轉(zhuǎn)基因技術(shù)在能源植物育種中的應(yīng)用

譚芙蓉， 代立春， 吳 波， 秦 晗， 祝其麗， 王文國， 湯曉玉， 潘 科，蘇海鋒， 胡啟春，2， 何明雄，2*

1.農(nóng)業(yè)部沼氣科學研究所，生物質(zhì)能技術(shù)研究中心，成都 610041;

2.農(nóng)業(yè)部農(nóng)村可再生能源開發(fā)與利用重點實驗室，成都 610041

隨著能源危機和石化燃料引起的環(huán)境污染的加劇，世界各國都在積極探求可以替代化石燃料的能源，生物質(zhì)能源具有可再生性、低污染性、廣泛分布性及資源豐富性，逐漸成為能源替代研究的熱點，發(fā)展前景良好，未來有可能成為可再生能源的主導(dǎo)［1］。生物質(zhì)能是蘊藏在生物質(zhì)內(nèi)的能量，直接或間接來源于綠色植物經(jīng)光合作用轉(zhuǎn)化的化學能，對生物質(zhì)能的轉(zhuǎn)化利用形式包括生物乙醇、生物制氫、生物柴油、生物質(zhì)氣化及液化燃料等。

能源植物是可直接開發(fā)的最有前景的生物質(zhì)資源之一。我國幅員遼闊，水熱資源分布多差異，能源植物資源種類豐富多樣，但是我國對能源植物的開發(fā)和應(yīng)用起步較晚，與西方發(fā)達國家相比還有相當大的差距。如果我國能加強生物能源的研究與開發(fā)，篩選出更多優(yōu)質(zhì)、高效的能源植物，并將其轉(zhuǎn)化為氣體或液體燃料，一方面可以彌補石化燃料的不足，緩解過分依賴大量進口石油的被動局面，實現(xiàn)我國能源安全戰(zhàn)略;另一方面還能發(fā)揮其保持水土和改良土壤的作用，達到保護和建設(shè)生態(tài)環(huán)境的目的。進一步建立中國能源植物種質(zhì)資源開發(fā)基地和生物燃油生產(chǎn)技術(shù)體系，對于培育和利用中國能源植物資源以及儲備后備能源都具有十分重要的意義。本文從能源植物的概念及分類入手，概述了轉(zhuǎn)基因技術(shù)在能源植物遺傳改良中取得的進展及應(yīng)用現(xiàn)狀，為進一步利用該技術(shù)改良能源植物提供參考。

1 能源植物的概念及分類

能源植物是可再生能源開發(fā)的唯一資源對象，它通過光合作用固定二氧化碳和水，將太陽能以化學能形式儲藏在植物中。廣義的能源植物包括所有的陸地和海洋植物;狹義的能源植物指植物本身(不包括籽粒)含有油脂或石油類似物質(zhì)的植物。能源植物可以直接燃燒產(chǎn)生熱能，還可以轉(zhuǎn)化成固態(tài)、液態(tài)和氣態(tài)燃料。根據(jù)植物的光合途徑分類，能源植物主要是C3和C4植物［2］，目前還沒有屬于景天酸循環(huán)(crassulacean acid metabolism，CAM)類型的能源植物的報道。根據(jù)植物的生活周期，能源植物分為一年生(如甘薯、高粱、大豆和續(xù)隨子等)、兩年生(如甜菜，這類植物種類較少)和多年生植物三大類［2］，其中多年生能源植物又分為草本(如柳枝稷、芒草和虉草等)和木本(楊樹、柳樹和麻瘋樹等)植物兩類。根據(jù)化學成分組成及其利用分類，能源植物可以分為［2］:①糖料植物:該類植物富含可溶性糖，主要用于生產(chǎn)燃料乙醇，有甘蔗、甜高粱和甜菜等;②淀粉植物:該類植物富含淀粉，也主要用于生產(chǎn)燃料乙醇，主要包括小麥、玉米等禾谷類作物及甘薯、木薯和馬鈴薯等薯類作物;③油料植物:指富含油脂的高等植物，提取油脂后通過脂化過程形成脂肪酸甲酯或脂肪酸乙酯類物質(zhì)，即生物柴油，如油菜、蓖麻和大豆等產(chǎn)油作物以及麻瘋樹、油棕櫚、黃連木和文冠果等木本植物;④含油微藻植物:富含烴類或脂類物質(zhì)的微藻也可用以生產(chǎn)生物柴油，由于含油微藻高效的生產(chǎn)能力，可在廢棄地及其他沒有農(nóng)業(yè)利用價值的土地上，利用廢水甚至高含鹽量的水大規(guī)模培養(yǎng)，因而有很好的應(yīng)用前景［3］;⑤木質(zhì)纖維素植物:該類植物富含木質(zhì)纖維素，轉(zhuǎn)化應(yīng)用范圍很廣泛，用于生產(chǎn)固體顆粒燃料，或獲得熱能、電能、沼氣及燃料乙醇等，如楊樹、桉樹、象草、柳枝稷和喜百草等。

