便。近年來，QuEChERS檢測技術(shù)以其快速、簡易、廉價(jià)、有效、穩(wěn)定、安全等特點(diǎn)在農(nóng)、獸藥殘留和霉菌毒素檢測領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用［10-11］，本文研究采用QuEChERS前處理方法，結(jié)合高效液相色譜熒光檢測法，建立了動(dòng)物組織中那西肽殘留量檢測方法。

1 材料與方法

1.1 儀器 Waters 2695高效液相色譜儀-2475熒光檢測器，配 Empower 2軟件，美國 Waters公司；METTLER TOLEDOXS-205電子天平（感量0.01 mg）；SL502 N電子天平（感量0.01 g）；KQ-500E型超聲波清洗器；Sigma 3k30型冷凍離心機(jī)；BüCHI B-490旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀；AM-6勻漿機(jī)；IKA MS2 minishaker渦旋混勻器。

1.2 試劑 那西肽標(biāo)準(zhǔn)品，由浙江匯能動(dòng)物藥品有限公司提供，純度大于95.0%；無水硫酸鎂、C18、PSA、GCB均為QuEChERS專用材料，美國Agilent公司；乙腈、甲醇、N，N-二甲基甲酰胺為色譜純，Merck公司；實(shí)驗(yàn)用水為milli-Q超純水；磷酸、正丙醇、無水硫酸鈉等為分析純。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)品溶液 準(zhǔn)確稱取那西肽標(biāo)準(zhǔn)品25 mg于25 mL容量瓶中，用N，N-二甲基甲酰胺溶解后稀釋至刻度，配制成濃度為1.0 mg／mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液；吸取標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液1.0 mL于100 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，配制成10.0 μg／mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液；吸取適量體積的標(biāo)準(zhǔn)工作液，用流動(dòng)相稀釋成含那西肽為 0.01、0.02、0.05、0.10、0.20、0.50 和2.0 μg／mL 的標(biāo)準(zhǔn)系列工作液。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 色譜條件 色譜柱：Waters Symmetry C18（4.6 mm×250 mm，5.0 μm）；熒光檢測條件：激發(fā)波長327 nm，發(fā)射波長521 nm；流動(dòng)相：0.025%磷酸溶液／乙腈（52：48，V／V）；柱溫：30 ℃；流速：1.0 mL／min； 進(jìn)樣量：20 μL。

1.4.2 樣品前處理 稱?。?±0.05）g試樣于50 mL離心管中，加入25 mL乙腈，高速勻漿1 min，加入無水硫酸鈉3 g，中速振蕩提取10 min；于8000 r／min離心5 min，傾出上清液至另一50 mL離心管中，剩余殘?jiān)?0 mL乙腈重復(fù)提取一次，合并兩次提取上清液；提取液中加入150 mg C18和100 mg無水硫酸鎂，中速振蕩5 min，于8000 r／min離心5 min，傾出上清液至雞心瓶中，加入5 mL正丙醇，40℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干；準(zhǔn)確加入2.0 mL流動(dòng)相至雞心瓶中，渦旋混勻1 min溶解殘余物，過膜后上機(jī)測定。

2 結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線及回收率 取1.3項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)系列工作液，按濃度從低到高依次進(jìn)行高效液相色譜分析，每個(gè)濃度重復(fù)進(jìn)樣3次。以峰面積y對(duì)濃度x（μg／mL）作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為y＝1691662x－18247，線性相關(guān)系數(shù)r2＝0.9998。結(jié)果表明，那西肽在0.01～2.0 μg／mL的濃度范圍內(nèi)，呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

2.2 檢測限和定量限 以豬、雞肌肉和肝臟等典型畜禽產(chǎn)品為樣品基質(zhì)，添加適量那西肽標(biāo)準(zhǔn)工作液進(jìn)行試驗(yàn)，考察方法的檢測限和定量限。經(jīng)回收率試驗(yàn)，當(dāng)動(dòng)物組織中添加那西肽為5 μg／kg時(shí)，信噪比（S／N）均大于3；當(dāng)動(dòng)物組織中添加那西肽為 10 μg／kg 時(shí)，信噪比（S／N）均大于 10，所以本方法的檢測限為 5 μg／kg，定量限為 10 μg／kg。 由于那西肽是允許使用的藥物飼料添加劑［4］，且檢測濃度大大低于日本肯定列表規(guī)定的30 μg／kg的要求［5］，完全能滿足實(shí)際樣品檢測的需要。

2.3 準(zhǔn)確度和精密度 取豬、雞肌肉和肝臟樣品進(jìn)行加標(biāo)回收率試驗(yàn)，系統(tǒng)考察方法的準(zhǔn)確度和精密度。 分別進(jìn)行 10、20、100 μg／kg 添加濃度的回收率實(shí)驗(yàn)，每批次同一濃度做5個(gè)平行，每個(gè)濃度重復(fù)3次，分別計(jì)算批內(nèi)、批間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，回收率試驗(yàn)結(jié)果見表1。

