生物基尼龍聚丁內(nèi)酰胺單體γ-氨基丁酸的純化工藝研究

趙鶴飛， 夏泉鳴， 邱勇雋， 王耀松， 蔣麗華， 趙黎明

華東理工大學，生物反應器工程國家重點實驗室;發(fā)酵工業(yè)分離提取技術(shù)研發(fā)中心，上海 200237

γ-氨基丁酸 (aminobutyric acid，GABA)是在自然界廣泛分布的非蛋白質(zhì)氨基酸，分子質(zhì)量103.1 Da，熔點 203℃［1］。作為一種活性氨基酸，主要存在于動物的腦、脊髓和肝臟等器官中，具有降血壓、改善腦部血液循環(huán)、安神、健腎和健肝等生理活性，作為一種新資源食品，其研究開發(fā)日益受到人們的重視［2～5］。

GABA的生產(chǎn)主要有化學合成法、植物富集法和微生物合成法［6］?；瘜W合成的GABA有原料殘留，因此安全性差，不能添加到食品中;植物中GABA含量低，富集提取成本較高;微生物合成GABA安全性高、生產(chǎn)成本低且對環(huán)境友好，因而更具開發(fā)價值。

在GABA的生產(chǎn)工藝研究方面，已有膜分離及離子交換分離技術(shù)用于提取純化GABA的報道。王文等［2］運用超濾和稀釋過濾相結(jié)合的方法，在去除大分子的同時，盡可能提高GABA的回收率。用截留分子量為50 000 Da的PES膜組件進行試驗，研究了各操作參數(shù)的影響，得到溫度低于 40℃、壓差 0.2 MPa、循環(huán)流速 0.5 m/s和pH 5的優(yōu)化參數(shù)。因為超濾后GABA的回收率較低，所以采用了稀釋過濾以提高回收率。在兩次間歇式稀釋過濾后，GABA的回收率由原來的50%提高到將近95%，達到較好的分離效果。黃懷生等［7］研究了采用732陽離子交換樹脂分離純化Gabaron茶中GABA的工藝，最佳條件為:上樣液pH 3左右，吸附流速控制在3 mL/min左右，洗脫液pH在8～9。

GABA能夠以谷氨酸為底物，經(jīng)微生物谷氨酸脫羧酶催化脫羧生成［8］，目前，從以谷氨酸為底物的發(fā)酵液中提取γ-氨基丁酸的膜分離及離子交換分離工藝，國內(nèi)外文獻未見報道。本文研究了膜過濾聯(lián)合離子交換吸附和洗脫的工藝，并且使用活性炭進行脫色，為從谷氨酸發(fā)酵液提取GABA技術(shù)的大規(guī)模工業(yè)化應用提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

實驗室自制GABA發(fā)酵液:GABA含量16.8 g/L、谷氨酸含量 6.8 g/L、pH 4.83、折光固含量5%、電導率17 320 us/cm;分析純試劑購自中國國藥集團。

1.2 主要儀器和耗材

活性炭A和活性炭B由江蘇竹溪活性炭有限公司提供;離子交換柱，裝填500 mL強酸型陽離子交換樹脂，BT-100D數(shù)顯蠕動泵，均購自上海滬西分析儀器廠有限公司;Delta320 pH計、PL2002電子天枰，購自Mettler-Toledo公司;UNICO2000分光光度計和配套比色皿，購自尤尼柯(上海)制造有限公司;WZS-I阿貝折光儀，購自上海光學儀器廠;分析濾紙購自中國國藥集團;QY-021-a專有強酸型陽離子交換樹脂，由上海齊豫生物科技有限公司提供。

1.3 工藝流程

從以谷氨酸為底物的發(fā)酵液中分離提取γ-氨基丁酸的工藝流程如圖1所示。

圖1 從以谷氨酸為底物的發(fā)酵液中提取GABA工藝流程圖 Fig.1 Flow chart of extracting GABA from fermentation broth with glutamic acid as substrate.

1.3.1 膜過濾 采用有機管式微濾膜，有效膜孔徑200 nm，膜面積 0.5 m2，初始料液體積為366 L，濃縮10倍后分兩次加30 L滲濾［9］純水，濃縮至液體體積為11 L時停止，此時，濃縮倍數(shù)為33.3倍(滲濾純水體積不計算在內(nèi))。初始跨膜壓差設(shè)定在0.85 bar，當膜通量衰減時，提高到0.9 bar。溫度通過常溫冷卻水控制在38℃。膜通量及收率采用如下公式計算［10，11］:

式中，J為膜通量(L/m2·h);Q為T時間內(nèi)收集膜過濾液總量(L);A為膜有效面積(m2);T為膜過濾時間(h)。

1.3.2 離子交換吸附 在離子交換柱中填充500 mL的Na+型QY-021-a強酸型陽離子交換樹脂，經(jīng)1 mol/L鹽酸轉(zhuǎn)型為H+型后去離子水沖洗待用。然后將料液以2 BV/h的流速流經(jīng)層析柱，用恒流泵調(diào)解控制流速，每半小時收集一次樣品，滴定法檢測H+濃度。每隔一段時間取即時樣品檢測GABA含量。吸附的終點為料液經(jīng)樹脂流出液中H+含量降低并達到穩(wěn)定時，此時樹脂吸附GABA達到飽和，停止進料。繪制床層體積倍數(shù)－流出液H+濃度圖，即吸附曲線。由于測定pH比測定GABA含量更加快速，因此在離子交換吸附過程中同時檢測樣品的pH，考察pH是否可以用于生產(chǎn)實際的指導參數(shù)。

1.3.3 洗脫過程 先用25℃去離子水洗滌達到吸附飽和的樹脂，去除色譜柱內(nèi)的料液，以2 BV/h流速洗滌0.5 h左右即可。用0.42 mol/L氨水以0.5 BV/h的流速洗脫，用恒流泵控制流速，每小時收集一次樣品。每隔一段時間取即時樣品檢測 GABA含量，滴定法檢測氨水濃度(OH－濃度)。洗脫的終點為料液經(jīng)樹脂流出液中所含OH－濃度升高并達到穩(wěn)定時。繪制床層體積倍數(shù)－流出液OH－離子濃度圖，即洗脫曲線。由于測定pH比測定GABA含量更加快速，因此在洗脫過程中同時檢測樣品的pH，考察pH是否可以作為指導參數(shù)用于實際生產(chǎn)。

1.4 測定方法

1.4.1 高效液相色譜法測定GABA ①樣品預處理。0.1 mol/L的鹽酸:取4.2 mL濃鹽酸用去離子水定容到500 mL;異硫氰酸苯酯溶液:取120 μL異硫氰酸苯酯用乙腈定容到10 mL;三乙胺溶液:取1.39 mL的三乙胺用乙腈定容到10 mL。流動相為乙酸鈉溶液:取8.2 g無水乙酸鈉用超純水定容到1 000 mL，再加入60 μL的乙酸。②樣品衍生化。取 100 μL樣品液，用0.1 mol/L的鹽酸定容到10 mL，在5 mL或者是7 mL的塑料離心管中分別加入500 μL稀釋后的樣品液，250 μL 的異硫氰酸苯酯溶液，250 μL 三乙胺溶液，震蕩混勻，放入柱溫箱中恒溫1 h。1 h后再加入1 mL正己烷，震蕩混勻，放入柱溫箱中10 min。10 min后，取下清液，過濾膜，進樣。進樣體積為5 μL。③標樣衍生化。取約20 mg GABA標樣，用0.1 mol/L的鹽酸定容到10 mL。之后的步驟與樣品衍生化相同。④HPLC色譜條件:色譜柱采用島津 C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，3 um);柱溫 40℃;流速 1 mL/min;檢測波長254 nm。采用表1所示的梯度洗脫程序，其中A相為乙腈，B相為乙酸鈉溶液。該洗脫程序執(zhí)行完畢之后再用純乙腈沖洗0.5 h。谷氨酸出峰在5～8 min，GABA出峰在15～18 min。

1.4.2 色值測定和脫色率的計算［12］將待測GABA液調(diào)節(jié)至pH 7.0±0.1，分別測濾液的固形物含量和在420 nm處的吸光值色值，色值計算公式如下:

表1 色譜洗脫程序 Table 1 Chromatographic elution program.

式中，Ts為糖液的透光率;A為樣品的吸光度;b為色皿的厚度(cm);C為樣品濃度(g/mL)。

1.4.3 固形物含量測定［12］采用阿貝折光儀測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 有機管式膜過濾

發(fā)酵液中含有的菌體和蛋白會降低離子交換過程的樹脂的吸附容量、增加漂洗水用量和減少樹脂反復交換次數(shù)，甚至直接損害樹脂，因此工業(yè)上一般采用超濾、微濾或者離心機澄清過濾。本研究采用膜過濾方法澄清過濾，起到離子交換預處理的作用。

膜分離技術(shù)是在常溫下以膜兩側(cè)的壓力差為動力實現(xiàn)分離純化的一項分離技術(shù)。由于其分離時不發(fā)生相變化，適用于熱敏性物質(zhì)的分離，雜質(zhì)去除范圍非常廣泛。其利用壓力作為膜分離的推動力，因此分離裝置非常簡單，容易操作。管式超濾膜過濾酶解液，可以去除菌體和大分子雜質(zhì)，使濾過液澄清透明。如圖2所示，初始大跨膜壓差為0.85 bar，膜通量為234 L/m2·h，隨著過濾的進行，膜通量在約1.6 h衰減為155 L/m2·h，此時提高跨膜壓差到0.9 bar，膜通量在2～4 h小時內(nèi)穩(wěn)定在約 L/m2·h，而后衰減。平均膜通量為128 L/m2·h，濃縮倍數(shù)為33.3倍，滿足工業(yè)化運行的要求。經(jīng)取樣檢測膜透過液樣品，濃縮液樣品計算得出GABA收率為97.68%，微濾膜以及膜表面污染物上無GABA截留和吸附截留，透過液澄清透明，呈淡黃色，說明該膜可用于工業(yè)化生產(chǎn)應用。

圖2 膜通量隨時間的變化 Fig.2 Flux changes with time.

