NOTCH3基因剪切突變導(dǎo)致的CADASIL一家系報(bào)告

趙丹華 賀大權(quán) 楊旭 金迪 劉瀟 王朝霞 袁云

常染色體顯性遺傳性腦動(dòng)脈病伴皮質(zhì)下梗死和白質(zhì)腦?。╟erebral autosomal dominant arteriopathy with subcortical infarcts and leukoencephalopathy，CADASIL）是一種較常見的遺傳性腦小血管?。?］，于1993年由法國(guó)人 Tournier－Lasserve等首次提出［2］。該病多在中年發(fā)病，臨床特征為反復(fù)發(fā)作的缺血性卒中、偏頭痛、精神異常和皮質(zhì)下癡呆［1］。頭顱MRI顯示多發(fā)的腔隙性腦梗死及廣泛的白質(zhì)疏松，尤其以顳極白質(zhì)異常信號(hào)最有提示意義［1，3］。其特征性的病理改變?yōu)樾?dòng)脈中層平滑肌細(xì)胞表面出現(xiàn)顆粒性嗜鋨物質(zhì)（GOM）沉積，是診斷本病的金標(biāo)準(zhǔn)之一［1］。

CADASIL由位于染色體 19p13.2－13.1 的NOTCH3基因突變所引起［4］。致病性NOTCH3基因突變也是確診該病的金標(biāo)準(zhǔn)。根據(jù)HGMD數(shù)據(jù)庫(kù) （www.hgmd.cf.ac.uk／ac／index.php）顯示，目前全世界已報(bào)道240余種突變，其中90%以上為錯(cuò)義或無(wú)義突變，還有少數(shù)為插入以及缺失突變，而剪切突變罕見，至今僅有3例［5－7］。我國(guó)目前已報(bào)道40余個(gè)CADASIL家系［8－12］，全部為錯(cuò)義或缺失突變引起，尚無(wú)剪切突變的報(bào)道。本文通過分析1例CADASIL患者及其家系成員的臨床、影像學(xué)特點(diǎn)，并對(duì)患者及部分家系成員進(jìn)行NOTCH3基因檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)其存在NOTCH3基因剪切位點(diǎn)突變。

1 對(duì)象和方法

1.1 研究對(duì)象 收集1個(gè)CADASIL家系共5例患者的臨床及影像學(xué)資料，家系系譜見圖1。先證者經(jīng)超微病理檢查發(fā)現(xiàn)微小動(dòng)脈的平滑肌細(xì)胞表面以及毛細(xì)血管周細(xì)胞表面存在GOM沉積，符合CADASIL診斷標(biāo)準(zhǔn)。

圖1 CADASIL患者家系系譜圖

1.2 方法

1.2.1 臨床資料收集:回顧分析該家系先證者（Ⅲ－5）及家系成員中有癥狀患者的臨床表現(xiàn)，主要包括發(fā)病年齡、首發(fā)癥狀及主要癥狀等；回顧分析先證者2次不同時(shí)期的頭MRI表現(xiàn)。

1.2.2 NOTCH3基因突變檢測(cè):提取先證者及其兄妹（Ⅲ－6及Ⅲ－7）的外周血白細(xì)胞DNA。使用Primer 3軟件對(duì)NOTCH3基因的熱點(diǎn)突變區(qū)域2－12號(hào)外顯子及其側(cè)翼序列設(shè)計(jì)引物，具體引物序列及反應(yīng)條件見參考文獻(xiàn)［13］。聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）擴(kuò)增目的片段，產(chǎn)物純化后，用 ABI 3730XL自動(dòng)測(cè)序儀進(jìn)行直接測(cè)序。所有PCR產(chǎn)物均進(jìn)行雙向測(cè)序。同時(shí)對(duì)100名健康對(duì)照者進(jìn)行NOTCH3基因4號(hào)外顯子及其側(cè)翼序列測(cè)序。

1.2.3 突變的反轉(zhuǎn)錄分析:用Trizol試劑一步法從患者左肱二頭肌組織中提取總RNA，在 MMLV反轉(zhuǎn)錄酶作用下反轉(zhuǎn)錄得到第一鏈cDNA。以此cDNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，使用Primer 3設(shè)計(jì)引物覆蓋NOTCH3基因2－4號(hào)外顯子，上游引 物 序 列 為:5′－GTGTGCAAATGGAGGTCGTT－3′，下游引物序列為:5′－AAGGAGCCAGGTGTGTTGAG－3′。應(yīng)用瓊脂糖凝膠檢測(cè)PCR產(chǎn)物并進(jìn)行雙向測(cè)序。

