中華絨螯蟹幼蟹對(duì)亮氨酸和異亮氨酸的需要量

楊 霞 葉金云 周志金 張易祥 吳成龍 明建華

(1. 湖州師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院, 浙江省水生生物資源養(yǎng)護(hù)與開(kāi)發(fā)技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 湖州 313000;2. 湖州市水產(chǎn)技術(shù)推廣站, 湖州 313000)

亮氨酸(Leu)和異亮氨酸(Ile)是水產(chǎn)動(dòng)物體內(nèi)不能合成而必須從飼糧中獲取的氨基酸, 即必需氨基酸(EAA), 都屬于脂肪族氨基酸, 同時(shí)也都是支鏈氨基酸(BCAA)。它們特殊的結(jié)構(gòu)和功能在生命代謝中占有特別重要的地位。亮氨酸是BCAA中唯一的生酮氨基酸, 刺激胰島細(xì)胞釋放胰島素[1,2], 和纈氨酸、異亮氨酸一起可以起到保護(hù)肌肉的作用。亮氨酸的主要氧化部位在肌肉, 是合成機(jī)體蛋白質(zhì)的原料, 可以抑制蛋白降解和促進(jìn)肌肉蛋白合成[3—5];對(duì)血紅蛋白合成和維持血糖水平以及激素的增加有重要作用; 亮氨酸的缺乏可能引起嚴(yán)重的缺乏癥狀如生長(zhǎng)的阻滯[6,7]。而異亮氨酸是合成動(dòng)物體激素和酶類(lèi)的原料, 具有促進(jìn)蛋白質(zhì)合成和抑制其分解的作用。目前, 國(guó)內(nèi)外學(xué)者已經(jīng)開(kāi)展了一些水產(chǎn)動(dòng)物對(duì) Leu和 Ile營(yíng)養(yǎng)需求的研究, 確定了虱目魚(yú)(Chanos chanos Forsskal)[8]、斑節(jié)對(duì)蝦(Penaeus monodon)[9]、印度鯪(Cirrhinus mrigala)[10]、草魚(yú)(Cenopharyngodon idellus)[11]、建鯉(Cyprinus carpio var.Jian)[12]、凡納濱對(duì)蝦(Litopenaeus vannamei)[13]等多種魚(yú)蝦的亮氨酸和異亮氨酸需求量。

中華絨螯蟹(Eriocheir sinensis), 俗稱(chēng)河蟹、大閘蟹, 屬節(jié)肢動(dòng)物門(mén)甲殼綱, 是我國(guó)特有的淡水珍品。目前, 關(guān)于中華絨螯蟹對(duì)氨基酸需求的研究?jī)H限于賴(lài)氨酸、蛋氨酸和精氨酸[14,15]。本試驗(yàn)以中華絨螯蟹幼蟹為研究對(duì)象, 以幼蟹的生長(zhǎng)性能及肌肉必需氨基酸含量等為評(píng)價(jià)指標(biāo), 研究飼料中不同水平的Leu或 Ile對(duì)中華絨螯蟹生長(zhǎng)的影響, 旨在獲得中華絨螯蟹幼蟹對(duì)Leu和Ile的需要量, 以期完善中華絨螯蟹對(duì)十種必需氨基酸需要量的數(shù)據(jù)庫(kù), 為研制中華絨螯蟹營(yíng)養(yǎng)平衡的人工配合飼料提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)用蟹

試驗(yàn)蟹苗購(gòu)自上海市崇明島長(zhǎng)江口中華絨螯蟹養(yǎng)殖基地, 采用經(jīng)過(guò)沉淀、過(guò)濾后的天然池塘水進(jìn)行養(yǎng)殖。水泥池中暫養(yǎng)一周, 挑取體重均一、附肢完整的幼蟹作為試驗(yàn)對(duì)象。采用底面為長(zhǎng)方形(60 cm×85 cm, 水容量 300 L)的白色塑料水箱, 箱內(nèi)水深約30 cm, 每箱40只幼蟹, 初始體重為(0.90±0.02) g, 水箱內(nèi)放置足夠數(shù)量的網(wǎng)片及圓形PVC管作為隱蔽物。

