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    珍珠菜組培快繁體系研究

    2014-11-22 12:17:23寧夢雅等
    江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2014年10期
    關(guān)鍵詞:組織培養(yǎng)

    寧夢雅等

    摘要:以珍珠菜種子為材料進(jìn)行消毒及無菌苗培養(yǎng),再以消毒后萌發(fā)的無菌苗的葉片、莖段和帶葉腋莖為外植體,開展叢生芽的誘導(dǎo)、增殖培養(yǎng)、生根培養(yǎng)和移栽馴化技術(shù)研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn),珍珠菜種子最佳消毒方式為5%次氯酸鈉消毒10 min,最適叢生芽誘導(dǎo)部位為葉片,叢生芽誘導(dǎo)最佳培養(yǎng)基為MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.05 mg/L;其次為MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.05 mg/L。最適珍珠菜增殖的培養(yǎng)基為MS+6-BA 1.0 mg/L,其次為MS+6-BA 1.0 mg/L+KT 2.0 mg/L。最適生根培養(yǎng)基為1/2MS+NAA 0.5 mg/L,其次為1/2MS+NAA 1.0 mg/L。最適珍珠菜移栽馴化的方法為開瓶馴化5 d后種植于蛭石 ∶珍珠巖 ∶泥炭(1 ∶1 ∶1)基質(zhì)中。本研究結(jié)果為利用組織培養(yǎng)技術(shù)實現(xiàn)珍珠菜快速繁殖和人工擴(kuò)大栽培奠定了良好基礎(chǔ)。

    關(guān)鍵詞:珍珠菜;組織培養(yǎng);叢生芽誘導(dǎo);增殖培養(yǎng);生根培養(yǎng);移栽馴化

    中圖分類號: Q943.1文獻(xiàn)標(biāo)志碼: A文章編號:1002-1302(2014)10-0045-04

    收稿日期:2013-12-17

    作者簡介:寧夢雅,女,河北永清人,碩士研究生,從事珍珠菜組織培養(yǎng)技術(shù)研究。E-mail:ningmengya@126.com。

    通信作者:林夏珍,博士,教授,碩士生導(dǎo)師,從事園林植物栽培與管理研究。E-mail:linxz100@sohu.com。珍珠菜(Lysimachia clethroides)為報春花科珍珠菜屬珍珠菜亞屬植物,別稱矮桃、珍珠草(湖南),調(diào)經(jīng)草、尾脊草(貴州),剦雞尾、勞傷藥、伸筋散、九節(jié)蓮(云南),產(chǎn)于浙江省各地。生于山坡林緣和草叢中等濕潤處,垂直分布上限可達(dá)海拔 2 500 m。華東、華中、華南、西南、華北及東北均有分布[1-2]。珍珠菜為長日照植物,需低溫處理打破根莖休眠,總狀花序頂生、常轉(zhuǎn)向一側(cè),可作為切花應(yīng)用,也是良好的夏季草本地被花卉資源[3-4]。珍珠菜的生物學(xué)特性、化學(xué)成分和藥用的研究也多見報道。珍珠菜的組織培養(yǎng)研究不僅可以滿足化學(xué)成分和藥用的需要,豐富園林地被植物種類,滿足園林綠化快速成型的要求,還可為珍珠菜的分子育種奠定基礎(chǔ)[5]。本試驗研究了種子消毒、芽誘導(dǎo)與增殖生根等培養(yǎng)條件,建立了珍珠菜完整的植株再生體系,大大縮短了培養(yǎng)時間、提高了增殖系數(shù)、降低了成本,為珍珠菜規(guī)模化生產(chǎn)提供了科學(xué)依據(jù)[6]。

    1材料與方法

    1.1材料

    材料為采自浙江省杭州市臨安市清涼峰珍珠菜當(dāng)年生種子,通風(fēng)干燥后4 ℃冰箱內(nèi)冷藏。無菌葉片、莖段和帶葉腋莖均取自種子萌發(fā)出的無菌苗。

