游離脂肪酶催化蓖麻油制備蓖麻油酸

楊 威， 杜 偉， 劉德華

清華大學(xué)化學(xué)工程系應(yīng)用化學(xué)實(shí)驗(yàn)室，北京 100084

高級(jí)脂肪酸是油脂化工產(chǎn)品中最重要的基礎(chǔ)化學(xué)品之一［1］，其中的蓖麻油酸是工業(yè)應(yīng)用中唯一的羥基脂肪酸。蓖麻油酸是蓖麻油的水解產(chǎn)物，在蓖麻油中占脂肪酸組成的90%左右，遠(yuǎn)高于其他油脂中最高的脂肪酸含量比例［2］。蓖麻油酸也稱為12-羥油酸，可直接作為添加劑應(yīng)用于紡織、制皂和樹脂等行業(yè)［3］。因蓖麻油酸具有特殊的羥基和不飽和雙鍵，它最重要的應(yīng)用是作為中間體生成眾多衍生物，在增塑劑、兩性表面活性劑產(chǎn)業(yè)中具有不可替代的地位［4］。此外，產(chǎn)蓖麻油植物蓖麻出油率高、耐干旱且耐鹽堿，因此易于種植和相關(guān)產(chǎn)業(yè)鏈的開發(fā)［5］。

利用蓖麻油獨(dú)特羥基基團(tuán)的眾多反應(yīng)雖然能夠制備許多重要衍生物，但羥基的存在也對(duì)蓖麻油的加工工藝造成了不利的影響，如體系粘度大，易發(fā)生副反應(yīng)等［6］。目前大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)中最常用的油脂水解方法為高溫高壓法［7］，這種方法生產(chǎn)效率高，但應(yīng)用于催化蓖麻油水解易形成聚酯且產(chǎn)物顏色深，導(dǎo)致后續(xù)純化代價(jià)高。傳統(tǒng)的先皂化后酸化的油脂水解方法相對(duì)于高溫高壓法要溫和的多，蓖麻油在該方法處理下水解效率高，但生成的脂肪酸帶有特殊的氣味和顏色，且該過程會(huì)產(chǎn)生大量難以處理的廢水和鹽［8］。選用生物酶法水解油脂可以克服以上兩種應(yīng)用最為普遍的油脂水解方法的缺點(diǎn)，在溫和條件下獲得高質(zhì)量的產(chǎn)物，且具有環(huán)境友好特性［8］。其中固定化脂肪酶水解法以其易分離、穩(wěn)定性高等優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于天然油脂水解的研究中，其在蓖麻油水解中已取得一定進(jìn)展，但普遍存在水解效率低的問題。以水解效果較好的褶皺假絲酵母脂肪酶和KKA-5 脂肪酶為例。Goswami等［10，11］對(duì)固定化的褶皺假絲酵母脂肪酶催化蓖麻油水解進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化，在最優(yōu)條件下6 h蓖麻油酸得率為63%。Sharon 等［12，13］研究了不同金屬離子對(duì) KKA-5 脂肪酶催化蓖麻油水解的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)加入Mg2+效果最佳，192 h水解率為87%。同時(shí)由于固定化脂肪酶成本相對(duì)較高，其推廣應(yīng)用仍存在一定限制。

與固定化脂肪酶相比，游離脂肪酶具有生產(chǎn)成本較低、油水界面活性高等優(yōu)點(diǎn)，且通過離心分離可重復(fù)使用，是生物酶在油脂化學(xué)中新的研究方向。本課題組前期研究工作表明，游離脂肪酶NS81006在催化大豆油及其多種低品質(zhì)的含酸廢棄油脂甲酯化制備生物柴油中表現(xiàn)出良好的催化效果。由此，進(jìn)一步考察NS81006催化油脂水解，對(duì)游離脂肪酶在油脂工業(yè)應(yīng)用的拓展具有重要意義。

本文系統(tǒng)研究了不同因素對(duì)游離脂肪酶NS81006催化蓖麻油水解過程的影響，并通過離心回收乳化層的方式重復(fù)使用游離脂肪酶，考察其回用穩(wěn)定性。將該游離脂肪酶水解蓖麻油與工業(yè)生產(chǎn)中常用的高溫高壓法水解蓖麻油的效果進(jìn)行了比較，為其工業(yè)應(yīng)用提供了依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

游離脂肪酶NS81006，來源于黑曲霉(Aspergillus niger)，諾維信公司產(chǎn)品;固定化脂肪酶Novozym435，來源于南極假絲酵母(Candida antarctica)，諾維信公司產(chǎn)品;化學(xué)純蓖麻油，購自西隴化工股份有限公司;蓖麻油毛油，購自國華油脂有限公司;95%乙醇、無水乙醇、NaOH、KOH，均為分析純，購自北京化工廠。三丁酸甘油酯，分析純，ACROS ORGANICS公司產(chǎn)品。