1.2 試驗(yàn)飼料

采用單因子試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法, 為了使基礎(chǔ)飼料中目標(biāo)氨基酸(Leu或 Ile)含量盡可能低, 因此分別采用不同的飼料配方, 以酪蛋白、明膠、魚(yú)粉為蛋白源, 糊精、玉米淀粉為糖源, 魚(yú)油、豆油、卵磷脂為脂肪源制成基礎(chǔ)飼料?；A(chǔ)飼料配方和營(yíng)養(yǎng)組成見(jiàn)表 1, 氨基酸組成模式參照王樹(shù)英和陳輝[16]測(cè)定的河蟹肌肉氨基酸含量(表2)。每個(gè)試驗(yàn)分別設(shè)6個(gè)氨基酸濃度梯度, 每個(gè)濃度3重復(fù)。飼料中Leu添加梯度為0、0.4%、0.8%、1.2%、1.6%、2.0%, 實(shí)測(cè)各組飼料Leu含量為0.87%、1.26%、1.64%、2.03%、2.39%和2.81%; 飼料中Ile添加梯度為0、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%和2.5 %, 實(shí)測(cè)各組飼料Ile含量為0.69%、1.21%、1.70%、2.19%、2.70%和3.21% (表3)。

在試驗(yàn)飼料制作時(shí), 先將原料粉碎, 使原料粉末能全部通過(guò)60目試驗(yàn)篩, 再按比例充分混勻后加適量水?dāng)嚢? 通過(guò)絞肉機(jī)擠成直徑 1.5 mm的長(zhǎng)條,風(fēng)干后, 破碎成粒徑為(1—2) mm 的破碎料, 置于4℃冰箱內(nèi)密封保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 基礎(chǔ)飼料配方及其營(yíng)養(yǎng)組成Tab. 1 Formulation and nutritional composition of the basal diets (%)

表2 飼料配方中氨基酸混合物組成Tab. 2 Composition of amino acid mixtures in formulation (%)

1.3 飼養(yǎng)管理

采用表觀飽食投喂法, 每天于上午八點(diǎn)和下午五點(diǎn)投喂兩次, 次日吸污并補(bǔ)充養(yǎng)殖用水。此外, 每周定期測(cè)定水質(zhì)情況, 水溫(28—32)℃、溶解氧>5 mg/L、氨氮<0.1mg /L、pH 6.8—7.2, 連續(xù)充氣增氧, 實(shí)驗(yàn)周期60d。

1.4 樣品采集與分析

試驗(yàn)期間, 河蟹因脫殼或相互殘殺死亡后及時(shí)撈出, 并精確稱(chēng)重, 其增重部分不計(jì)入試驗(yàn)結(jié)果。試驗(yàn)結(jié)束后, 停食24h, 撈出全部河蟹, 盡量瀝干水分,稱(chēng)重。一部分烘干后作全蟹樣品, 用于常規(guī)生化分析; 一部分提取肌肉樣品, 濾紙吸干水分后用于氨基酸含量的測(cè)定。測(cè)定指標(biāo)包括水分、粗蛋白質(zhì)、粗脂肪、灰分以及氨基酸含量, 分別采用105℃恒重法、凱式定氮法、索氏抽提法、550℃馬福爐灼燒法以及氨基酸自動(dòng)分析儀。

計(jì)算公式: 特定生長(zhǎng)率(SGR, %/d)＝(Ln結(jié)束時(shí)平均體重–Ln開(kāi)始時(shí)平均體重) /試驗(yàn)天數(shù)×100; 成活率(SR, %)=實(shí)驗(yàn)結(jié)束后試驗(yàn)蟹數(shù)目/實(shí)驗(yàn)開(kāi)始時(shí)試驗(yàn)蟹數(shù)目×100。

1.5 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)表示,采用 SPSS 20.0軟件包對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析(One-way ANOVA), 若有顯著差異, 再做Duncan’s多重比較, 檢驗(yàn)組間差異的顯著性(P<0.05)。

2 結(jié)果

2.1 不同氨基酸水平對(duì)中華絨螯蟹幼蟹生長(zhǎng)性能的影響

飼料亮氨酸水平對(duì)中華絨螯蟹幼蟹末均重和特定生長(zhǎng)率有顯著影響(P<0.05), 但對(duì)成活率影響不顯著(P>0.05) (表4)。河蟹的末均重和特定生長(zhǎng)率隨飼料中亮氨酸含量的升高呈先上升后下降的趨勢(shì)。當(dāng)飼料中亮氨酸含量為2.39% (Leu-5組)時(shí), 河蟹幼蟹的末均重和特定生長(zhǎng)率均達(dá)到最大值, 與 Leu-4和Leu-6組差異不顯著(P>0.05), 但顯著高于Leu-1、Leu-2和 Leu-3組(P<0.05)。