    1.2方法

    1.2.1種子消毒挑選顆粒飽滿無病蟲害的種子,紗布包裹流水沖洗2 h后,置于超凈工作臺上,用75%乙醇浸泡并振蕩30 s,并用無菌水沖洗3次后,用5%次氯酸鈉和2%次氯酸鈉各浸泡振蕩5、10、15、20 min,每次消毒后均用無菌水沖洗3次。將消毒處理后的種子接種于MS空白培養(yǎng)基上,消毒處理20粒種子,3次重復(fù)試驗。30 d后統(tǒng)計污染率和萌發(fā)率。

    1.2.2叢生芽誘導(dǎo)將種子萌發(fā)的無菌苗葉片、莖段和帶葉腋莖剪成5 mm×5 mm左右小塊,接種于6-BA(0.5、1.0、2.0 mg/L)、KT(2.0、3.0、4.0 mg/L)和NAA(0.05、0.1、0.5 mg/L)的2因素3水平完全試驗培養(yǎng)基中,分別為C1(6-BA+NAA)、C2(KT+NAA)組合。每處理20個材料,3次重復(fù)。30 d后統(tǒng)計誘導(dǎo)率和誘導(dǎo)系數(shù)。

    1.2.3叢生芽增殖誘導(dǎo)出的叢生芽小苗長到2~3 cm后切成單芽并轉(zhuǎn)接到添加了6-BA(0.1、0.5、1.0、2.0、3.0 mg/L)和KT(1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mg/L)的單因素培養(yǎng)基,以及6-BA(0.5、1.0、2.0 mg/L)、KT(2.0、3.0、4.0 mg/L)和NAA(0.05、0.1、0.5 mg/L)的2因素3水平完全試驗培養(yǎng)基中。每處理20個材料,3次重復(fù)。30 d后觀察并統(tǒng)計增殖系數(shù)。

    1.2.4生根培養(yǎng)叢生芽長到2~3 cm高時切成單芽轉(zhuǎn)接到添加0.1、0.5、1.0 、2.0、3.0 mg/L NAA、IBA的1/2MS生根培養(yǎng)基上培養(yǎng),對照為1/2MS空白培養(yǎng)基。每處理20個材料,3次重復(fù)。40 d后觀察并統(tǒng)計生根率、平均根數(shù)和根長。

    1.2.5移栽馴化參照文獻(xiàn)[7]的方法,在9—10月,將生根的組培苗放在自然光下封口煉苗3 d,再打開瓶蓋分別煉苗0、1、3、5、7 d。然后移栽至蛭石:珍珠巖:泥炭(1 ∶1 ∶1)基質(zhì)中,研究不同煉苗時間對珍珠菜組培苗移栽成活的影響。將在自然光條件下煉苗3 d后、打開瓶蓋煉苗 5 d 的組培苗移栽至以下5種基質(zhì)中:(1)珍珠巖 ∶蛭石(1 ∶1),(2)泥炭,(3)蛭石 ∶泥炭(1 ∶1),(4)珍珠巖 ∶泥炭(1 ∶1),(5)蛭石 ∶珍珠巖 ∶泥炭(1 ∶1 ∶1),研究不同基質(zhì)對珍珠菜試管苗移栽成活的影響。每處理均套袋保持濕度,7 d后除去。每處理20個材料,3次重復(fù),30 d后統(tǒng)計成活率。

    1.3培養(yǎng)條件

    除特殊說明外,基本培養(yǎng)基為MS,培養(yǎng)基中添加蔗糖 30 g/L、瓊脂7.0 g/L,pH值5.8。溫度(25±2) ℃,光照時間12 h/d,光照強(qiáng)度2 000~2 500 lx。

    1.4數(shù)據(jù)采集與分析方法

    數(shù)據(jù)計算與統(tǒng)計采用Excel 2003;采用SPSS 17.0進(jìn)行方差分析。污染率=污染種子數(shù)/種子總數(shù)×100%;萌發(fā)率=萌發(fā)種子數(shù)/種子總數(shù)×100%;誘導(dǎo)率=誘導(dǎo)出叢生芽的外植體數(shù)/外植體總數(shù)×100%;誘導(dǎo)系數(shù)=誘導(dǎo)出的叢生芽數(shù)/外植體總數(shù)×100%;增殖系數(shù)=產(chǎn)生的新苗數(shù)/接種苗數(shù),有效芽長>0.5 cm;生根率=生根苗數(shù)/接種苗數(shù)×100%;平均根數(shù)(條)=總根數(shù)/生根苗數(shù);平均根長(cm)=總根長度/總根數(shù);成活率=移栽成活苗數(shù)/移栽苗總數(shù)×100%。