XS105 Dualrange分析天平(瑞士METTLER TOLEDO公司);HQ45A恒溫空氣搖床(中國科學(xué)院武漢科學(xué)儀器廠);CR22F高速離心機(jī)(日本HITACHI公司);TFCF5-15型高溫高壓釜(天舟海泰科技公司);CA-05卡爾菲休水分測定儀(日本三菱化學(xué)工業(yè)公司)。

1.2 蓖麻油理化性質(zhì)測定

采用GB/T 2559-2005方法測定蓖麻油的皂化值，GB/T 5009.37-2003方法測定蓖麻油的酸價(jià)，GB/T 2559-2003方法測定蓖麻油的碘值，GB/T 18619.1-2002方法測定蓖麻油含水量。

1.3 脂肪酶水解活力的測定

酶活力單位(U)定義:每分鐘催化三丁酸甘油脂水解產(chǎn)生1 μmoL/L丁酸所需的酶量為一個(gè)酶活單位。將1.0 mL三丁酸甘油酯與3.0 mL Gly-NaOH緩沖液(pH 9.4)加入50 mL具塞三角瓶中，在140 r/min、40℃恒溫空氣搖床中振蕩乳化15 min后，取出并加入脂肪酶，再置回恒溫空氣搖床中，10 min后取出立即加入10 mL 95%乙醇和3滴酚酞指示劑，并用0.1 mol/L NaOH溶液滴定。重復(fù)上述步驟但不加酶制劑即為空白實(shí)驗(yàn)。

脂肪酶酶活力的計(jì)算公式為:

其中，V1為滴定樣品所消耗的NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液體積(mL);V0為滴定空白所消耗的NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液體積(mL);V為加入的游離脂肪酶酶液的體積(mL)。

1.4 蓖麻油酸的制備

游離脂肪酶催化蓖麻油水解步驟為:在500 mL三口瓶中加入一定比例的蓖麻油、去離子水和游離脂肪酶，控制反應(yīng)溫度和攪拌速度進(jìn)行水解反應(yīng)(見圖1)，定時(shí)觀察反應(yīng)現(xiàn)象并取樣，經(jīng)高速離心后取上層油相，測定其酸價(jià)。

高溫高壓法水解步驟為:在高壓釜中加入一定比例的蓖麻油和去離子水，在高溫高壓條件下進(jìn)行水解反應(yīng)，定時(shí)取樣，經(jīng)高速離心后取上層油相，測定其酸價(jià)。

圖1 蓖麻油水解實(shí)驗(yàn)裝置示意圖 Fig.1 Schematic diagram of castor oil hydrolysis experimental installation.

根據(jù)測定的酸價(jià)可計(jì)算出蓖麻油水解率，即:

1.5 游離脂肪酶NS81006催化蓖麻油水解回用穩(wěn)定性研究

單批次反應(yīng)24 h后，隔夜靜置，反應(yīng)體系達(dá)分層穩(wěn)定，回收水層和油層之間的乳化層并應(yīng)用到下一個(gè)批次反應(yīng)。通過測量蓖麻油水解率隨反應(yīng)批次的變化情況判斷游離脂肪酶的回用穩(wěn)定性。

2 結(jié)果與分析

2.1 反應(yīng)溫度的影響

反應(yīng)溫度對(duì)于油脂水解反應(yīng)的平衡具有顯著的影響。水解反應(yīng)宏觀上為吸熱反應(yīng)，高溫有利于油脂反應(yīng)的進(jìn)行，但是過高的溫度會(huì)導(dǎo)致游離脂肪酶喪失催化活性。對(duì)不同反應(yīng)溫度下蓖麻油水解度隨時(shí)間變化的實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示。從結(jié)果看出，在所選不同溫度下，NS81006催化蓖麻油水解反應(yīng)曲線形狀相似。在開始2 h內(nèi)反應(yīng)迅速，水解率可達(dá)50%，后期水解率呈逐步上升，24 h后達(dá)到較為穩(wěn)定的狀態(tài)。當(dāng)溫度為45℃時(shí)，蓖麻油水解效果最佳。溫度提高到50℃或降低到40℃，水解率在相同反應(yīng)時(shí)間都有不同程度的下降。

2.2 酶添加量的影響

圖2 不同溫度下蓖麻油水解率 Fig.2 Hydrolysis rates of castor oil at different temperatures.