2 轉(zhuǎn)基因技術(shù)在能源植物育種中的應(yīng)用

自然狀態(tài)下的能源植物并不是最理想的生產(chǎn)物種，通過引進良種與當?shù)刂参镫s交后篩選培育高效、高產(chǎn)的能源植物已經(jīng)取得一定的進展，然而傳統(tǒng)的育種手段已不能滿足現(xiàn)今社會對能源植物的需求。近年來，隨著基因克隆和轉(zhuǎn)基因技術(shù)的不斷完善，轉(zhuǎn)基因技術(shù)在玉米、大豆和棉花等主要農(nóng)作物上都得到了較好的應(yīng)用。但由于轉(zhuǎn)基因食品相關(guān)的商業(yè)應(yīng)用仍受到嚴格限制，轉(zhuǎn)基因技術(shù)在以食用為目的的作物上的研究和應(yīng)用也面臨阻礙，由此為能源植物的遺傳改良提供了新的機遇。轉(zhuǎn)基因技術(shù)雖然較常規(guī)育種技術(shù)復(fù)雜，但具有常規(guī)育種不可比擬的優(yōu)點，它可以根據(jù)育種目標，打破生殖隔離，將供體生物中的目的基因整合到受體植物中，在基因水平上定向改造植物的遺傳性狀，從而形成轉(zhuǎn)基因新品種或新種質(zhì)，大大提高了育種的目的性和可操作性。因此，轉(zhuǎn)基因技術(shù)可以作為培育高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、高效新型能源植物新品種的有效途徑。

2.1 提高能源植物的生物量

人類期望的能源植物是擁有較高的太陽能轉(zhuǎn)化利用率、較快的光合速度和較高的干物質(zhì)積累能力以及較快的生長速率。然而目前普通植物對太陽光的利用效率都比較低，不到4%。況且我國耕地有限，發(fā)展能源植物必須要保證糧食安全，要立足于“不與人爭糧、不與糧爭地”，盡可能選擇邊際土地來發(fā)展能源植物資源產(chǎn)業(yè)。與正常的耕地相比，在邊際土地上種植相同的作物，產(chǎn)量具有很大的變動范圍。因此，在邊際土地上發(fā)展能源植物，更需要選擇高光效、高生物量的能源植物。有研究表明，倘若能通過改良將植物的光能利用效率提高1%，世界上1/10的農(nóng)田面積就足以提供目前人類使用的所有化石能源［4］。通過增加植物對光能的利用效率或捕獲效率可以提高植物的總生物量。植物通過光合作用吸收二氧化碳受多種因素影響，包括光合作用機制、碳流量、光呼吸和光抑制作用及同化物分配和利用等。利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)來提高植物的生物量已有大量報道(見表 1)，主要包括調(diào)控植物光合作用［5，6］、調(diào)控卡爾文循環(huán)中的碳流量［7，8］、操縱植物營養(yǎng)代謝過程中的基因［9～11］以及延遲或阻礙植物開花［12］等。

