運(yùn)輸時(shí)間和密度對(duì)翹嘴鲌皮質(zhì)醇、耗氧率及氧氣袋內(nèi)水質(zhì)的影響

胡培培 劉汝鵬 趙忠波 何 輝 樊啟學(xué) 宗克金

(華中農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院, 武漢 430070)

活魚(yú)運(yùn)輸主要有封閉式和開(kāi)放式運(yùn)輸兩大類型[1],能引起魚(yú)的應(yīng)激反應(yīng), 對(duì)魚(yú)體造成損傷, 死亡率高等[2,3],而運(yùn)輸時(shí)間、密度、水質(zhì)等是影響活魚(yú)運(yùn)輸成活率的主要因素, 尤其是水質(zhì)惡化和累積效應(yīng)[2,4]。氧氣袋充氧運(yùn)輸具有運(yùn)輸水的體積小, 成活率高等優(yōu)點(diǎn), 廣泛用于水產(chǎn)苗種運(yùn)輸, 而運(yùn)輸密度高會(huì)導(dǎo)致氧氣袋內(nèi)水質(zhì)迅速惡化,水體高游離CO2和氨氮濃度會(huì)導(dǎo)致苗種死亡[1,4,5], 還可產(chǎn)生過(guò)度擁擠效應(yīng)[4], 脅迫后消耗大量能量[6]。因此, 合理的運(yùn)輸制度包括合理的運(yùn)輸密度, 其可保持良好的水質(zhì)條件, 降低魚(yú)類應(yīng)激水平, 提高存活率[2,4]。 翹嘴鲌(Culter alburnus Basilewsky)隸屬鲌亞科, 鲌屬, 中上層較大型經(jīng)濟(jì)魚(yú)類, 具有較高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值, 但對(duì)捕撈、運(yùn)輸?shù)葢?yīng)激敏感。本實(shí)驗(yàn)旨在研究運(yùn)輸時(shí)間和密度對(duì)氧氣袋內(nèi)水體氨氮、游離CO2、溶氧和pH的影響, 并對(duì)翹嘴 鲌全魚(yú)皮質(zhì)醇水平以及脅迫后耗氧率的影響, 尋求苗種合理的運(yùn)輸制度, 為實(shí)際生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)魚(yú)與裝置

實(shí)驗(yàn)魚(yú)為人工繁殖的同一批魚(yú), 全長(zhǎng)(22.21±1.44) mm,實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前暫養(yǎng)于水泥池(內(nèi)裝水 15 m3)中, 放養(yǎng)密度為1.5 g/L, 微流水(換水量為10.5 L/min)養(yǎng)殖, 增氧機(jī)增氧,使DO>5.0 mg/L, 馴化2周, 每天定時(shí)飽食投喂魚(yú)苗微粒子飼料(山東升索漁用飼料研究中心; 粗蛋白≥41%, 粗脂肪≥8%)2次, 11:00—15:00遮陰。暫養(yǎng)期間, 每日監(jiān)測(cè)水質(zhì)情況: 水溫 25—31 ℃; pH 7.4—8.5; 亞硝態(tài)氮和H2S<0.05 mg/L; 氨氮<0.5 mg/L, 自然光照。正式實(shí)驗(yàn)前停食 2d。實(shí)驗(yàn)魚(yú)平均體重全長(zhǎng)分別為: (0.21±0.04) g、(35.07±1.65) mm (n=1800); 肥滿度為(0.93±0.06) g/cm3。采用雙層塑料尼龍袋(45 cm×20 cm)充氧密封法運(yùn)輸實(shí)驗(yàn)魚(yú), 路段設(shè)在華中農(nóng)業(yè)大學(xué)和武漢繁生漁業(yè)科技有限公司(武漢江夏區(qū)流芳鎮(zhèn))之間: 從漁場(chǎng)到流芳鎮(zhèn)為土路(6.5 km), 較顛簸, 從流芳鎮(zhèn)到華中農(nóng)業(yè)大學(xué)為柏油路和水泥路(35 km)(武漢三環(huán)), 較平坦。運(yùn)輸后實(shí)驗(yàn)魚(yú)耗氧率測(cè)定采用密封式流水法, 參考陳寧生和施 瑔芳[7], 代謝瓶容積為1500 mL。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