飼料中異亮氨酸水平對(duì)中華絨螯蟹幼蟹末均重和特定生長(zhǎng)率均有顯著影響(P<0.05), 對(duì)成活率影響不顯著(P>0.05) (表5)。幼蟹的末均重和特定生長(zhǎng)率隨飼料中異亮氨酸含量的升高呈先上升后下降的趨勢(shì)。當(dāng)飼料中異亮氨酸含量為2.19% (Ile-4組)時(shí),末均重和特定生長(zhǎng)率均達(dá)到最大值, 顯著高于Ile-1、Ile-2、Ile-3和 Ile-6 組(P<0.05)。

表3 試驗(yàn)飼料中的氨基酸組成(實(shí)測(cè)值)Tab. 3 Composition of amino acid in test diets (measured value) (%)

表4 飼料Leu水平對(duì)中華絨螯蟹幼蟹生長(zhǎng)性能的影響Tab. 4 Effect of dietary leucine levels on growth performance of juvenile E. sinensis

表5 飼料Ile水平對(duì)中華絨螯蟹幼蟹生長(zhǎng)性能的影響Tab. 5 Effect of dietary isoleucine levels on growth performance of juvenile E. sinensis

2.2 中華絨螯蟹幼蟹對(duì)亮氨酸和異亮氨酸的需要量

以氨基酸水平(x)為橫坐標(biāo), 特定生長(zhǎng)率(y)為縱坐標(biāo), 根據(jù)折線(xiàn)模型得出中華絨螯蟹幼蟹飼料中亮氨酸最適需要量為 2.36% (圖 1), 占蛋白含量的5.88%; 飼料中異亮氨酸最適需要量為2.25% (圖2),占蛋白含量的5.72%。

圖1 飼料亮氨酸水平對(duì)中華絨螯蟹幼蟹特定生長(zhǎng)率的影響Fig. 1 Effect of dietary Leu level on SGR of the crab

圖2 飼料異亮氨酸水平對(duì)中華絨螯蟹幼蟹特定生長(zhǎng)率的影響Fig. 2 Effect of dietary Ile level on SGR of the crab

2.3 亮氨酸水平對(duì)中華絨螯蟹幼蟹體組成的影響

由表 6可知, 飼料中亮氨酸水平對(duì)中華絨螯蟹全蟹水分、粗脂肪和灰分沒(méi)有顯著影響(P>0.05)。粗蛋白含量隨著飼料中亮氨酸水平的增加呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì), 當(dāng)飼料中亮氨酸含量為 2.39%(Leu-5組)時(shí), 河蟹粗蛋白含量達(dá)到最大值12.49%。

2.4 異亮氨酸水平對(duì)中華絨螯蟹幼蟹體組成的影響

由表7可知, 飼料中異亮氨酸水平對(duì)中華絨螯蟹全蟹水分、粗脂肪和灰分沒(méi)有顯著性差異(P>0.05)。粗蛋白含量隨著飼料中異亮氨酸水平的增加呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì), 當(dāng)飼料中異亮氨酸含量為2.19%(Ile-4組)時(shí), 河蟹粗蛋白含量達(dá)到最大值12.43%。

2.5 亮氨酸水平對(duì)中華絨螯蟹幼蟹肌肉氨基酸組成的影響

由表 8可知, 亮氨酸水平對(duì)河蟹肌肉谷氨酸、纈氨酸、半胱氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、絲氨酸、脯氨酸以及必需氨基酸總量(∑EAA)、非必需氨基酸總量(∑NEAA)、氨基酸總量(TAA)有顯著性影響(P<0.05), 對(duì)其他氨基酸影響不顯著(P>0.05)。當(dāng)飼料中亮氨酸含量大于2.39% (Leu-5和Leu-6組)時(shí),河蟹肌肉中的Leu含量、必需氨基酸總量和氨基酸總量均顯著高于其他各試驗(yàn)組(P<0.05)。