    2結(jié)果與分析

    2.1不同消毒方式對珍珠菜種子萌發(fā)率與污染率的影響

    消毒后的種子接種于MS空白培養(yǎng)基上1 d后開始出現(xiàn)污染現(xiàn)象,15 d后不再有污染現(xiàn)象出現(xiàn)。種子接種9 d開始萌發(fā),萌發(fā)時間主要集中在接種后的9~18 d。培養(yǎng)30 d統(tǒng)計的污染率和萌發(fā)率見表1,可以看出,不同消毒處理之間差異顯著,污染率隨著消毒時間的增長而下降,而種子萌發(fā)率則呈先上升后下降的趨勢。5%次氯酸鈉消毒 10 min 時,污染率為7.50%,萌發(fā)率為15.0%,消毒效果最好。

    2.2不同激素組合對叢生芽誘導(dǎo)的影響

    將無菌材料接種到培養(yǎng)基上,接種7 d后大部分葉片反卷,切口處膨大增厚,10 d開始在葉片切口處產(chǎn)生大量芽點,后逐漸發(fā)育成叢生芽。大部分莖段在接種10 d左右開始膨大,切口處生有少量芽點后形成叢生芽,少量莖段上產(chǎn)生綠色顆粒狀組織,但無進(jìn)一步分化。大部分帶葉腋莖接種后6 d在葉腋處長出嫩芽,后逐漸長成苗,切口處也會產(chǎn)生少量叢

    表1不同消毒方式下珍珠菜種子的污染率和萌發(fā)率統(tǒng)計

    3結(jié)論與討論

    3.1結(jié)論

    珍珠菜種子最佳消毒方式為5%次氯酸鈉消毒10 min,最適叢生芽誘導(dǎo)的部位為葉片,叢生芽誘導(dǎo)最佳培養(yǎng)基配方為添加6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.05 mg/L的MS培養(yǎng)基,其次為添加6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.05 mg/L的MS培養(yǎng)基。最適增殖培養(yǎng)基為MS+6-BA 1.0 mg/L,其次為MS+6-BA 1.0 mg/L+KT 2.0 mg/L培養(yǎng)基。最適生根培養(yǎng)基為 1/2MS+NAA 0.5 mg/L,其次為1/2MS+NAA 1.0 mg/L。珍珠菜移栽馴化的方法為幼苗在自然光照射下培養(yǎng)3 d后再開瓶馴化5 d,最后種植于蛭石 ∶珍珠巖 ∶泥炭(1 ∶1 ∶1)基質(zhì)中。

    3.2討論

    試驗中雖得出了種子的最佳消毒方法,但種子萌發(fā)率很低,這可能是因為珍珠菜種子較小,種皮較薄,在消毒劑浸泡過程中傷害到了種胚,致使種子不能萌發(fā)死亡,以后的試驗可

    以探索較溫和的消毒方法。由于同一植物的不同組織和器官,其再生能力有很大差距,并非所有的部位都能順利分化出芽。因此,在組織培養(yǎng)試驗中選擇合適的外植體類型是試驗成功的重要條件之一,而培養(yǎng)基質(zhì)和培養(yǎng)條件也在組織培養(yǎng)過程中起重要作用[8-9]。本試驗選擇珍珠菜的葉片、莖段和帶葉腋莖為外植體,且結(jié)果為葉片為誘導(dǎo)叢生芽最佳外植體。在誘導(dǎo)叢生芽過程中,細(xì)胞分裂素與生長素組合有利于叢生芽的生成,其中細(xì)胞分裂素的濃度增高誘導(dǎo)效果隨之增高,且6-BA效果明顯好于KT,而細(xì)胞分裂素或生長素兩兩組合不利于叢生芽誘導(dǎo)。珍珠菜的增殖過程中,細(xì)胞分裂素和生長素的組合效果比細(xì)胞分裂素組合效果差。在移栽馴化過程中,0 d開瓶時間由于植株還沒有由異養(yǎng)轉(zhuǎn)成自養(yǎng)模式,無法從基質(zhì)中吸取營養(yǎng)與水分,所以移栽后植株易死亡,成活率低。而開瓶7 d后,可能基質(zhì)污染影響到根系,造成植株死亡,成活率降低。在基質(zhì)組合中,蛭石 ∶珍珠巖 ∶泥炭(1 ∶1 ∶1)透氣透水性最好,最利于植株生長,而泥炭基質(zhì)透氣性差,水分不易流失導(dǎo)致根部腐爛,植株死亡。本試驗成功地建立了珍珠菜組織培養(yǎng)與植株再生技術(shù)體系,對快速繁殖珍珠菜優(yōu)良品種和種質(zhì)資源的離體保存具有重要意義。