2013年7月8日(氣溫 28—35℃)7:10將實(shí)驗(yàn)魚(yú)從水泥池中捕獲(水溫28.1℃), 實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前先用冰塊將遮陰處池塘水調(diào)節(jié)為26℃, 用燒杯量取池塘水1.5 L, 之后倒入小盆中, 再將小盆放在電子天平(0.01 g)上并歸零, 然后用小網(wǎng)迅速撈魚(yú)并放入小盆中, 準(zhǔn)確稱重后倒入氧氣袋中, 最后充入純氧2.5 L(氧氣流量表調(diào)節(jié)流量, 30 L/min),立即打包, 以尼龍袋膨脹無(wú)凹癟為度。運(yùn)輸密度為 33、40、47和 54 g/L, 運(yùn)輸時(shí)間為 0、2、4、6、8、10h, 采用4×6雙因素實(shí)驗(yàn), 各組設(shè) 3個(gè)平行, 并設(shè) 10個(gè)空白組(不裝魚(yú)), 并將帶有細(xì)線的溫度計(jì)放入空白組, 監(jiān)測(cè)袋內(nèi)水溫, 共 82包, 放入泡沫盒(水溫 26℃)中立即用面包車運(yùn)輸, 運(yùn)輸時(shí)間為 07:40—17:40。實(shí)驗(yàn)期間, 監(jiān)測(cè)水溫、車內(nèi)氣溫(25℃)和車速, 土路為(20—25) km/h, 柏油路為(60—70) km/h, 學(xué)校水泥路為(30—40) km/h, 學(xué)校停留(3—5)min, 單程時(shí)間為1h, 往返重復(fù)10次。在運(yùn)輸0、2、4、6、8、10h后, 每個(gè)代謝瓶放置各組魚(yú)8尾, 代謝時(shí)間為2h, 流速為100 mL/min, 實(shí)驗(yàn)期間出水口溶氧在4 mg/L以上, 各代謝瓶又放置在盛水的大呼吸室中, 調(diào)節(jié)水溫為(27±0.5)℃, 遮光條件采用黑布覆蓋, 設(shè) 3個(gè)平行和 1個(gè)空白對(duì)照組; 實(shí)驗(yàn)開(kāi)始和結(jié)束時(shí)測(cè)定各代謝室進(jìn)出水口溶氧, 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后測(cè)定代謝室魚(yú)的全長(zhǎng)[游標(biāo)卡尺(0.001 mm)]和體重[電子天平(0.001 g)]。

1.3 樣品采集與分析及參數(shù)計(jì)算

在運(yùn)輸 0、2、4、6、8、10h時(shí), 立即用便攜式溶氧儀(美國(guó)YSI556)測(cè)定各組氧氣袋內(nèi)水體溫度、溶氧和pH;迅速用50 mL移液管取水樣, 測(cè)定游離CO2濃度(采用酸堿滴定法); 再用水樣瓶(500 mL)采集水樣, 測(cè)定氨氮濃度(采用預(yù)蒸餾—納氏試劑分光光度法); 取各組魚(yú) 8—10尾, 迅速放入液氮中, 測(cè)定全魚(yú)皮質(zhì)醇水平(采用美國(guó)魚(yú)類皮質(zhì)醇ELISA試劑盒法); 各項(xiàng)步驟的操作時(shí)間不超過(guò)30s, 并測(cè)定各組魚(yú)的全長(zhǎng)和體重(n=30); 運(yùn)輸 10h后,將各組取樣剩余的魚(yú)轉(zhuǎn)入玻璃水缸(340 L)中觀察 24h,記錄死亡數(shù)。

耗氧率(Oxygen consumption rate, RO)參考陳寧生和施 瑔芳[7]。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(x ±SD)表示, 采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行雙因素方差分析(two-way ANOVA analysis)(翹嘴 鲌?bào)w重、水溫作為協(xié)變量), Duncan 氏法比較差異顯著性; 顯著水平P<0.05。