2.6 異亮氨酸水平對(duì)中華絨螯蟹幼蟹肌肉氨基酸組成的影響

由表9可知, 異亮氨酸水平對(duì)河蟹肌肉谷氨酸、纈氨酸、組氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、絲氨酸、脯氨酸以及∑EAA、∑NEAA、TAA有顯著影響(P<0.05),對(duì)其他氨基酸無(wú)顯著影響(P>0.05)。河蟹肌肉中的Ile含量、必需氨基酸總量和氨基酸總量隨飼料中異亮氨酸含量的增加呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì), 最大值均出現(xiàn)在 Ile-5組(2.70% Ile), 但 Ile-5組與 Ile-4組(2.19% Ile)差異不顯著(P>0.05)。

表6 飼料Leu水平對(duì)中華絨螯蟹幼蟹體組成的影響Tab. 6 Effect of dietary leucine levels on body composition of juvenile E. sinensis (%)

表7 飼料Ile水平對(duì)中華絨螯蟹幼蟹體組成的影響Tab. 7 Effect of dietary isoleucine levels on body composition of juvenile E. sinensis (%)

表8 飼料Leu水平對(duì)中華絨螯蟹肌肉氨基酸組成的影響Tab. 8 Effect of dietary leucine levels on AA composition in muscles of E. sinensis (%)

表9 飼料Ile水平對(duì)中華絨螯蟹肌肉氨基酸組成的影響Tab. 9 Effect of dietary isoleucine levels on amino acid composition in muscles of E. sinensis (%)

3 討論

亮氨酸是甲殼動(dòng)物的必需氨基酸之一, 與異亮氨酸和纈氨酸被稱(chēng)為 BCAA。Leu是合成機(jī)體蛋白質(zhì)的原料, 具有許多重要的生物學(xué)功能。在本試驗(yàn)中, 飼料 Leu含量不足時(shí), 河蟹表現(xiàn)出顯著的生長(zhǎng)抑制, 隨著飼料中 Leu水平逐漸增加, 河蟹幼蟹的生長(zhǎng)性能明顯得到改善。這說(shuō)明Leu可以為幼蟹的生長(zhǎng)提供營(yíng)養(yǎng), 中華絨螯蟹能夠利用晶體 Leu。以SGR為評(píng)價(jià)指標(biāo), 通過(guò)折線(xiàn)模型得到中華絨螯蟹對(duì)Leu的需要量為 2.36%的飼料干物質(zhì), 即占飼料蛋白的 5.88%。此需要量高于以往報(bào)道的甲殼動(dòng)物對(duì)Leu的營(yíng)養(yǎng)需求(占飼料蛋白百分比), 如斑節(jié)對(duì)蝦4.3%[9]、凡納濱對(duì)蝦 5.71%[13]、日本對(duì)蝦(Marsupenaeus japonicus) 3.4%[17]和南美白對(duì)蝦(Penaeus vannamei) 5.45%[18]。與其他水生動(dòng)物相比, 高于南亞野鯪(Labeo rohita) (3.75—3.92)%[6]、建鯉 3.7%[7]、大西洋鮭(Salmo salar) 5.2%[19]、大菱鲆(Psetta maxima)4.6%[20]、白鱘(Acipenser transmontanus) 4.3%[21]、印度鯪 3.9%[10]、鱸魚(yú)(Lateolabrax japonicus) 5.67%[22]等的亮氨酸需要量; 低于虹鱒(Oncorhynchus mykiss)9.2%[23]、團(tuán)頭魴(Megalobrama amblycephala) 6.98%[24]和大黃魚(yú)(Pseudosciaena crocea) 6.79%[25]的研究結(jié)果。這說(shuō)明不同種類(lèi)的動(dòng)物對(duì)亮氨酸需要量的差異較大, 可能與實(shí)驗(yàn)對(duì)象、個(gè)體大小、飼養(yǎng)管理、實(shí)驗(yàn)條件以及飼料組成和適口性等有關(guān)。另外, 本試驗(yàn)使用的是晶體氨基酸, 溶出問(wèn)題也可能會(huì)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生影響。這些影響因素有待進(jìn)一步研究完善。

適宜的Leu水平能夠提高中華絨螯蟹幼蟹生長(zhǎng),隨著飼料中Leu水平的升高, 河蟹幼蟹SGR和全蟹粗蛋白質(zhì)含量均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。當(dāng)飼料中Leu的含量為2.39% (Leu-5組)時(shí), SGR和機(jī)體粗蛋白含量達(dá)最大值, 但 Leu-5組與 Leu-6組的 SGR和機(jī)體粗蛋白質(zhì)含量差異不顯著, 說(shuō)明過(guò)多的 Leu并沒(méi)有明顯限制河蟹幼蟹生長(zhǎng), 這與之前的研究結(jié)果略有不同[7,13,22], 或者飼料中Leu水平還可以繼續(xù)增加, 說(shuō)明河蟹幼蟹對(duì)Leu的需要量較高。