    參考文獻(xiàn):

    [1]陳封懷,胡啟明.中國植物志:第59卷第1冊[M]. 北京:科學(xué)出版社,1989:102-103.

    [2]浙江植物志編輯委員會. 浙江植物志:第五卷山柳科·茄科[M]. 杭州:浙江科學(xué)技術(shù)出版社,1989:59-60.

    [3]Iversen R R,Weiler T C. Strategies to force flowering of six herbaceous garden perennials[J]. HortTechnology,1994,4(1):61-65.

    [4]Lewis P M A A,Garner J M. Cooling accelerates flowering of lysimachia clethroides Duby[J]. HortScience,1999,34(2):239-241.

    [5]闕怡,李厚華,付婉藝,等. 西府海棠組織培養(yǎng)體系的建立與優(yōu)化[J]. 東北林業(yè)大學(xué)學(xué)報,2013,41(5):87-90.

    [6]鄒利娟,吳慶貴,羅明華. 羅勒組培快繁技術(shù)研究[J]. 中藥材,2013,36(5):702-705.

    [7]李京,張建瑛,張妍妍,等. “美登”藍(lán)莓組培苗移栽技術(shù)研究[J]. 北方園藝,2013(13):36-38.

    [8]陳雪鵑,吳玨,李雪珂,等. 芙蓉菊組培快繁技術(shù)的研究[J]. 中南林業(yè)科技大學(xué)學(xué)報,2012,32(7):100-104,127.

    [9]全妙華,歐立軍,賀安娜,等. 天門冬組培快繁技術(shù)研究[J]. 中草藥,2012,43(8):1599-1603.

    2結(jié)果與分析

    2.1不同消毒方式對珍珠菜種子萌發(fā)率與污染率的影響

    消毒后的種子接種于MS空白培養(yǎng)基上1 d后開始出現(xiàn)污染現(xiàn)象,15 d后不再有污染現(xiàn)象出現(xiàn)。種子接種9 d開始萌發(fā),萌發(fā)時間主要集中在接種后的9~18 d。培養(yǎng)30 d統(tǒng)計的污染率和萌發(fā)率見表1,可以看出,不同消毒處理之間差異顯著,污染率隨著消毒時間的增長而下降,而種子萌發(fā)率則呈先上升后下降的趨勢。5%次氯酸鈉消毒 10 min 時,污染率為7.50%,萌發(fā)率為15.0%,消毒效果最好。

    2.2不同激素組合對叢生芽誘導(dǎo)的影響

    將無菌材料接種到培養(yǎng)基上,接種7 d后大部分葉片反卷,切口處膨大增厚,10 d開始在葉片切口處產(chǎn)生大量芽點,后逐漸發(fā)育成叢生芽。大部分莖段在接種10 d左右開始膨大,切口處生有少量芽點后形成叢生芽,少量莖段上產(chǎn)生綠色顆粒狀組織,但無進(jìn)一步分化。大部分帶葉腋莖接種后6 d在葉腋處長出嫩芽,后逐漸長成苗,切口處也會產(chǎn)生少量叢

