嗜熱β-甘露聚糖酶的研究進展

王彩虹， 牛燦芳， 羅會穎， 楊培龍， 姚 斌

農(nóng)業(yè)部飼料生物技術(shù)重點實驗室，中國農(nóng)業(yè)科學院飼料研究所，北京 100081

半纖維素是目前世界上存在的第二大豐富的雜聚合物，通常與纖維素和木質(zhì)素一起存在于植物細胞壁中［1，2］。甘露聚糖和木聚糖一起構(gòu)成了半纖維素的主要成分［3，4］。完全消化甘露聚糖需要幾種酶的協(xié)同作用，包括β-1，4-甘露聚糖酶、β-甘露糖苷酶、β-葡萄糖苷酶和 α-半乳糖苷酶等。

β-甘露聚糖酶是一類能水解含甘露糖的多糖水解酶的總稱，根據(jù)酶作用底物特異性和作用特點可以分為外切β-甘露聚糖酶和內(nèi)切β-甘露聚糖酶兩種類型［5］。β-甘露聚糖酶屬于半纖維素酶類，現(xiàn)已被廣泛應用于飼料、造紙、洗滌劑、食品和石油開采等行業(yè)，以及尚未完全開發(fā)的生物質(zhì)能源等領域，例如在乙醇生產(chǎn)過程中，一系列的酶類包括纖維素酶類、木聚糖酶和甘露聚糖酶等一起作用可以有效地將木質(zhì)纖維素類物質(zhì)水解為糖類［6］。大多數(shù)工業(yè)應用領域需要在高溫環(huán)境中進行［7］，為了滿足工業(yè)應用的需求，尋找與改造能在高溫環(huán)境中起催化作用的嗜熱酶是一個急需解決的問題，因此，對嗜熱β-甘露聚糖酶進行結(jié)構(gòu)和功能的研究具有很高的理論價值和實際意義［8］。

1 β-甘露聚糖酶

1.1 β-甘露聚糖酶的來源

β-甘露聚糖酶的來源非常廣泛，包括動植物和微生物。其中動物來源主要是低等動物(如蝸牛和海洋軟體動物等)的腸道分泌液，哺乳動物體內(nèi)一般不含此酶。Yamaura等［9］從海螺和一種海洋軟體動物中純化出了內(nèi)切β-甘露聚糖酶;Xu等［10］從軟體動物貽貝中也分離純化得到了β-甘露聚糖酶。許多植物(如蘆筍、咖啡、胡蘿卜、魔芋、四棱豆、長角豆、咖啡豆和瓜兒豆等)萌發(fā)的種子以及番茄果實和種子中都含有甘露聚糖酶［11］。而微生物是甘露聚糖酶的最主要來源，包括細菌、真菌和放線菌等。截至目前，研究較多的是細菌類的芽胞桿菌、枯草桿菌和假單胞菌，真菌類的曲霉、里氏木霉，以及放線菌類的鏈霉菌等［12］。微生物來源的β-甘露聚糖酶優(yōu)點很多，包括酶活性高、提取方便、生產(chǎn)成本低、pH和溫度作用范圍廣以及底物專一性較高等。因此，微生物來源的β-甘露聚糖酶已成為工業(yè)用酶的主要來源和近年來的研究熱點。尤其極端微生物生長的特殊條件與工業(yè)環(huán)境很相近，隨著對嗜熱酶反應機理和分子生物學研究的逐步深入，開發(fā)嗜熱酶產(chǎn)品具有廣闊的前景［13］。

1.2 β-甘露聚糖酶的分類

β-甘露聚糖酶根據(jù)最適pH的不同可分為酸性β-甘露聚糖酶、中性β-甘露聚糖酶和堿性β-甘露聚糖酶;根據(jù)最適溫度的不同，可分為嗜熱β-甘露聚糖酶、中溫β-甘露聚糖酶和低溫β-甘露聚糖酶。嗜熱甘露聚糖酶常用的獲取途徑包括:從嗜熱微生物中直接分離獲得，從常規(guī)生物來源中獲得，或通過蛋白質(zhì)工程、基因改造的方法獲得。