2 結(jié)果

2.1 運(yùn)輸時(shí)間和密度對(duì)翹嘴鲌氧氣袋內(nèi)水質(zhì)變化的影響

在整個(gè)運(yùn)輸中氧氣袋內(nèi)水溫為(26.0—27.5)℃, 氧氣袋內(nèi)水質(zhì)變化情況如表 1。水體溶氧(Dissolved oxygen;DO)和 pH隨運(yùn)輸時(shí)間和密度的增加而顯著降低, 氨氮(Total ammonia nitrogen; TAN)和游離CO2濃度則隨它們的增加而顯著升高, 且交互作用顯著; 在運(yùn)輸 0—2h時(shí),各組DO和pH呈現(xiàn)大幅度的下降趨勢(shì), 單位時(shí)間平均下降了7.33 mg/L和0.34, TAN呈現(xiàn)大幅度的上升趨勢(shì), 單位時(shí)間平均上升了2.93 mg/L, 而游離CO2表現(xiàn)在(2—4)h,單位時(shí)間平均上升了 8.87 mg/L, 之后變化緩慢; 運(yùn)輸(8—10)h時(shí), 各組DO、pH、TAN和游離CO2濃度再次呈現(xiàn)較大幅度的變化趨勢(shì); D3、D4組DO分別于運(yùn)輸8、10h降到10 mg/L以下。在整個(gè)運(yùn)輸中, 水體DO、pH、TAN和游離CO2單位時(shí)間變化值隨密度的增加而增大。

表1 運(yùn)輸時(shí)間和密度對(duì)氧氣袋內(nèi)水體中溶氧、pH、氨氮和游離二氧化碳的影響Tab.1 Effect of transportation time and density on water dissolved oxygen, pH, ammonia nitrogen and carbon dioxide free in polyethylene bags

2.2 運(yùn)輸時(shí)間和密度對(duì)翹嘴鲌全魚(yú)皮質(zhì)醇和耗氧率的影響

在本實(shí)驗(yàn)條件下, 各組魚(yú)存活率為 100%, 翹嘴鲌全魚(yú)皮質(zhì)醇水平及脅迫后耗氧率(RO)隨密度的增加而顯著增大, 隨運(yùn)輸時(shí)間呈現(xiàn)先升高后降低再升高的趨勢(shì),且都顯著高于對(duì)照水平(運(yùn)輸 0h), 交互作用不顯著(圖1)。各組皮質(zhì)醇水平都于運(yùn)輸2h達(dá)到峰值, 之后開(kāi)始下降, 而D2—D4組皮質(zhì)醇水平又于運(yùn)輸8h后開(kāi)始上升。各組RO都于運(yùn)輸4h達(dá)到峰值。運(yùn)輸時(shí)間的主效應(yīng)更為突出。

圖1 運(yùn) 輸時(shí)間和密度對(duì)翹嘴 鲌全魚(yú)皮質(zhì)醇、耗氧率的影響Fig. 1 Effect of transportation time and density on whole-body cortisol and oxygen consumption rate of Culter alburnus

3 討論

3.1 運(yùn)輸時(shí)間和密度對(duì)全魚(yú)皮質(zhì)醇水平的影響

運(yùn)輸包括捕獲、轉(zhuǎn)載、禁錮等一系列連續(xù)的強(qiáng)刺激性操作協(xié)迫是常見(jiàn)的復(fù)合應(yīng)激因子, 皮質(zhì)醇等激素水平的升高, 進(jìn)而誘發(fā)魚(yú)體代謝速率加快、抗病性和耐低氧能力等減弱, 其成活率也顯著下降[2,4,8]。在運(yùn)輸2h內(nèi), 翹嘴鲌全魚(yú)皮質(zhì)醇水平顯著上升了 1.9—2.2倍, 之后開(kāi)始下降。在運(yùn)輸脅迫后, 革胡子鲇(Clarias gariepinus Valenciennes)血清皮質(zhì)醇水平顯著上升了4—5倍, 水體氨氮濃度也顯著高于對(duì)照水平[9]; 重復(fù)而長(zhǎng)時(shí)間的禁錮脅迫下,虹鱒(Salmo gairdneri Walbaum)血清皮質(zhì)醇水平一直上升,并于16.5h時(shí)達(dá)到220 ng/mL, 是對(duì)照水平的110倍[10]; 在急性應(yīng)激后, 銀鯰(Rhamdia quelen Quoy et Gaimard)和羅非魚(yú)(Oreochrmis niloticus Linnaeus)全魚(yú)皮質(zhì)醇水平都顯著升高, 但羅非魚(yú)應(yīng)激水平更為強(qiáng)烈和持久, 其解釋為羅非魚(yú)為日間活動(dòng)魚(yú)類[11]; 而 Barton等[12]發(fā)現(xiàn), 在空氣暴露或運(yùn)輸脅迫后, 鱘形目魚(yú)類血清皮質(zhì)醇水平差異不顯著。翹嘴 鲌全魚(yú)皮質(zhì)醇水平隨密度的增加而增加, 運(yùn)輸8h后, 水質(zhì)惡化和擁擠效應(yīng)表現(xiàn)突出。彭士明等[13]運(yùn)輸銀鯧(Pampus argenteus Euphrasen)12h, 血清皮質(zhì)醇水平隨運(yùn)輸密度的增加而增加, 并于運(yùn)輸 4h達(dá)到峰值(7—9) ng/mL, 16 g/L密度組加重了幼魚(yú)應(yīng)激反應(yīng), 死亡率也升高; 而對(duì)缺簾魚(yú)(Brycon cephalus Günther)的研究發(fā)現(xiàn),血清皮質(zhì)醇水平隨運(yùn)輸密度的增加而降低, 其解釋為高密度組幼魚(yú)“侵略行為”減弱[3]。因此, 魚(yú)體應(yīng)激水平與密度、魚(yú)的種類、脅迫方式等密切相關(guān)。