2 結(jié)果

2.1 臨床及影像學(xué)表現(xiàn) 該家系中3代共出現(xiàn)5例患者，且每代均有發(fā)病者。先證者為46歲男性，40歲出現(xiàn)短暫性腦缺血發(fā)作；43歲患腦梗死，當(dāng)時(shí)查頭MRI示左側(cè)腦橋點(diǎn)狀新鮮梗死灶，同時(shí)雙側(cè)側(cè)腦室旁白質(zhì)、左側(cè)胼胝體及雙側(cè)基底節(jié)可見多發(fā)陳舊腔梗灶，雙側(cè)側(cè)腦室旁白質(zhì)及額頂顳葉皮層下白質(zhì)多發(fā)小片狀長(zhǎng)T2信號(hào)，雙側(cè)顳極白質(zhì)及右側(cè)外囊呈長(zhǎng)T2信號(hào)（圖2）；46歲開始出現(xiàn)記憶力減退，復(fù)查頭MRI示雙側(cè)基底節(jié)及半卵圓中心腔隙性腦梗死灶較以前增多，雙側(cè)側(cè)腦室旁白質(zhì)及額頂顳葉皮層下白質(zhì)病變范圍較前擴(kuò)大，部分融合成片。先證者的弟弟（Ⅲ－7）30多歲時(shí)患“腦梗死”，目前遺留言語(yǔ)不清、記憶力減退、思維混亂表現(xiàn)；父親（Ⅱ－3）約50歲時(shí)出現(xiàn)反應(yīng)遲鈍、記憶力減退及運(yùn)動(dòng)遲緩等，后因癱瘓臥床去世；姑姑（Ⅱ－2）曾患“腦梗死”，現(xiàn)已去世；祖父（Ⅰ－1）早年死亡，原因不詳，去世前有動(dòng)作遲緩及言語(yǔ)不清表現(xiàn)。所有患者均無(wú)高血壓、糖尿病及高脂血癥等疾病。

圖2 先證者（43歲）患腦梗死時(shí)的頭MRI表現(xiàn):雙側(cè)側(cè)腦室周圍出現(xiàn)多發(fā)腔梗灶，同時(shí)可見腦白質(zhì)變性（A）；雙側(cè)顳極可見T2高信號(hào)（B）

圖3 先證者的NOTCH3基因測(cè)序分析

2.2 基因檢測(cè) 先證者及其弟弟（Ⅲ－7）的NOTCH3基因3號(hào)內(nèi)含子的第77位堿基存在A＞G雜合突變（c.341－2A＞G，圖3A），使3號(hào)內(nèi)含子的剪切受體由AG變?yōu)镚G。而先證者無(wú)癥狀的妹妹（Ⅲ－6）以及100名健康對(duì)照者均沒有發(fā)現(xiàn)該突變。

2.3 反轉(zhuǎn)錄分析結(jié)果 反轉(zhuǎn)錄PCR研究表明，c.341－2A＞G突變使剪切位點(diǎn)發(fā)生改變，其中一條cDNA第4號(hào)外顯子的前21個(gè)堿基（c.341－361）被作為內(nèi)含子剪切下來(lái)（圖3B），致使4號(hào)外顯子mRNA起始的7個(gè)氨基酸（p.114－120，即甘氨酸、脯氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、絲氨酸、亮氨酸及脯氨酸）被跨越、未轉(zhuǎn)錄。

3 討論

該家系連續(xù)3代均出現(xiàn)發(fā)病者，男女均可受累，符合常染色體顯性遺傳特點(diǎn)。所有患者均在中年發(fā)病，主要表現(xiàn)為反復(fù)發(fā)作的缺血性卒中及認(rèn)知功能減退；無(wú)高血壓、糖尿病及高脂血癥等腦血管病常見危險(xiǎn)因素；頭顱MRI顯示多發(fā)腔梗灶及廣泛的腦白質(zhì)變性；皮膚超微病理檢查發(fā)現(xiàn)微小動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞表面出現(xiàn)GOM沉積，證實(shí)CADASIL的診斷。NOTCH3基因突變檢測(cè)證實(shí)存在c.341－2A＞G剪切突變，從基因水平進(jìn)一步確診了該病。

先證者頭MRI改變特點(diǎn)為多發(fā)腔梗灶及彌漫性的白質(zhì)疏松，結(jié)合其雙側(cè)顳極白質(zhì)出現(xiàn)長(zhǎng)T2信號(hào)這一特征性表現(xiàn)，高度提示CADASIL的診斷。研究發(fā)現(xiàn)，CADASIL患者的頭MRI表現(xiàn)具有一定的演變規(guī)律［1］，其腦白質(zhì)病變常早于腔梗灶出現(xiàn)，最早在側(cè)腦室周圍及半卵圓中心區(qū)域觀察到點(diǎn)狀或結(jié)節(jié)狀的長(zhǎng)T2異常信號(hào)，隨后病灶增多、融合，形成彌漫性的病灶。該文先證者的白質(zhì)病變隨著病程的延長(zhǎng)而逐漸加重，符合這一特點(diǎn)。CADASIL患者的腔隙性梗死灶主要集中在基底節(jié)、丘腦及外囊等大腦深部結(jié)構(gòu)，也見于腦室旁白質(zhì)、皮層下白質(zhì)、胼胝體及腦干等部位，而本例患者的腔梗灶以側(cè)腦室旁白質(zhì)及胼胝體為主，基底節(jié)病灶相對(duì)不明顯，提示該病的影像學(xué)表現(xiàn)也存在一定的異質(zhì)性。雖然胼胝體病變罕見于腦小血管病，但在CADASIL患者中并不少見，因此有助于鑒別CADASIL與其他類型的腦小血管?。?4］。