糖苷水解酶由催化模塊、非催化的碳水化合物結(jié)合模塊以及l(fā)inker區(qū)和其他一些輔助模塊組成［14］。根據(jù)催化域氨基酸序列及結(jié)構(gòu)特征，糖苷水解酶被劃分為133個家族。β-甘露聚糖酶屬于糖苷水解酶(GH)5、26或113家族。截至目前(2014年8月)，公共數(shù)據(jù)庫中(Genbank和 http://www.cazy.org/)已經(jīng)報道的β-甘露聚糖酶序列共有232個，包括GH5家族126個(其中細菌來源的56個，真菌來源的70個)，GH26家族104個(其中細菌來源的88個，真菌來源的9個，另有7個未進行分類)，GH113家族目前報道的只有2個(均來源于細菌)。其中有22個β-甘露聚糖酶開展了蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)解析研究，包括GH5家族14個(其中細菌來源的8個，真菌來源的有6個)，GH26家族7個(其中細菌來源的5個，真菌來源的2個)及GH113家族1個(來源于細菌)。根據(jù)序列的相似性，GH5甘露聚糖酶又被分為三個亞家族，包括GH5-7、GH5-8和GH5-10［15］。序列相似性在25%以上的甘露聚糖酶歸為同一個亞家族，其中細菌來源的GH5甘露聚糖酶多屬于GH5-8亞家族，真菌來源的GH5甘露聚糖酶多屬于GH5-7亞家族。盡管已知GH5和GH26在親核基團、供體質(zhì)子和折疊方式上均相似，但是它們序列相似性不高。甘露聚糖酶氨基酸序列的保守性在不同類生物個體及不同家族酶蛋白之間有較大差別。

1.3 β-甘露聚糖酶的作用方式和水解產(chǎn)物

β-甘露聚糖酶屬于典型的(β/α)8桶狀結(jié)構(gòu)，催化殘基分別位于第4和第7 β折疊片上，且至少有4個殘基與底物結(jié)合位點有關(guān)［16］。不同酶中碳水化合物結(jié)合模塊共發(fā)現(xiàn)38 674個，其分類共分布在69個家族和215個未分類的碳水化合物結(jié)合模塊(carbohydrate-binding module，CBM)家族。

根據(jù)構(gòu)成，可以將催化底物甘露聚糖分為四類:均一甘露聚糖(β-1，4-D-甘露糖構(gòu)成的主鏈)、葡甘露聚糖(β-1，4-D-甘露糖和 β-1，4-D-葡萄糖構(gòu)成的主鏈)、半乳甘露聚糖(帶有半乳糖側(cè)鏈的β-1，4-D-甘露糖)和半乳葡甘露聚糖(帶有半乳糖側(cè)鏈的 β-1，4-D-甘露糖和 β-1，4-D-葡萄糖構(gòu)成的主鏈)［17］。這些多糖均呈線狀的或分枝的多糖苷鏈。甘露聚糖存在于自然界中的許多植物中，半乳糖甘露聚糖大多存在于長角豆和瓜兒豆的胚乳中，而葡萄糖甘露聚糖大多存在于魔芋球莖中。不同來源的甘露聚糖有著不同的構(gòu)成，它們的分子量以及主側(cè)鏈的組成均不相同(見表1)。

β-1，4-甘露聚糖酶的活性受到側(cè)鏈以及主鏈上D-葡萄糖的含量的影響。α-半乳糖殘基和葡萄糖殘基在主鏈中的位置、含量及酯酞化的程度，底物本身的物理狀態(tài)(例如溶液的黏度和底物狀態(tài))也會影響不同來源的β-甘露聚糖酶的鏈切割方式和水解程度。例如結(jié)晶態(tài)的甘露聚糖就不易被酶降解［19，20］，朱劼等［20］在酸性 β-甘露聚糖酶的固態(tài)發(fā)酵工藝研究中發(fā)現(xiàn)水與固料的比例為1.2∶1時要比0.8∶1時酶活高出1.6倍。有學者研究甘露聚糖酶降解魔芋膠或槐豆膠時，作用于多糖鏈非還原端的第3個或第4個糖分子，降解產(chǎn)物為 MG、GM、MM、GG、MMM、GGM、GMM、MGM、MMMM、GMMG、GMMM、GGMM 和 MMMMM［21］。雖然不同來源甘露聚糖酶的切割方式和水解程度不同，但主要產(chǎn)物都是低聚糖，很少產(chǎn)生或不產(chǎn)生單糖，如 Han等［22］發(fā)現(xiàn) Man5A-TM1和 Man5ATM2分解多聚糖為聚合度大于3的低聚糖;Bacillus sp.MSJ-5來源的甘露聚糖酶水解多聚糖為二糖至六糖，以及非常少量的單糖［23］。