3.2 運(yùn)輸時(shí)間和密度對(duì)氧氣袋內(nèi)水質(zhì)變化的影響

水質(zhì)是影響活魚(yú)運(yùn)輸魚(yú)的健康、應(yīng)激水平和存活率的主要因素之一, 其中包括游離CO2、氨氮、DO和PH[2,4]。對(duì)黃尾(Seriola lalandi Valenciennes)[14]、大西洋鮭(Salmo salar Linnaeus)[15]和尖吻鱸(Lates calcarifer Block)[16]的研究表明, 運(yùn)輸脅迫后魚(yú)體皮質(zhì)醇水平顯著升高, 鰓血流速度、代謝速率等加快, 耗氧增加, 氨氮和CO2等代謝產(chǎn)物也隨之增加并迅速溶于水體, 降低水體pH。Colburn等[17]運(yùn)輸軍曹魚(yú)(Rachycentron canadum Linnaeus), 氧氣袋內(nèi)水體DO和pH隨運(yùn)輸密度的增加而顯著降低; Golombieski等[18]運(yùn)輸銀鯰苗種(水溫 25℃),各組氧氣袋內(nèi)水體氨氮和游離 CO2濃度隨運(yùn)輸時(shí)間和密度的增加顯著上升, 而DO隨運(yùn)輸時(shí)間的增加呈現(xiàn)波動(dòng)變化; 類似的, Urbinati等[3]運(yùn)輸缺簾魚(yú), 166 g/L密度組氧氣袋內(nèi)水體氨氮濃度低于125 g/L密度組, 其解釋為低密度組幼魚(yú)“侵略行為”增強(qiáng), 活動(dòng)增加。相對(duì)大規(guī)格魚(yú)類, 實(shí)驗(yàn)魚(yú)對(duì)運(yùn)輸脅迫極為敏感, 時(shí)間和密度交互作用顯著。

