重組人粒細(xì)胞集落刺激因子對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷后p－JAK2及p－STAT3信號(hào)通路的影響

徐海發(fā) 蔣晶晶 馬靜萍

重組人粒細(xì)胞集落刺激因子（recombinant human granulocyte colony－stimulating factor，rhG－CSF）已被廣泛的用于治療各種原因引起的粒細(xì)胞減少癥，近年研究發(fā)現(xiàn)，rhG－CSF具有抗細(xì)胞凋亡、抑制炎性反應(yīng)、促進(jìn)神經(jīng)分化、免疫調(diào)節(jié)等作用，對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)具有明顯保護(hù)作用，當(dāng)腦組織發(fā)生缺血再灌注損傷時(shí)其不僅釋放大量炎性細(xì)胞因子〔如腫瘤壞死因子－α（TNF－α）、白細(xì)胞介素－1（IL－1）、白細(xì)胞介素－6（IL－6）等［1］〕和氧自由基，同時(shí)還可以激活酪氨酸激酶－信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄因子（JAK－STAT）信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路［2］，介導(dǎo)細(xì)胞凋亡途徑。本實(shí)驗(yàn)通過線栓法建立大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷模型，觀察rhG－CSF對(duì)大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷后神經(jīng)功能評(píng)分、腦梗死體積、磷酸化酪氨酸激酶－2（p－JAK2）、磷酸化信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄活化子－3（p－STAT3）表達(dá)及神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響，旨在探討rhG－CSF神經(jīng)保護(hù)作用的可能機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:SD健康雄性大鼠60只，體質(zhì)量250～300g，由山西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。

1.1.2 主要試劑:rhG－CSF購(gòu)自山東齊魯制藥有限公 司，TTC、p－JAK2（Y221）PAb、p－STAT3（S727）pAb、TUNEL試劑盒、二步法免疫組化試劑盒及DAB顯色試劑盒均購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 缺血再灌注模型的制作及神經(jīng)功能評(píng)分:采用隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)選取36只大鼠，分為假手術(shù)組、腦缺血再灌注組和rhG－CSF治療組（治療組）3組，每組12只。采用Longa等［4］的線栓法建立大腦中動(dòng)脈閉塞再灌注（MCAO／R）模型，于缺血2h后實(shí)施再灌注。假手術(shù)組僅分離頸部動(dòng)脈而不插入魚線，余相同。MCAO／R模型完成后，治療組于再灌注的同時(shí)及24h后按體質(zhì)量50μg／kg分別給予腹部皮下注射rhG－CSF，假手術(shù)組和腦缺血再灌注組分別予等量生理鹽水。

以Longa 5分制法［4］為評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評(píng)分，假手術(shù)組大鼠于術(shù)后清醒時(shí)進(jìn)行評(píng)分，治療組和腦缺血再灌注組大鼠于缺血再灌注后清醒時(shí)進(jìn)行評(píng)分。0分:無神經(jīng)損傷癥狀；1分:不能伸展左前肢；2分:行走時(shí)往左側(cè)轉(zhuǎn)圈；3分:行走時(shí)向左傾倒；4分:不能自行行走，意識(shí)喪失。0分與4分的大鼠被剔除，按照相同的隨機(jī)原則補(bǔ)足每組相應(yīng)的只數(shù)，確保每組有12只大鼠進(jìn)入實(shí)驗(yàn)。24h、48h后參照Longa 5分制評(píng)分法每組中隨機(jī)選6只行神經(jīng)功能評(píng)分及TTC染色測(cè)定腦梗死體積［3］，另外的6只用于免疫組化法和TUNEL技術(shù)分別檢測(cè)p－JAK2和p－STAT3蛋白表達(dá)及細(xì)胞凋亡情況。

1.2.2 腦梗死體積測(cè)定（TTC染色法）:每組取6只大鼠，于缺血再灌注48h后迅速斷頭取腦后置入－20℃冰箱內(nèi)，30min后取出并自視交叉水平行5個(gè)腦冠狀切片，片厚約2mm，將其置于2%（質(zhì)量濃度）TTC氯化鈉溶液中，37℃避光孵育40 min，染色后置10%（質(zhì)量濃度）甲醛溶液中在4℃條件下避光固定24h，肉眼觀察后用數(shù)碼相機(jī)（型號(hào)DSC－W730）拍照，利用計(jì)算機(jī)病理圖像分析儀（型號(hào)N200683003115）計(jì)算腦梗死體積。