表1 不同來源的甘露聚糖的組成［18］ Table 1 The composition of different sources of mannans.

2 嗜熱β-甘露聚糖酶的研究進展

2.1 嗜熱微生物與嗜熱酶

能夠在極端環(huán)境下生長的微生物稱為極端微生物［24］。根據(jù)極端微生物的不同生活環(huán)境，極端微生物又被分為嗜鹽菌、嗜熱菌、嗜壓菌和嗜酸菌等。極端微生物能夠生產(chǎn)一些具有商業(yè)價值的工業(yè)產(chǎn)品，例如，酶、抗生素和激素等［25，26］。大多數(shù)微生物的生長溫度范圍為20～45℃之間，而將能夠在45℃以上正常生長的微生物稱為嗜熱微生物［27］。其中嗜熱細菌和嗜熱古菌近來一直是人們研究的主要對象，而對嗜熱真菌的關(guān)注則要少一些。

嗜熱酶是一類酶催化最適反應溫度為60℃以上的酶，主要是從嗜熱微生物中獲得［28］。從20世紀90年代開始，生物科技的發(fā)展和應用促進了人們對嗜熱酶的探索研究［29］。研究發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)嗜熱微生物產(chǎn)生的嗜熱酶在高溫條件下具有良好的熱穩(wěn)定性，克服了中溫酶(20～55℃)和低溫酶(2～20℃)在工業(yè)應用中活性不穩(wěn)定的現(xiàn)象。在工業(yè)應用中，嗜熱酶較中溫酶有非常明顯的優(yōu)勢:第一，可降低酶制劑的成本。由于嗜熱酶的穩(wěn)定性好，使得該類酶即使在室溫下進行分離提純、包裝運輸也不失活，這就大大降低了生產(chǎn)成本。第二，可提高反應的催化效率。由于反應溫度的提高，使得分子運動速度加快，繼而酶催化能力大大加強。第三，能夠降低反應能耗。由于嗜熱酶具有較高的熱穩(wěn)定性，使得在生產(chǎn)中不需要復雜的冷卻裝置來進行溫度的調(diào)節(jié)，這樣在降低生產(chǎn)成本、減少能耗的同時，也減少了冷卻過程對環(huán)境所造成的污染。第四，降低雜菌的污染。嗜熱酶往往具有較高的反應溫度(大于60℃)，在此溫度下，少有雜菌能夠生存，繼而減少了細菌代謝物對產(chǎn)物的污染。第五，對化學變性劑及相關(guān)金屬離子具有較高的耐受力，因此擴大了酶反應的適用范圍［30，31］。

嗜熱酶較高的反應活性以及較好的穩(wěn)定性，使得它在生物質(zhì)能源、化學制品、食品、飼料、醫(yī)藥和石油開采等方面都有廣泛的應用前景。但是目前從天然環(huán)境中獲得的嗜熱甘露聚糖酶較少［32～34］，而且天然存在的嗜熱甘露聚糖酶的熱穩(wěn)定性并不理想，影響了其在生產(chǎn)應用中的效果，如盧海強等［33］的Man5XZ7最適溫度為80℃，但僅在50℃下保持穩(wěn)定。再者，動物體內(nèi)消化道為酸性環(huán)境，飼料用甘露聚糖酶應在強酸性條件下能發(fā)揮作用，但目前已獲得的嗜熱甘露聚糖酶的最適 pH 大多都在 4.0 ～ 5.0［33，34］。因此，為了更好地適應工業(yè)生產(chǎn)的需要，已開始嘗試通過基因改造的方法提高甘露聚糖酶的熱穩(wěn)定性并改變其酸堿適應性。