    表1不同消毒方式下珍珠菜種子的污染率和萌發(fā)率統(tǒng)計

    3結(jié)論與討論

    3.1結(jié)論

    珍珠菜種子最佳消毒方式為5%次氯酸鈉消毒10 min,最適叢生芽誘導(dǎo)的部位為葉片,叢生芽誘導(dǎo)最佳培養(yǎng)基配方為添加6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.05 mg/L的MS培養(yǎng)基,其次為添加6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.05 mg/L的MS培養(yǎng)基。最適增殖培養(yǎng)基為MS+6-BA 1.0 mg/L,其次為MS+6-BA 1.0 mg/L+KT 2.0 mg/L培養(yǎng)基。最適生根培養(yǎng)基為 1/2MS+NAA 0.5 mg/L,其次為1/2MS+NAA 1.0 mg/L。珍珠菜移栽馴化的方法為幼苗在自然光照射下培養(yǎng)3 d后再開瓶馴化5 d,最后種植于蛭石 ∶珍珠巖 ∶泥炭(1 ∶1 ∶1)基質(zhì)中。

    3.2討論

    試驗中雖得出了種子的最佳消毒方法,但種子萌發(fā)率很低,這可能是因為珍珠菜種子較小,種皮較薄,在消毒劑浸泡過程中傷害到了種胚,致使種子不能萌發(fā)死亡,以后的試驗可

    以探索較溫和的消毒方法。由于同一植物的不同組織和器官,其再生能力有很大差距,并非所有的部位都能順利分化出芽。因此,在組織培養(yǎng)試驗中選擇合適的外植體類型是試驗成功的重要條件之一,而培養(yǎng)基質(zhì)和培養(yǎng)條件也在組織培養(yǎng)過程中起重要作用[8-9]。本試驗選擇珍珠菜的葉片、莖段和帶葉腋莖為外植體,且結(jié)果為葉片為誘導(dǎo)叢生芽最佳外植體。在誘導(dǎo)叢生芽過程中,細(xì)胞分裂素與生長素組合有利于叢生芽的生成,其中細(xì)胞分裂素的濃度增高誘導(dǎo)效果隨之增高,且6-BA效果明顯好于KT,而細(xì)胞分裂素或生長素兩兩組合不利于叢生芽誘導(dǎo)。珍珠菜的增殖過程中,細(xì)胞分裂素和生長素的組合效果比細(xì)胞分裂素組合效果差。在移栽馴化過程中,0 d開瓶時間由于植株還沒有由異養(yǎng)轉(zhuǎn)成自養(yǎng)模式,無法從基質(zhì)中吸取營養(yǎng)與水分,所以移栽后植株易死亡,成活率低。而開瓶7 d后,可能基質(zhì)污染影響到根系,造成植株死亡,成活率降低。在基質(zhì)組合中,蛭石 ∶珍珠巖 ∶泥炭(1 ∶1 ∶1)透氣透水性最好,最利于植株生長,而泥炭基質(zhì)透氣性差,水分不易流失導(dǎo)致根部腐爛,植株死亡。本試驗成功地建立了珍珠菜組織培養(yǎng)與植株再生技術(shù)體系,對快速繁殖珍珠菜優(yōu)良品種和種質(zhì)資源的離體保存具有重要意義。

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    [5]闕怡,李厚華,付婉藝,等. 西府海棠組織培養(yǎng)體系的建立與優(yōu)化[J]. 東北林業(yè)大學(xué)學(xué)報,2013,41(5):87-90.

    [6]鄒利娟,吳慶貴,羅明華. 羅勒組培快繁技術(shù)研究[J]. 中藥材,2013,36(5):702-705.

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    [8]陳雪鵑,吳玨,李雪珂,等. 芙蓉菊組培快繁技術(shù)的研究[J]. 中南林業(yè)科技大學(xué)學(xué)報,2012,32(7):100-104,127.

    [9]全妙華,歐立軍,賀安娜,等. 天門冬組培快繁技術(shù)研究[J]. 中草藥,2012,43(8):1599-1603.