異亮氨酸屬于脂肪族中性氨基酸, 也是生物體必需氨基酸之一, 與結(jié)構(gòu)類(lèi)似的亮氨酸、纈氨酸在營(yíng)養(yǎng)上有相關(guān)性, 因其特殊的結(jié)構(gòu)和功能, 在生命代謝中占有特別重要的地位。目前有關(guān)甲殼動(dòng)物對(duì)異亮氨酸需要量的研究較少, 只確定了斑節(jié)對(duì)蝦[9]和南美白對(duì)蝦[13]對(duì)Ile的需要量分別為 2.7%和4.33% (占飼料蛋白百分比)。本試驗(yàn)通過(guò)折線(xiàn)回歸模型得到中華絨螯蟹對(duì)Ile的需要量為2.25%的飼料干物質(zhì), 即占飼料蛋白的5.72%。由此可見(jiàn)不同種類(lèi)甲殼動(dòng)物對(duì)Ile的需要量存在較大差異。而且, 鑒于相關(guān)研究文獻(xiàn)極少, 實(shí)驗(yàn)結(jié)果有待進(jìn)一步證實(shí)。

另外, 3種支鏈氨基酸之間的拮抗作用也會(huì)影響某種支鏈氨基酸的需求量[26], 但這種拮抗作用在甲殼動(dòng)物中還未見(jiàn)闡明。在本試驗(yàn)中, 飼料氨基酸組成模式是參照中華絨螯蟹肌肉氨基酸模式設(shè)計(jì)而得,使其滿(mǎn)足除實(shí)驗(yàn)氨基酸外其他兩種氨基酸的需求,以期減小因支鏈氨基酸間的拮抗對(duì)實(shí)驗(yàn)氨基酸需求量結(jié)果的影響。通過(guò)檢測(cè)中華絨螯蟹肌肉氨基酸的組成, 發(fā)現(xiàn)飼料中亮氨酸或異亮氨酸的含量對(duì)肌肉中三種支鏈氨基酸的含量具有顯著影響, 而且與全蟹粗蛋白的變化趨勢(shì)極其相似, 均呈先增加后降低的趨勢(shì)。但是滿(mǎn)足需求后, 飼料中實(shí)驗(yàn)氨基酸水平對(duì)肌肉中三種支鏈氨基酸含量的影響也隨之減小。有報(bào)道也認(rèn)為, 當(dāng)飼料中其他支鏈氨基酸含量滿(mǎn)足其最低需求時(shí), 其拮抗作用對(duì)實(shí)驗(yàn)氨基酸需求量結(jié)果的影響較小[27]。此外, 亮氨酸對(duì)全蟹蛋白和肌肉TAA測(cè)定結(jié)果表明, Leu需求滿(mǎn)足后, 繼續(xù)升高飼料Leu水平對(duì)蛋白質(zhì)合成無(wú)影響。Garlick研究發(fā)現(xiàn), 高濃度的亮氨酸對(duì)除骨骼肌以外的機(jī)體組織蛋白質(zhì)的降解有抑制作用[28]。因此, 當(dāng)Leu水平升高時(shí)并未對(duì)蛋白質(zhì)的合成和降解產(chǎn)生顯著影響。而在異亮氨酸實(shí)驗(yàn)中, 飼料中Ile水平過(guò)高(Ile-6)時(shí), 全蟹蛋白和肌肉TAA顯著下降, 說(shuō)明過(guò)量的Ile可能導(dǎo)致蛋白質(zhì)合成代謝下降, 分解代謝增強(qiáng), 從而抑制蛋白質(zhì)沉積及幼蟹生長(zhǎng)。

綜上所述, 根據(jù)特定生長(zhǎng)率和飼料氨基酸水平進(jìn)行折線(xiàn)回歸模型, 得到中華絨螯蟹幼蟹對(duì)亮氨酸的最適需要量為飼料干物質(zhì)的 2.36% (占飼料蛋白5.88%), 異亮氨酸的最適需要量為飼料干物質(zhì)的2.25% (占飼料蛋白5.72%)。