Moran等[14]運(yùn)輸黃尾幼魚(yú), 30min內(nèi), 水體游離CO2升到20 mg/L, pH從8.2降到7.2; 氧氣袋內(nèi)水質(zhì)的迅速變化通常發(fā)生在運(yùn)輸(1—2)h內(nèi), 且應(yīng)激持續(xù)時(shí)間與運(yùn)輸時(shí)間和密度成正相關(guān)[2,4,15]。在本實(shí)驗(yàn)條件下, 翹嘴鲌峰值應(yīng)激壓力發(fā)生在運(yùn)輸(0—2)h; 運(yùn)輸(8—10)h時(shí), 水體氨氮和游離CO2濃度高, 成為新的應(yīng)激源, 且協(xié)同作用表現(xiàn)突出, 稚魚(yú)代謝再次增強(qiáng)。尖吻鱸暴露在(12.6—21.6) mg/L氨氮濃度下, 血紅蛋白運(yùn)輸氧能力降低, 鰓呼吸速率加快[16]; 黃尾暴露在75 mg/L CO2濃度下, 幼魚(yú)出現(xiàn)嚴(yán)重的血碳酸過(guò)多癥[14]; 而對(duì)真鯛(Pagrus pagrus Linnaeus)的研究發(fā)現(xiàn), 水體氨氮濃度大于 7.94 mg/L時(shí),仔魚(yú)便出現(xiàn)死亡, 且死亡率與氨氮濃度成正相關(guān)[19]; 運(yùn)輸成年大西洋鮭, 水體 CO2對(duì)其亞致死濃度為19.60 mg/L[15]。在運(yùn)輸結(jié)束時(shí), D4組密度最大, 水質(zhì)條件最差, 實(shí)驗(yàn)魚(yú)出現(xiàn)側(cè)翻現(xiàn)象。運(yùn)輸時(shí)間為(10—15)h時(shí),鯉科魚(yú)類夏花苗種適宜運(yùn)輸密度為(250—375)尾/L(水溫25℃)[1]; 運(yùn)輸時(shí)間為6h、9h、12h時(shí), 大蓋巨脂鯉(Colossoma macropomum Cuvier)的密度上限依次為90、80、70尾/L,氧氣袋內(nèi)水體 CO2濃度低于 100 mg/L, 稚魚(yú)存活率為95%—100%[5]; 運(yùn)輸軍曹魚(yú)時(shí), 應(yīng)保持水體pH、DO分別在7.0、(6.0—8.0) mg/L以上, 其密度不易超過(guò)20 kg/m3[17]。因此, 水質(zhì)條件可決定運(yùn)輸密度, 在活魚(yú)運(yùn)輸中, 良好的水質(zhì)條件包括DO飽和度在90%—100%以上, CO2濃度在(30—50) mg/L 以下[2,4]。

3.3 運(yùn)輸時(shí)間和密度對(duì)翹嘴鲌耗氧率的影響

運(yùn)輸使魚(yú)類產(chǎn)生持續(xù)運(yùn)動(dòng), 其中包括能量代謝等生物學(xué)功能的改變, 以清除水質(zhì)變化等產(chǎn)生的不利影響,維持內(nèi)穩(wěn)態(tài)[3,4]鲌。運(yùn)輸脅迫后翹嘴 稚魚(yú)耗氧率依次為對(duì)照水平的 1.39、1.60、1.33、1.30、1.49倍, 并隨密度的增加而增大。在 2.5h低氧暴露后, 鯉魚(yú)(Cyprinus carpio Linnaeus)和黑鯽(Carassius carassius Linnaeus)[20]的耗氧率顯著上升, 代謝率增加到最大耗氧率的 60%, 恢復(fù)時(shí)間為7.0h和3.8h; 力竭運(yùn)動(dòng)后南方鲇(Silurus meridionalis Chen)耗氧率迅速升高了4—5倍, 之后開(kāi)始下降, 而間隔10min的重復(fù)運(yùn)動(dòng)使幼魚(yú)耗氧率一直保持在0.36 mg/(g·h)以上, 其為靜止水平的 2—4倍[6]。運(yùn)輸(0—4)h, 急性應(yīng)激反應(yīng)使稚魚(yú)消耗大量能量用于組織恢復(fù)與更新, 魚(yú)體最大代謝率出現(xiàn)在這一階段。急性升溫, 大西洋鮭幼魚(yú)耗氧率大且快的上升, 而慢性升溫, 其耗氧率上升緩慢, 且與升溫前差異不顯著[21]; 曾令清等[22]研究也表明, 急性變溫顯著影響南方鲇耗氧率。因此, 耗氧率與魚(yú)的種類和應(yīng)激水平密切相關(guān), 運(yùn)輸 8h后, 慢性脅迫表現(xiàn)突出, 更會(huì)使魚(yú)類能量耗竭, 恢復(fù)時(shí)間更長(zhǎng)。

運(yùn)輸結(jié)束的2周內(nèi),南亞野鯪(Labeo rohita Hamilton)苗種死亡率從2.13%上升到45.83%, 可稱其為“運(yùn)輸損失”[23],運(yùn)輸脅迫長(zhǎng)期影響魚(yú)的生長(zhǎng)與健康[2,4]。在本實(shí)驗(yàn)條件下, 運(yùn)輸時(shí)間為 10h時(shí),翹嘴鲌苗種合理的運(yùn)輸密度為(47—54) g/L。