1.2.3 p－JAK2和p－STAT3蛋白表達(dá):每組取6只大鼠，于腦缺血再灌注48h后用10%（質(zhì)量濃度）水合氯醛按體質(zhì)量0.3mL／100g腹腔注射麻醉，經(jīng)心臟用生理鹽水灌注至流出清亮液體后再用4%（質(zhì)量濃度）多聚甲醛行內(nèi)固定，然后斷頭取腦，將其浸入10%（體積分?jǐn)?shù)）甲醛中行外固定24h，取視交叉前后2mm的腦組織行冠狀切片，片厚約2um。采用免疫組化法（SV002兔－IgG－兩步法）檢測(cè)p－JAK2和p－STAT3蛋白表達(dá)，具體步驟按照試劑盒說明書進(jìn)行。切片置250倍顯微鏡下觀察，細(xì)胞胞漿、胞核染為棕褐色或有棕褐色顆粒沉積者為p－JAK2蛋白陽(yáng)性細(xì)胞，以細(xì)胞核染為棕褐色或有棕褐色顆粒沉積者為p－STAT3蛋白陽(yáng)性細(xì)胞。用BI－2000醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)測(cè)量陽(yáng)性細(xì)胞的灰度值，其灰度值與p－JAK2和p－STAT3陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量成反比。

1.2.4 細(xì)胞凋亡檢測(cè):各組“1.2.3”中的每張切片均采用TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況，其具體操作按說明書進(jìn)行。將切片置顯微鏡下250倍視野觀察，胞核中出現(xiàn)棕黃色顆粒者為凋亡細(xì)胞。于每張切片中選擇5個(gè)不重復(fù)的250倍視野，計(jì)算出各個(gè)視野內(nèi)凋亡細(xì)胞總數(shù)占總細(xì)胞數(shù)的百分比，并計(jì)算其平均值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS16.0軟件進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。用Levene Statistic法進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，Shapiro－Wilk法進(jìn)行正態(tài)性分析，大鼠腦組織中p－JAK2、p－STAT3蛋白表達(dá)灰度值、凋亡細(xì)胞數(shù)、腦梗死體積符合正態(tài)性分布及方差齊性檢驗(yàn)，神經(jīng)功能缺損評(píng)分不符合正態(tài)性分布及方差齊性檢驗(yàn)。p－JAK2、p－STAT3蛋白表達(dá)灰度值及凋亡細(xì)胞數(shù)三組間比較采用方差分析，三組間兩兩比較用LSD－t檢驗(yàn)。腦缺血再灌注組與治療組兩組間大鼠腦梗死體積比較采用兩組獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，神經(jīng)缺損評(píng)分比較采用Mann－Whitney U檢驗(yàn)。以P＜0.05為差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠神經(jīng)功能評(píng)分 假手術(shù)組大鼠未出現(xiàn)神經(jīng)功能缺損癥狀，腦缺血再灌注組大鼠出現(xiàn)不同程度的肢體活動(dòng)障礙，精神狀態(tài)差，進(jìn)食及活動(dòng)均減少。腦缺血再灌注組及治療組大鼠于再灌注后的24h、48h神經(jīng)功能缺損評(píng)分差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，故計(jì)錄24h時(shí)神經(jīng)功能評(píng)分。與腦缺血再灌注組比較，治療組神經(jīng)功能評(píng)分降低（P＜0.01）（表1），精神狀態(tài)、進(jìn)食及活動(dòng)均較用藥前好轉(zhuǎn)。

2.2 大鼠腦梗死體積測(cè)定 假手術(shù)組大鼠未見腦梗死灶，腦缺血再灌注組和治療組大鼠右側(cè)大腦中動(dòng)脈供血區(qū)的部分大腦皮質(zhì)、紋狀體可見明顯梗死灶（圖1），治療組腦梗死體積與腦缺血再灌注組比較明顯縮?。≒＜0.01）（表1）。

圖1 腦缺血再灌注組（A）及治療組（B）大鼠腦梗死灶（圖中箭頭所示）比較（TTC染色）

2.3 各組腦組織中p－JAK2與p－STAT3蛋白表達(dá) 假手術(shù)組偶見 p－JAK2、p－STAT3蛋白陽(yáng)性細(xì)胞；與假手術(shù)組相比，腦缺血再灌注組和治療組p－JAK2和p－STAT3蛋白陽(yáng)性細(xì)胞增多，治療組p－JAK2和p－STAT3蛋白陽(yáng)性細(xì)胞較腦缺血再灌注組明顯減少（圖2）。三組大鼠腦組織中p－JAK2及p－STAT3蛋白表達(dá)灰度值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；與假手術(shù)組相比，缺血再灌注組大鼠腦組織內(nèi)p－JAK2及p－STAT3蛋白表達(dá)灰度值明顯減低（P＜0.01）；與缺血再灌注組相比，治療組大鼠腦組織內(nèi)p－JAK2及p－STAT3蛋白表達(dá)灰度值明顯增高（P＜0.01）（表1）。

表1 各組大鼠各項(xiàng)指標(biāo)比較 （n＝6，）

表1 各組大鼠各項(xiàng)指標(biāo)比較 （n＝6，）

注:與假手術(shù)組比較，＊P＜0.01；與缺血再灌注組比較，＃P＜0.01

組別 神經(jīng)功能評(píng)分 腦梗死體積（%） P－JAK2陽(yáng)性細(xì)胞 p－STAT3陽(yáng)性細(xì)胞 凋亡細(xì)胞比例（%）治療組 1.45±0.51＃ 16.27±1.44＃ 36.47±6.38＊＃ 35.87±5.52＊＃ 27.84±2.69＊＃腦缺血再灌注組 2.72±0.45 28.65±1.36 25.62±6.25＊ 24.52±5.08＊ 39.51±3.74＊假手術(shù)組0 0 41.59±6.43 43.36±5.68 6.02±1.34