大部分植物在光合作用中同化二氧化碳的最初產(chǎn)物是三碳化合物3-磷酸甘油酸，被稱為C3植物;而另一部分植物二氧化碳同化的最初產(chǎn)物是四碳化合物蘋果酸或天門冬氨酸，被稱作C4植物。目前多種C4植物光合作用途徑中的一些關(guān)鍵酶，如丙酮酸磷酸雙激酶(PPDK)、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)、及磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEPCK)以及無機碳轉(zhuǎn)運蛋白和脫氧羧腐胺賴氨酸合酶(DHS)等的基因已被成功轉(zhuǎn)入馬鈴薯、水稻、楊樹和擬南芥等C3植物中，使相應(yīng)轉(zhuǎn)基因植物的光合能力及產(chǎn)量均不同程度地得到提高(見表1)。以上這些研究表明，利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)來操縱植物中許多基因的表達對植物產(chǎn)量有比較明顯的影響，雖然這些研究成果未見有實際應(yīng)用的例子，但是同樣的策略可以應(yīng)用到能源植物中，為培育新型高產(chǎn)能源植物提供了參考依據(jù)。

表1 利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)提高植物生物量的報道 Table 1 The reports of using transgenic technology to improve plant biomass.

2.2 應(yīng)用于纖維素類能源植物的研究

利用木質(zhì)纖維素類能源植物生產(chǎn)燃料乙醇在國內(nèi)外已有大量研究，但所開發(fā)的技術(shù)始終未能在規(guī)模生產(chǎn)中推廣應(yīng)用，最根本的原因是目前的技術(shù)中仍然存在著一些尚未解決的關(guān)鍵問題，嚴重制約著植物纖維素燃料乙醇的生產(chǎn)［19～21］。首先是前期將木質(zhì)纖維素物質(zhì)降解為中間物質(zhì)以及去除木質(zhì)素的預(yù)處理過程成本過高;其次是纖維素水解復(fù)合酶的價格昂貴導(dǎo)致整個生產(chǎn)過程成本偏高［22］。與玉米淀粉生產(chǎn)乙醇相比，以上兩個過程的花費使得纖維素乙醇的生產(chǎn)成本高2～3倍。隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展，通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)來解決植物纖維燃料乙醇生產(chǎn)過程中遇到的瓶頸問題已有大量報道。

2.2.1 降低植物的木質(zhì)素含量 降低木質(zhì)纖維中的木質(zhì)素含量、提高纖維素含量將有利于降低木質(zhì)纖維的前處理成本。通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)改變木質(zhì)素合成途徑中不同基因的表達來降低木質(zhì)素的含量、提高纖維素含量已有大量報道(見表2)。通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)對木質(zhì)素生物合成調(diào)控的研究主要表現(xiàn)在兩個方面［31］:①木質(zhì)素合成總量的調(diào)節(jié)。主要涉及的酶類依次有苯丙氨酸解氨酶(PAL)、肉桂酸4-羥基化酶(C4H)、4-香豆酸輔酶A連接酶(4CL)、肉桂醇脫氫酶(CAD)和香豆酰輔酶A還原酶(CCR)，這些酶活性的高低與木質(zhì)素的總量具有密切的相關(guān)性;②木質(zhì)素單體特異合成成分的調(diào)控。相關(guān)的酶類主要有咖啡酸-O-甲基轉(zhuǎn)移酶(COMT)、咖啡酰輔酶A-O-甲基轉(zhuǎn)移酶(CCoAOMT)和阿魏酸5羥基化酶(F5H)，這些酶的表達對木質(zhì)素單體的特異合成有較大的影響，決定了各種單體在木質(zhì)素總量中的比例。

雖然通過調(diào)控木質(zhì)素合成途徑中關(guān)鍵酶的表達可以降低或是改變木質(zhì)素的含量與成分，但是還要保證調(diào)控這些基因的表達不影響轉(zhuǎn)基因植物的生長發(fā)育。此外，一些特定植物為了適應(yīng)內(nèi)外環(huán)境的需要，其細胞壁的木質(zhì)素形成受到精細的時空調(diào)節(jié)［32～34］。因此，利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)減少木質(zhì)素含量、改變其結(jié)構(gòu)與成分的同時還需要對木質(zhì)素合成途徑的遺傳調(diào)控開展更多基礎(chǔ)性的研究，以避免對植物造成長期的傷害。

表2 利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)調(diào)控木質(zhì)素合成途徑中的相關(guān)酶的表達 Table 2 The expression of enzymes in lignin synthesis regulation pathway using transgenic technology.