2.2 嗜熱β-甘露聚糖酶及資源篩選

嗜熱β-1，4-甘露聚糖酶具有高比活，以及高溫下高活性的特點［7，34］，在很多工業(yè)領域都倍受關(guān)注。例如酶法水解半乳甘露聚糖被應用于石油和天然氣行業(yè)來提高石油和天然氣的開采率，由于石油開采需要80℃以上的極端溫度，應用嗜熱甘露聚糖酶非常適合［7］。到目前為止，已報道的嗜熱甘露聚糖酶約有30個，其中，最適溫度大于80℃的極端嗜熱甘露聚糖酶有6個(見表2)。

表2 最適溫度大于80℃的極端嗜熱甘露聚糖酶 Table 2 Extremely thermophilic mannanases with optimum temperature higher than 80℃.

之前大多數(shù)已經(jīng)報道的嗜熱甘露聚糖酶都屬于26家族［35］，但近幾年從真菌中分離得到了屬于5家族成員的極端嗜熱甘露聚糖酶，包括來自Aspergillus niger BK01 的 ManBK［32］，來自 Aspergillus nidulans XZ7 的 Man5XZ7［33］和來自 Talaromyces leycettanus JCM12802 的 Man5A［34］。

2.3 嗜熱β-甘露聚糖酶的特性

在微生物來源的甘露聚糖酶中，已有90個GH5 β-甘露聚糖酶進行了酶學性質(zhì)的測定，其中42個來源于細菌，48個來源于真菌。GH26中有41個進行了酶學性質(zhì)的測定，其中34個來源于細菌，只有7個來源于真菌。而113家族中目前只有一個進行了酶學性質(zhì)的測定，其來源于細菌。

目前已經(jīng)報道的甘露聚糖酶的最適溫度大多在50～60℃之間。而關(guān)于嗜熱甘露聚糖酶的報道還較少。真菌來源的甘露聚糖酶最適溫度最高的為 90℃，來源 于 Talaromyces leycettanus JCM12802［34］，其次是來源于 A.nidulans XZ3 的Man5XZ3［38］和來源于 Aspergillus niger BK01 的ManBK［39］，最適溫度均為80℃。細菌甘露聚糖酶最適溫度最高的為90℃，來源于Thermotoga neapolitana［35］。

2.4 甘露聚糖酶的嗜熱性分子改良

影響甘露聚糖酶蛋白嗜熱的結(jié)構(gòu)因素有很多，包括氫鍵、鹽橋和二硫鍵等。在 β-甘露聚糖酶嗜熱改良方面，已經(jīng)有多個報道，在β-甘露聚糖酶熱穩(wěn)定性的結(jié)構(gòu)研究方面也已經(jīng)取得了一定的進展［40］。目前，主要是通過對從自然界中獲得的甘露聚糖酶進行理性設計，通過同源建模、分子對接、二級結(jié)構(gòu)分析以及動力學模擬等手段對其進行分子改良從而獲得嗜熱的β-甘露聚糖酶。此外，也有文獻報道糖基化修飾以及碳水化合物結(jié)合模塊對甘露聚糖酶的熱穩(wěn)定性有影響［40］。

2.4.1 N-糖基化修飾 糖基化是在酶的控制下，蛋白質(zhì)或脂質(zhì)附加上糖類的過程。糖基化發(fā)生于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中。蛋白質(zhì)經(jīng)過糖基化作用之后，可形成糖蛋白。蛋白質(zhì)糖基化可以根據(jù)糖苷鏈類型的不同分為四類，包括-O-糖苷鍵型(以絲氨酸、蘇氨酸、羥賴氨酸和羥脯氨酸的羥基為連接點形成);-N-糖苷鍵型(以天冬酞胺的酚胺基、N末端氨基酸的α-氨基以及賴氨酸或精氨酸的ω-氨基為連接點形成);醋糖苷鍵型(以天冬氨酸或谷氨酸的游離羧基為連接點形成)以及以半胱氨酸為連接點的糖苷鍵。