圖2 各組大鼠腦組織p－JAK2、p－STST3蛋白陽(yáng)性表達(dá)（免疫組化×250）及細(xì)胞凋亡（TUNEL法×250）情況:三組圖中箭頭所示由上至下依次分別p－JAK2陽(yáng)性細(xì)胞、p－STAT3陽(yáng)性細(xì)胞及凋亡細(xì)胞

2.4 各組腦組織細(xì)胞凋亡比較 假手術(shù)組大鼠腦組織中偶見凋亡細(xì)胞，腦缺血再灌注組凋亡細(xì)胞比例與假手術(shù)組比較明顯增多（P＜0.01），治療組凋亡細(xì)胞與腦缺血再灌注組比較明顯減小（P＜0.01）（表1、圖2）。

3 討論

JAKS－STATS通路與缺血時(shí)神經(jīng)細(xì)胞存亡有著密切聯(lián)系，當(dāng)腦組織缺血時(shí)即可激活該通路，許多細(xì)胞因子（如IL－6、CNTF等）和生長(zhǎng)因子（如EGF、CSF等）及氧化應(yīng)激也都利用JAK／STAT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路誘導(dǎo)細(xì)胞的增殖、分化或凋亡。有研究表明缺血再灌注過程中P－STAT3表達(dá)顯著增加，并且隨著缺血再灌注時(shí)間延長(zhǎng)而增加，于再灌注24h時(shí)可能達(dá)到峰值［5］，其激活程度可能與缺血面積大小密切相關(guān)；另有研究表明JAK2－STAT3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路還直接參與了缺血再灌注后炎性反應(yīng)的發(fā)生，當(dāng)腦缺血再灌注損傷后，p－JAK2及p－STAT3蛋白表達(dá)在缺血半暗帶區(qū)明顯增強(qiáng)，并促進(jìn)了神經(jīng)細(xì)胞凋亡［6］。

近年來國(guó)內(nèi)外一些學(xué)者對(duì)rhG－CSF在缺血再灌注動(dòng)物模型治療方面的研究發(fā)現(xiàn)，它可以動(dòng)員骨髓干細(xì)胞向缺血區(qū)遷徙，促進(jìn)新生血管生成與神經(jīng)的增殖分化，同時(shí)可以抗炎、抗凋亡。Solaroglu等［7］認(rèn)為rhG－CSF在局灶性腦缺血中可能通過抑制神經(jīng)元與膠質(zhì)細(xì)胞炎性細(xì)胞因子表達(dá)起到抗炎作用，通過cLap2抗凋亡蛋白起到抗凋亡作用。Jiang等［8］的研究表明rhG－CSF可明顯降低IL－1β、TNF－α等因子的表達(dá)，從而減輕AD小鼠大腦的炎性反應(yīng)，起到神經(jīng)保護(hù)作用。上述研究均表明rhG－CSF具有抗炎、抗凋亡、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)和保護(hù)作用，可以減少腦組織梗死體積，改善神經(jīng)功能缺損癥狀。其可能機(jī)制為rhG－CSF通過降低相關(guān)細(xì)胞因子，如IL－6的表達(dá)使JAK2多聚泛素化，JAK2被降解，并進(jìn)一步阻礙STAT3的活化，減少炎性反應(yīng)的發(fā)生，同時(shí)減少中性粒細(xì)胞激活和浸潤(rùn)、細(xì)胞毒性，減少炎性反應(yīng)［9－10］，從而起到神經(jīng)保護(hù)作用，但其具體抗炎、抗凋亡機(jī)制尚不清楚，仍需進(jìn)一步研究。

該研究結(jié)果顯示:假手術(shù)組大鼠神經(jīng)功能無缺損，腦組織未見梗死區(qū)域，偶見p－JAK2、p－STAT3陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)及凋亡細(xì)胞；與腦缺血再灌注組相比，治療組大鼠神經(jīng)功能得到改善，腦梗死體積減小，腦組織p－JAK2、p－STAT3蛋白表達(dá)減弱，凋亡細(xì)胞數(shù)也明顯減少，提示rhG－CSF可能通過抑制JAK－STAT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的活化，減輕炎性反應(yīng)，使凋亡細(xì)胞數(shù)減少，而起到神經(jīng)保護(hù)作用，但具體抗炎機(jī)制不清楚，仍需進(jìn)一步研究。

綜上所述，rhG－CSF可能通過抑制炎性細(xì)胞因子介導(dǎo)JAK2／STAT3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，這可能是rhG－CSF對(duì)腦缺血再灌注損傷神經(jīng)保護(hù)的作用機(jī)制之一，為rhG－CSF的臨床應(yīng)用提供了新思路，但rhG－CSF是否還通過其他途徑影響細(xì)胞凋亡還需進(jìn)一步研究。

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