NOTCH3基因含有33個(gè)外顯子，編碼含有2321個(gè)氨基酸的跨膜蛋白，其胞外段含有34個(gè)表皮生長(zhǎng)因子重復(fù)序列（EGFR），每個(gè)EGFR又包括6個(gè)半胱氨酸殘基［1］。除個(gè)別位點(diǎn)外，目前所報(bào)道的絕大多數(shù)突變均與EGFR中的半胱氨酸殘基有關(guān)，即突變導(dǎo)致了半胱氨酸殘基的生成或丟失，而奇數(shù)的半胱氨酸殘基打破了原有正常的二硫鍵的形成，改變了編碼蛋白質(zhì)的構(gòu)象［13］。本研究中，c.341－2A＞G突變位于內(nèi)含子3的剪切受位，導(dǎo)致NOTCH3基因的mRNA剪切異常，產(chǎn)生了丟失7個(gè)氨基酸的截短蛋白，其中包括構(gòu)成第2個(gè)EGFR的第6位半胱氨酸殘基（p.117）。該氨基酸丟失后，無(wú)法與第108位的半胱氨酸殘基配對(duì)形成二硫鍵，進(jìn)而影響了該EGFR氨基端的雙層β折疊的穩(wěn)定性，使局部結(jié)構(gòu)發(fā)生錯(cuò)誤折疊而致?。?5］。同時(shí)該突變具有以下特點(diǎn):（1）在本家系中與臨床表型共分離；（2）國(guó)外CADASIL家系中也發(fā)現(xiàn)該突變位點(diǎn)［5］；（3）NOTCH3基因 mRNA 全長(zhǎng)測(cè)序沒有發(fā)現(xiàn)其他致病性突變；（4）100名健康對(duì)照者沒有發(fā)現(xiàn)相同突變。因此綜合以上特點(diǎn)支持該突變?yōu)橹虏⌒酝蛔儭?/p>

檢索文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，本家系為目前已知第2個(gè)由c.341－2A＞G剪切突變所導(dǎo)致的CADASIL家系。第一個(gè)家系位于法國(guó)東部，其7例受累成員主要表現(xiàn)為各種類型的偏頭痛，包括先兆偏頭痛、偏癱型偏頭痛、基底動(dòng)脈型偏頭痛以及無(wú)先兆偏頭痛，僅1例存在認(rèn)知功能減退［16］，隨訪5年后發(fā)現(xiàn)有1例患者出現(xiàn)了缺血性卒中［5］，偏頭痛常見于高加索CADASIL患者中［10］。而本家系成員則主要表現(xiàn)為腦梗死和癡呆，無(wú)明確偏頭痛及精神異常病史，與國(guó)內(nèi)CADASIL患者的臨床特點(diǎn)一致［10］。由此可見，雖然存在同一個(gè)突變位點(diǎn)，但不同種族患者的臨床表現(xiàn)可以存在很大差異。目前除個(gè)別報(bào)道外［17］，絕大多數(shù)研究均認(rèn)為CADASIL患者的基因型和臨床表型之間并無(wú)直接的對(duì)應(yīng)關(guān)系［7］，而種族及地域因素的差異似乎對(duì)CADASIL患者臨床表型的影響更大［10，18］。

盡管目前報(bào)道的240余種NOTCH3基因突變中僅有3例是剪切突變（除c.341－2A＞G外，另2例分別為位于3號(hào)內(nèi)含子深部的c.341－26＿24delAAC以及位于15號(hào)內(nèi)含子剪切受位的c.2412－1G＞T突變）［5－7］。但研究發(fā)現(xiàn)，在人類所有致病性突變中，剪切突變是一種常見的突變類型，其中至少10%的突變?yōu)榘l(fā)生在剪切供位或受位的點(diǎn)突變［19］，甚至在某些疾病中高達(dá)50%的突變是通過影響剪接過程而致?。?0］。由于病理證實(shí)的CADASIL患者中尚有5%～10%未發(fā)現(xiàn)致病性突變［21］，因此應(yīng)該對(duì)這些患者進(jìn)行深入研究，以探討是否存在NOTCH3基因內(nèi)含子突變，特別是深在型內(nèi)含子突變。

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