表1 不同動(dòng)物組織中那西肽回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝5）

從回收率結(jié)果看出，豬、雞肌肉和肝臟在10～100 μg／kg添加濃度范圍內(nèi)，平均回收率為73.8%～93.0%，批內(nèi)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）在1.3%～11.1%之間，批間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）在2.9%～10.9%之間，可見本方法能滿足動(dòng)物組織中那西肽測定的需要。圖2是添加濃度為20 μg／kg時(shí)，那西肽標(biāo)準(zhǔn)溶液、豬肝空白樣品溶液和豬肝添加樣品溶液高效液相色譜圖，箭頭所示為那西肽峰。

2.4 實(shí)際樣品檢測 采用建立的檢測方法對(duì)市場隨機(jī)抽檢的109份豬肝、豬肉、雞肉樣品進(jìn)行了檢測，結(jié)果未發(fā)現(xiàn)那西肽陽性樣品。

3 討論

3.1 熒光檢測條件的確定 目前，國內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道液相色譜法測定那西肽的方法中，檢測器包括紫外檢測器和熒光檢測器兩種。紫外檢測器主要用于獸藥和飼料樣品含量測定，波長包括330 nm［3］和241 nm［9］，實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)檢測靈敏度很低，雜質(zhì)干擾嚴(yán)重，無法滿足藥物殘留檢測要求。本文參考文獻(xiàn)［6，8］的方法，采用熒光檢測器進(jìn)行檢測，比較了激發(fā)波長357 nm、發(fā)射波長500 nm和激發(fā)波長327 nm、發(fā)射波長521 nm兩種檢測條件，發(fā)現(xiàn)采用后者條件的靈敏度更高，雜質(zhì)干擾更少，因此確定熒光檢測條件為激發(fā)波長327 nm、發(fā)射波長521 nm。

圖2 標(biāo)準(zhǔn)溶液（A）、豬肝空白樣品溶液（B）和豬肝添加樣品溶液（C）高效液相色譜圖

3.2 液相色譜分離條件的確定 由于那西肽屬于含硫多肽類抗生素，極性較弱，可采用C18柱作為分析柱進(jìn)行分離。本研究對(duì)Waters Symmetry C18（4.6 mm×250 mm，5.0 μm）柱、Waters Atlantis C18（4.6 mm×250 mm，5.0 μm）柱、 Agilent ZORBAX Extend-C18（4.6 mm×250 mm，5.0 μm）柱等三種規(guī)格的色譜柱進(jìn)行了比較，結(jié)果表明分離結(jié)果均較為滿意。在流動(dòng)相選擇上，比較了磷酸鹽緩沖液／乙腈、磷酸溶液／乙腈和水／乙腈體系的色譜保留性能和靈敏度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，磷酸溶液／乙腈流動(dòng)相體系那西肽峰型最好、靈敏度最高。進(jìn)一步優(yōu)化磷酸溶液濃度和流動(dòng)相配比，使那西肽獲得最佳峰型和保留時(shí)間，最終確定流動(dòng)相為0.025%磷酸溶液／乙腈為52／48（V／V），流速為 1.0 mL／min。

3.3 樣品前處理方法的優(yōu)化 那西肽分子量較大，在水、乙醇、丙酮和三氯甲烷中不溶或微溶，同時(shí)考慮到動(dòng)物組織中蛋白質(zhì)、脂肪含量高等特點(diǎn)，本研究采用乙腈作為提取劑，蛋白沉淀效果較為理想，結(jié)合QuEChERS方法對(duì)提取液進(jìn)行了凈化。通過加標(biāo)回收試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，乙二胺-N-丙基硅烷（PSA）和石墨化炭黑（GCB）對(duì)那西肽吸附能力很強(qiáng)，凈化后回收率都很低，而C18和MgSO4不僅對(duì)雜質(zhì)有一定的吸附能力，且對(duì)那西肽的回收率影響小，優(yōu)化使用量后達(dá)到了較好的效果。

3.4 干擾試驗(yàn) 考察在本文色譜條件下，其他類似藥物對(duì)那西肽分析方法的干擾。以目前養(yǎng)殖環(huán)節(jié)常用多肽類抗生素硫酸粘菌素、恩拉霉素、桿菌肽鋅為代表進(jìn)行干擾試驗(yàn)，采用那西肽色譜條件進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示在該色譜條件下以上化合物均未出現(xiàn)色譜峰。

4 結(jié)論

本文采用QuEChERS樣品前處理-高效液相色譜法建立了動(dòng)物組織中那西肽殘留量的分析方法。該方法采用QuEChERS技術(shù)對(duì)樣品前處理?xiàng)l件進(jìn)行系統(tǒng)優(yōu)化，建立了快速、簡易、廉價(jià)、有效、穩(wěn)定、安全的前處理技術(shù)，并系統(tǒng)考察了液相色譜檢測條件，提升了檢測靈敏度。在本實(shí)驗(yàn)的色譜條件下，被測藥物與雜質(zhì)得到了較好的分離，出峰時(shí)間合適。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該方法條件易于控制，靈敏度高、結(jié)果準(zhǔn)確、加標(biāo)回收率穩(wěn)定、重現(xiàn)性好，能夠滿足日常檢測的要求，適用于動(dòng)物組織中那西肽殘留量的測定。

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