2.2.2 在植物中過表達纖維素降解酶類 將纖維素降解為葡萄糖的過程需要內(nèi)切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶三種酶共同作用。生產(chǎn)纖維素酶的方法一般采用微生物發(fā)酵法，但是由于這種方法工藝復(fù)雜，提純過程費時費力，導(dǎo)致生產(chǎn)成本昂貴。如果能夠利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)將纖維素酶直接在植物中表達，利用植物作為生物反應(yīng)器產(chǎn)生降解纖維素的酶類，在木質(zhì)纖維素降解過程中就不需要或可減少加入來源于微生物的酶，這樣就可以大大降低燃料乙醇的生產(chǎn)成本［21，35，36］。目前，嗜酸纖維素分解菌(Acidothermus cellulolyticus)的 1，4-β-內(nèi)切葡聚糖酶的催化區(qū)域E1已分別在煙草、玉米、擬南芥、馬鈴薯、水稻和玉米中成功表達(見表3)［37～44］。另外，來自嗜熱單孢菌(Thermpbifida fusca)的耐熱纖維素酶Cel6A和Cel6B基因以及來自海棲熱袍菌(Thermotoga maritima)的β-葡聚糖酶基因等也在煙草等植物中成功表達(見表3)［45～55］。這些研究表明在植物中生產(chǎn)纖維素酶是可行的，尤其在擬南芥中表達的酶含量可達植物可溶性蛋白含量的26%［39］。值得一提的是，目前在植物中表達纖維素酶大多集中在非生物質(zhì)原料作物中，而在生長快速的木質(zhì)纖維素原料作物(如芒草、柳枝稷、桉樹和楊樹等)中的研究相對較少。

表3 在植物中表達耐熱或極端嗜熱酶的研究 Table 3 Studies of heat-resistant enzymes or extreme thermophilic enzymes expressed in plants.

2.3 應(yīng)用于富含油脂能源植物的研究

生物柴油是清潔的可再生能源，是優(yōu)質(zhì)石化柴油代用品。目前生物柴油面臨的主要問題是原料的油脂含量低、原料少而成本高，因此生物柴油能否實用化的關(guān)鍵是要采用廉價的原料來提高轉(zhuǎn)化從而降低成本。運用基因工程技術(shù)來調(diào)控脂類合成途徑中相關(guān)酶基因的表達，從而提高植物脂肪酸的含量或改變脂肪酸組分，是解決上述問題的有效手段。

2.3.1 提高油料植物的含油量 脂肪酸生物合成途徑的重要步驟是乙酰-CoA羧化酶(acetyl-CoA carboxylase，ACCase)催化乙酰輔酶A生成丙酰-CoA，植物脂肪酸的含量與ACCase的活性呈正相關(guān)。因此，可以利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)超量表達ACCase來提高含油植物的脂肪酸含量。來源于不同植物的ACCase基因已在油菜、玉米和麻瘋樹等植物中獲得了過表達，并且相應(yīng)地提高了種子的含油量［56～58］。Dong 等［57］將粟的 ACCase 基因轉(zhuǎn)入玉米，增加了玉米對稀禾啶的抗性，轉(zhuǎn)基因玉米的種子含油量比非轉(zhuǎn)基因玉米增加24%～65%。Roesler等［58］將擬南芥的一個ACCase同源基因轉(zhuǎn)入甘藍型油菜中，在種子特異性啟動子的作用下獲得了表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，獲得的轉(zhuǎn)基因植株T1代種子中ACCase的活性增加了1.7～1.9倍，質(zhì)體中丙酰-CoA的含量也得到提高，相應(yīng)地種子產(chǎn)油量提高了3% ～5%。Dunahay等［59］將 ACCase基因在硅藻中過量表達，硅藻的ACCase活性增加了約2～3倍。此外，也有許多研究ACCase不同亞基在脂肪酸合成中作用的報道［60，61］，如 Alisa等［60］克隆和表達了油棕生物素羧化酶基因(accC)和β-羧基轉(zhuǎn)移酶基因(accD)，結(jié)果表明accD的表達對于維持異質(zhì)型ACCase的水平和植物種子的含油量起最主要的作用。雖然ACCase的含量對脂肪酸的合成起著重要的作用，但是有人推測ACCase的含量對油脂積累的影響因物種而異，ACCase含量對油脂含量低的物種影響大于油脂含量高的物種［62］。由于脂肪酸的合成涉及多個酶的作用，要想通過上調(diào)其中一種酶而使油料植物的含油量大幅度提高是不可能的，研究者們開始關(guān)注脂肪酸合成途徑的轉(zhuǎn)錄因子、蛋白激酶和其他調(diào)控因子［63，64］。