2.2 離子交換

2.2.1 吸附過程 如圖3所示，隨著流出液pH的升高，流出液H+濃度也提高，GABA的吸附也由4 BV以內(nèi)時的完全吸附變?yōu)橹饾u穿出到飽和，可用pH作為樹脂吸附過程的終點判斷參數(shù)，有利于實際工業(yè)化時的過程控制。開始時柱內(nèi)充滿水，流出液起始pH為5左右是由于水本身的pH為5～6。沖水910 mL，電導降為711 us/cm;沖水1 500 mL，電導降為259 us/cm。經(jīng)過計算得:樹脂的吸附量為112.9 g(GABA)/L(樹脂)，該數(shù)據(jù)對于工業(yè)放大計算樹脂用量有重要作用。以實際生產(chǎn)計劃處理酶解液4 m3/d，假設(shè)發(fā)酵液中GABA 濃度為14.1 g/L，總處理 GABA 量56.4 kg，單柱需要QY-021-a樹脂500 L(濕視體積)。實際生產(chǎn)中可進一步擴大設(shè)計余量，并且串聯(lián)使用2～3個柱子。

2.2.2 洗脫過程 如圖4所示洗脫過程產(chǎn)生一個洗脫峰，既GABA濃度先增大后減小，6 BV后GABA濃度顯著降低，因此可以收集5 BV之內(nèi)的料液，脫出氨水后獲得GABA濃縮液。OH－濃度與GABA濃度呈此消彼長的關(guān)系，說明在柱內(nèi)兩者發(fā)生了交換。

圖3 膜過濾液吸附過程 Fig.3 Adsorption process of permeate.

圖4 洗脫過程 Fig.4 Desorption process.

由圖3數(shù)據(jù)積分可得上樣量，折算為GABA純品81.9 g，吸附量為60.6 g，兩者之差為不完全吸附過程中流過交換柱的GABA量，可以經(jīng)過下一柱的串聯(lián)得到完全的吸附，單柱收率僅計算吸附量即可。因此，以GABA吸附量60.6 g，5 BV洗脫GABA量為55.68 g計算，吸附－洗脫過程的收率為92.8%。洗脫液經(jīng)過旋蒸去除氨水后，濃度為8%。如果收集更多的BV數(shù)，可以進一步增加收率。通過優(yōu)選樹脂和對樹脂柱結(jié)構(gòu)進行優(yōu)化也可以進一步增大離子交換步驟的收率。

2.3 離子交換樹脂再生

如圖5所示，采用濃度為6%的工業(yè)鹽酸，流過5 BV后，流出液鹽酸濃度與流入鹽酸濃度之比為1(既歸一化濃度為1)，說明樹脂完全再生，2.5 BV后的鹽酸可以作為套用酸收集再次使用，以節(jié)省鹽酸用量。

2.4 活性炭脫色

活性炭添加量為15%(碳對固形物含量之比)，脫色溫度為65℃，脫色時間40 min，攪拌。小試中加5%料液體積的沖洗水洗出濾餅內(nèi)殘存料液，確保收率。

圖5 樹脂再生曲線 Fig.5 Regeneration carve of ion-exchange resin.

如表2所示，碳B的脫色率為94.2%，GABA收率為99.2%，脫色率和收率均較碳 A高，且GABA損失很小，僅為0.8%，因此選擇碳B作為實際使用的脫色活性炭。

表2 不同活性炭的脫色率和收率 Table 2 Decolorization rate and yield of different activated carbon.

圖6 活性炭脫色前(B)后(A)對比 Fig.6 Comparison between before(B)and after(A)active carbon decolorization.

3 討論

采用有機管式膜過濾，平均膜通量為128 L/m2·h，濃縮倍數(shù)為33.3倍，滿足工業(yè)化運行要求。經(jīng)取樣檢測膜透過液樣品，濃縮液樣品計算GABA收率為97.7%，微濾膜以及膜表面污染物上無GABA截留和吸附截留，透過液澄清透明，呈淡黃色，說明該膜可用于工業(yè)化生產(chǎn)應用。

采用QY-021-a強酸型陽離子交換樹脂進行吸附－洗脫操作，經(jīng)5 BV洗脫后計算收率，吸附－洗脫過程的收率為92.8%。洗脫液經(jīng)過旋蒸去除氨水后，濃度為8%。如果收集更多的BV數(shù)，可以進一步增加收率。今后研究中，有待進一步通過優(yōu)選樹脂和對樹脂柱結(jié)構(gòu)進行優(yōu)化，進一步增大離子交換步驟的收率。

碳B的脫色率為 94.2%，GABA收率為99.2%，因此選擇碳B作為實際使用的脫色活性炭。

本研究所采用膜過濾和離子交換聯(lián)合的工藝總收率達到85%，該工藝具有很好的工業(yè)化應用價值和前景。

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