    2結(jié)果與分析

    2.1不同消毒方式對珍珠菜種子萌發(fā)率與污染率的影響

    消毒后的種子接種于MS空白培養(yǎng)基上1 d后開始出現(xiàn)污染現(xiàn)象,15 d后不再有污染現(xiàn)象出現(xiàn)。種子接種9 d開始萌發(fā),萌發(fā)時間主要集中在接種后的9~18 d。培養(yǎng)30 d統(tǒng)計的污染率和萌發(fā)率見表1,可以看出,不同消毒處理之間差異顯著,污染率隨著消毒時間的增長而下降,而種子萌發(fā)率則呈先上升后下降的趨勢。5%次氯酸鈉消毒 10 min 時,污染率為7.50%,萌發(fā)率為15.0%,消毒效果最好。

    2.2不同激素組合對叢生芽誘導(dǎo)的影響

    將無菌材料接種到培養(yǎng)基上,接種7 d后大部分葉片反卷,切口處膨大增厚,10 d開始在葉片切口處產(chǎn)生大量芽點,后逐漸發(fā)育成叢生芽。大部分莖段在接種10 d左右開始膨大,切口處生有少量芽點后形成叢生芽,少量莖段上產(chǎn)生綠色顆粒狀組織,但無進(jìn)一步分化。大部分帶葉腋莖接種后6 d在葉腋處長出嫩芽,后逐漸長成苗,切口處也會產(chǎn)生少量叢

    表1不同消毒方式下珍珠菜種子的污染率和萌發(fā)率統(tǒng)計

    3結(jié)論與討論

    3.1結(jié)論

    珍珠菜種子最佳消毒方式為5%次氯酸鈉消毒10 min,最適叢生芽誘導(dǎo)的部位為葉片,叢生芽誘導(dǎo)最佳培養(yǎng)基配方為添加6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.05 mg/L的MS培養(yǎng)基,其次為添加6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.05 mg/L的MS培養(yǎng)基。最適增殖培養(yǎng)基為MS+6-BA 1.0 mg/L,其次為MS+6-BA 1.0 mg/L+KT 2.0 mg/L培養(yǎng)基。最適生根培養(yǎng)基為 1/2MS+NAA 0.5 mg/L,其次為1/2MS+NAA 1.0 mg/L。珍珠菜移栽馴化的方法為幼苗在自然光照射下培養(yǎng)3 d后再開瓶馴化5 d,最后種植于蛭石 ∶珍珠巖 ∶泥炭(1 ∶1 ∶1)基質(zhì)中。

    3.2討論

    試驗中雖得出了種子的最佳消毒方法,但種子萌發(fā)率很低,這可能是因為珍珠菜種子較小,種皮較薄,在消毒劑浸泡過程中傷害到了種胚,致使種子不能萌發(fā)死亡,以后的試驗可

    以探索較溫和的消毒方法。由于同一植物的不同組織和器官,其再生能力有很大差距,并非所有的部位都能順利分化出芽。因此,在組織培養(yǎng)試驗中選擇合適的外植體類型是試驗成功的重要條件之一,而培養(yǎng)基質(zhì)和培養(yǎng)條件也在組織培養(yǎng)過程中起重要作用[8-9]。本試驗選擇珍珠菜的葉片、莖段和帶葉腋莖為外植體,且結(jié)果為葉片為誘導(dǎo)叢生芽最佳外植體。在誘導(dǎo)叢生芽過程中,細(xì)胞分裂素與生長素組合有利于叢生芽的生成,其中細(xì)胞分裂素的濃度增高誘導(dǎo)效果隨之增高,且6-BA效果明顯好于KT,而細(xì)胞分裂素或生長素兩兩組合不利于叢生芽誘導(dǎo)。珍珠菜的增殖過程中,細(xì)胞分裂素和生長素的組合效果比細(xì)胞分裂素組合效果差。在移栽馴化過程中,0 d開瓶時間由于植株還沒有由異養(yǎng)轉(zhuǎn)成自養(yǎng)模式,無法從基質(zhì)中吸取營養(yǎng)與水分,所以移栽后植株易死亡,成活率低。而開瓶7 d后,可能基質(zhì)污染影響到根系,造成植株死亡,成活率降低。在基質(zhì)組合中,蛭石 ∶珍珠巖 ∶泥炭(1 ∶1 ∶1)透氣透水性最好,最利于植株生長,而泥炭基質(zhì)透氣性差,水分不易流失導(dǎo)致根部腐爛,植株死亡。本試驗成功地建立了珍珠菜組織培養(yǎng)與植株再生技術(shù)體系,對快速繁殖珍珠菜優(yōu)良品種和種質(zhì)資源的離體保存具有重要意義。

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