2.3.2 改良植物中的脂肪酸成分 植物在脂肪酸代謝上存在著多樣性和可塑性，不同的植物在油脂脂肪酸的構(gòu)成上有很大區(qū)別。有些植物油的工業(yè)價值被脂肪酸的成分所限制，應(yīng)用轉(zhuǎn)基因技術(shù)對油料植物種子中的脂肪酸成分進行改良是一種有效的手段，主要包括通過RNA干擾調(diào)控脂肪酸脫氫酶基因活性，調(diào)整脂肪酸分子在三酰甘油脂上的分布，修飾脂肪酸鏈的長度和不飽和度以及調(diào)整特定脂肪酸成分等。將擬南芥的二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶(DGAT)基因在煙草中表達，轉(zhuǎn)基因煙草的葉片中三酰甘油的積累增加了20倍，總脂肪酸和磷脂的含量都有所提高;在煙草中表達擬南芥中調(diào)控種子成熟和種子油存儲的主調(diào)節(jié)因子也能提高總脂肪酸含量［65］。Liu 等［66］將脂酰-ACP-Δ9去飽和酶基因ghSAD-1和 ω6去飽和酶基因ghFAD2-1分別轉(zhuǎn)進棉花，提高了棉花的硬脂酸和油酸的含量。Kinney等［67］抑制大豆中的脂酰去飽和酶，導(dǎo)致大豆油中脂肪酸的組成比例發(fā)生改變。Kaczmarzyk等［68］將微藻中編碼脂酰輔酶 A合成酶(long-chain acyl-CoA synthetase，LACS)基因敲除后，提高了微藻中脂肪酸濃度;同樣，敲除擬南芥中編碼LACS的兩種同工酶基因，切斷了種子中脂肪酸進入β-氧化的途徑，從而增加了種子的油脂含量［69］。

3 展望

我國作為一個資源大國，植物資源非常豐富，為能源植物資源的開發(fā)提供了優(yōu)越的條件。然而要對這些能源植物資源進行有效的開發(fā)與利用，所面臨的最主要的問題是利用能源植物生產(chǎn)再生能源的成本過高。利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)，已在提高植物總的生物量、改變植物木質(zhì)纖維素的成分、在植物中生產(chǎn)纖維素酶以及改變油料植物的油脂成分等方面進行了許多有益的嘗試，這些研究成果對于降低能源植物向生物燃料(生物乙醇、生物柴油)的轉(zhuǎn)化成本、提高能源轉(zhuǎn)化效率有著非常重要的意義。隨著生物化學與分子生物學的進一步發(fā)展，人們對植物的結(jié)構(gòu)基因組和功能基因組的研究將更加深入，對能源植物的能量轉(zhuǎn)化、富集和分配相關(guān)的基因功能及其調(diào)控機理也將不斷明確，利用植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)在分子基礎(chǔ)上設(shè)計和優(yōu)化能源植物將成為今后改良能源植物、培育優(yōu)良能源植物新品種的重要研究方向。

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