目前已經(jīng)有多篇文獻報道N-糖基化對酶的熱穩(wěn)定性的促進作用。如謝春芳等［41］以來源于Armillariella tabescens的β-甘露聚糖酶 Man47為研究對象，利用計算化學對Man47進行理性設計，經(jīng)過分子對接、二級結(jié)構(gòu)分析和糖基化的可行性分析后，構(gòu)建具有 EAS(enhanced aromatic sequence)序列的突變體G-123作為N-糖基化的突變位點以提高其熱穩(wěn)定性。王彩虹等［34］從Talaromyces leycettanus JCM12802中獲得的Man5A，其糖基化程度高的蛋白Man5A1在70℃下處理1 h，酶活沒有損失，而糖基化程度低的蛋白Man5A2只剩余了40%的酶活。Fonseca-Maldonado等［42］和 Wei等［43］也報道了類似的研究結(jié)果。研究顯示，N-糖基化提高酶的熱穩(wěn)定性可能是由于N-糖基化減少了蛋白的不正確折疊從而提高了蛋白折疊的可逆性［44］。

2.4.2 碳水化合物結(jié)合模塊對熱穩(wěn)定性的影響 糖苷水解酶中的碳水化合物結(jié)合模塊(CBM)結(jié)構(gòu)域可能會促進酶與底物的聯(lián)系，從而促進酶的熱穩(wěn)定性。目前已經(jīng)有很多文獻報道CBM對甘露聚糖酶的熱穩(wěn)定性有促進作用。王彩虹等［34］從 Talaromyces leycettanus JCM12802 中獲得的Man5A，在70℃處理1 h，Man5A可以維持幾乎100%的活性，然而其去掉 CBM(ManACBM)后穩(wěn)定性明顯降低，ManA-CBM僅維持70%的活性。盧海強等［38］從Aspergillus nidulans XZ3中獲得的Man5XZ3的熱穩(wěn)定性要明顯優(yōu)于去掉CBM 后的 Man5ΔCBM，Man5XZ3在60℃處理1 h能維持50%的酶活，Man5ΔCBM僅能維持30%左右。

3 展望

到目前為止，嗜熱β-甘露聚糖酶的研究已經(jīng)取得了很大的進展。首先，在嗜熱β-甘露聚糖酶的基因資源挖掘方面，已經(jīng)從嗜熱微生物中發(fā)現(xiàn)了6個最適溫度大于80℃的極端嗜熱甘露聚糖酶，其中 Aspergillus niger BK01 來源的 ManBK［39］和TalaromycesleycettanusJCM12802來源的Man5A［34］的熱穩(wěn)定溫度都能達到70℃。今后利用生物信息學分析、環(huán)境基因組或轉(zhuǎn)錄組功能基因的直接克隆等技術(shù)將大大加快嗜熱β-甘露聚糖酶基因資源的獲得。

很多β-甘露聚糖酶雖然極端嗜熱，但是存在熱穩(wěn)定性差、不能在酸性環(huán)境發(fā)揮作用，以及表達量低等特點。因此在今后研究的重點將集中于以下幾個方面。第一，通過生物信息學分析對嗜熱甘露聚糖酶進行改造，以適應生產(chǎn)需求;第二，對影響外源嗜熱甘露聚糖酶的轉(zhuǎn)譯、轉(zhuǎn)運和分泌等相關(guān)的分子機制進行研究，構(gòu)建基于受體菌株優(yōu)化、基因優(yōu)化、表達元件優(yōu)化、目標基因定點整合與拷貝數(shù)控制技術(shù)等的高效生物反應器，以提高表達量。目前，嗜熱甘露聚糖酶基因序列及其酶蛋白結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)不斷累積，新的具有嗜熱特性天然酶也時有發(fā)現(xiàn)，計算機輔助酶分子模擬技術(shù)的發(fā)展使人們對嗜熱β-甘露聚糖酶的嗜熱機制及快速分子改良研究成為可能。

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