酶的添加量的多少不僅影響油脂水解反應(yīng)速率，也在很大程度上決定了該工藝流程的成本。根據(jù)測定，NS81006酶活為3 340 U/mL，在足夠的水量和適宜溫度下，選擇了不同酶用量催化蓖麻油水解，結(jié)果如圖3所示。結(jié)果顯示水解率隨酶用量增加而增加，但單位酶用量對(duì)水解率的貢獻(xiàn)逐漸減小。以24 h的水解率為例，當(dāng)酶用量達(dá)100 U/g油時(shí)，水解率為90.2%，繼續(xù)增加酶用量至167 U/g油，水解率增加到 93.8%，提高了3.6%。而再增加酶用量分別至267 U/g油和333 U/g油時(shí)，水解率分別提高2.3%和1.7%。因此，在保證水解速率的同時(shí)使單位成本酶的效用最大化，應(yīng)該選擇酶用量在100～167 U/g油范圍內(nèi)。

2.3 水用量的影響

圖3 不同酶添加量下蓖麻油水解率 Fig.3 Hydrolysis rates of castor oil under different enzyme dosage.

蓖麻油水解反應(yīng)是可逆反應(yīng)，隨著反應(yīng)進(jìn)行，水相中甘油濃度會(huì)增加，逆向反應(yīng)隨之加強(qiáng)，因此增加水在反應(yīng)體系中的含量可以推動(dòng)反應(yīng)平衡右移，同時(shí)促進(jìn)反應(yīng)體系的乳化，為游離脂肪酶提供了更多的活化界面。兼顧反應(yīng)器設(shè)計(jì)加工和后期水相處理等，水用量也不宜過多，因此實(shí)驗(yàn)選擇了油水質(zhì)量比1∶0.5～1∶4的一系列條件進(jìn)行研究，結(jié)果如圖4。

圖4 不同水用量下蓖麻油水解率 Fig.4 Hydrolysis rates of castor oil under different water usage.

從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，整體上水解率隨著水用量的增加而增加。在油水質(zhì)量比高于1∶1時(shí)，在所選條件下48 h水解率相當(dāng)，均超過94%。因此選擇油水質(zhì)量比1∶1能夠保證較快的蓖麻油水解反應(yīng)速度和較高的最終水解率。

2.4 酶用量和水用量的組合優(yōu)化

在所研究的脂肪酶催化蓖麻油水解的影響因素中，酶用量和水用量作為水解反應(yīng)的催化劑和反應(yīng)物影響極為關(guān)鍵，且兩者的比例變化會(huì)導(dǎo)致體系乳化程度出現(xiàn)差異。根據(jù)前述對(duì)NS81006催化蓖麻油水解影響因素的研究，選擇酶用量100 U/g油、167 U/g油與不同油水質(zhì)量比進(jìn)行組合實(shí)驗(yàn)，以期獲得更高水解效率的優(yōu)化條件。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出(見圖5)，與酶用量100 U/g油，油水質(zhì)量比1∶0.5的條件比較，提高酶用量至167 U/g油同時(shí)減小油水質(zhì)量比到1∶0.25，反應(yīng)48 h水解率從92.1%降到88.8%。這說明了水用量偏低會(huì)造成水解率降低，且不能通過酶用量的增加來彌補(bǔ)。對(duì)于48 h水解率最高且相當(dāng)?shù)膬山M，酶用量167 U/g油、油水質(zhì)量比1∶0.5的水解率為95.2%;酶用量100 U/g油、油水質(zhì)量比1∶1的水解率為94.8%。考慮到游離脂肪酶成本遠(yuǎn)高于水，因此選擇酶用量100 U/g油，油水質(zhì)量比1∶1。

圖5 不同酶用量和水用量組合條件下蓖麻油水解率 Fig.5 Hydrolysis rates of castor oil under different combinations of enzyme dosage and water usage.

2.5 攪拌速度的影響

游離脂肪酶在水解反應(yīng)體系中會(huì)集中在油水界面上，具有乳化作用。攪拌能夠增加體系混合程度，增大油水表面積，使酶和底物更好地接觸。實(shí)驗(yàn)選擇了150～1 000 r/min的一系列攪拌速度進(jìn)行研究，結(jié)果如圖6。

圖6 不同攪拌速度下蓖麻油水解率 Fig.6 Hydrolysis rates of castor oil at different stirring speeds.

可以看出，水解率隨著攪拌速度增加而增加，即反應(yīng)體系混合越充分，水解反應(yīng)速率越快。當(dāng)在500 mL三口瓶中攪拌速度達(dá)800 r/min以上時(shí)，24 h水解率可達(dá)90%以上，而提高攪拌速度至1 000 r/min后，相同時(shí)間下水解率沒有明顯變化，因此選擇800 r/min為最適攪拌速度。

2.6 酶的重復(fù)使用

在生物酶的應(yīng)用過程中，酶的循環(huán)利用可有效降低酶的使用成本。因此，在游離脂肪酶NS81006催化蓖麻油水解的過程中，考察游離脂肪酶NS81006的回用穩(wěn)定性尤為重要。前期研究表明，反應(yīng)結(jié)束后，體系自上而下分為油層、乳化層和水層，游離脂肪酶主要集中在乳化層，少部分存在于水層。若回收水相則其中的甘油會(huì)抑制水解反應(yīng)進(jìn)行，因此僅將乳化層直接回復(fù)使用，考察其催化蓖麻油水解的效果，結(jié)果如圖7所示。

研究結(jié)果表明，在游離脂肪酶NS81006催化蓖麻油水解的過程中，NS81006連續(xù)回用5個(gè)批次，蓖麻油水解率仍保持75%以上?；赜眠^程中，水解率隨著批次增加不斷下降，主要原因是部分酶存在于水層，回收酶過程中還不可避免會(huì)造成脂肪酶的損失。

圖7 各回用批次下蓖麻油水解率 Fig.7 Hydrolysis rates of castor oil in different recovery batches.

2.7 高溫高壓法水解蓖麻油

油脂高溫高壓水解法具有水解率高、處理量大等優(yōu)點(diǎn)，是目前世界普遍采用的先進(jìn)工藝，但其操作溫度高，不適合用于含羥基的蓖麻油水解。實(shí)驗(yàn)分析了高溫高壓法水解蓖麻油反應(yīng)速率提高幅度和副反應(yīng)發(fā)生的程度，同時(shí)比較了攪拌與否帶來的差異，結(jié)果如圖8。從圖中可以看出，高溫高壓法水解蓖麻油速率明顯高于酶法。在攪拌操作下，水解率2 h接近70%，酶法達(dá)到相同水平需要約8 h，但高溫高壓法最高水解率僅為75%，遠(yuǎn)低于酶法可以達(dá)到的95%左右的水解率。另外，在未攪拌情況下，蓖麻油水解在開始后1 h內(nèi)存在較大傳質(zhì)阻力，而1 h后反應(yīng)速率加快，與攪拌時(shí)前2 h反應(yīng)速率相當(dāng)。該現(xiàn)象表明在高溫高壓條件下，當(dāng)反應(yīng)體系進(jìn)入平衡狀態(tài)后，攪拌的存在對(duì)水解反應(yīng)促進(jìn)作用很小。同時(shí)可以看出不論在是否有攪拌的情況下，高溫高壓條件下蓖麻油水解率均會(huì)出現(xiàn)下降的情況，這說明水解后期副反應(yīng)成為主導(dǎo)，很可能是產(chǎn)物蓖麻油酸與帶有羥基的甘油三酯及其本身發(fā)生酯化反應(yīng)，形成聚酯，從而導(dǎo)致酸價(jià)下降，水解率也因此下降。當(dāng)然，高溫下高級(jí)脂肪酸的熱敏性共軛雙鍵也可能發(fā)生斷裂，但這不會(huì)直接引起水解率的變化。

圖8 高溫高壓條件下蓖麻油水解率 Fig.8 Hydrolysis rates of castor oil under conditions of high temperature and pressure.

3 討論

通過對(duì)酶法催化油脂水解影響較大的幾個(gè)因素分別進(jìn)行研究，得到游離脂肪酶NS81006催化蓖麻油水解的最佳反應(yīng)條件為:溫度45℃，酶添加100 U/g油，油水質(zhì)量比 1∶1，攪拌速度800 r/min。該條件下反應(yīng)48 h水解率可達(dá)94.8%，相比目前文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果優(yōu)勢明顯。對(duì)脂肪酶回用的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)重復(fù)使用脂肪酶至第5批次，仍能有效催化蓖麻油水解，水解率76.8%。同時(shí)對(duì)高溫高壓條件下的蓖麻油水解的研究發(fā)現(xiàn)，采用該方法，蓖麻油水解率難以達(dá)到較高水平，最高在75%左右，且反應(yīng)后期由于副反應(yīng)的發(fā)生出現(xiàn)水解率下降的現(xiàn)象，說明該方法不適宜用于蓖麻油的水解。游離脂肪酶NS81006催化蓖麻油進(jìn)行水解雖然成本相對(duì)較高，但其集反應(yīng)條件溫和、環(huán)境友好、原料適應(yīng)性強(qiáng)和水解率高等優(yōu)點(diǎn)于一體，具有較好的應(yīng)用前景。

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