白及多糖體外抗腫瘤實驗研究

羅仕華，鄭傳勝*，黎維勇，衛(wèi)樂樂，王 勇，夏向文，周國鋒，馮敢生

(1.華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院放射科，湖北武漢 430022;2.華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院藥劑科，湖北武漢 430022)

白及作為傳統(tǒng)中藥可以用來治療消化道黏膜損傷、潰瘍、出血、挫傷和燒傷，因而在東亞國家廣泛使用。白及多糖主要成分為由4分子甘露糖和1分子葡萄糖組成的葡配甘露糖［1］，屬高分子化合物，在水中溶解時受分子間氫鍵作用的影響，易形成親水性凝膠［2］，白及多糖的這一特性使其在臨床上有很好的治療作用。本課題組自上世紀以來對祖國傳統(tǒng)中藥白及進行了系列的研究，證實白及提取物可作為各種血管栓塞劑的優(yōu)良載體，制作的白及微球及載藥微球還能通過抑制腫瘤新生血管生成及側(cè)支循環(huán)的建立發(fā)揮抗腫瘤作用［3］。有文獻報道白及具有一定直接抗腫瘤作用并應(yīng)用于抗腫瘤研究［4］，但白及多糖對腫瘤細胞的具體作用未見報道，其作用機制尚不明確。本實驗隨機選取人胃癌細胞 (sgc)、人卵巢癌細胞 (A2780)、肝癌細胞(HepG2)，通過MTT法觀察和檢測純化的白及多糖對這3種腫瘤細胞生長的影響，并采用流式細胞儀檢測腫瘤細胞的細胞周期變化，旨在探討白及多糖對腫瘤細胞生長的作用，為研究其抗腫瘤作用提供分子生物學(xué)方面的實驗依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 材料 Sgc、A2780、HepG2由華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院介入放射科熊付博士惠贈;白及莖塊購于湖北省醫(yī)藥公司，經(jīng)華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院中藥室鑒定，符合2010年版《中國藥典》的相關(guān)要求。三氯甲烷、正丁醇、無水乙二胺、環(huán)氧氯丙烷、液體石蠟、司盤85、吐溫80、異丙醇、丙酮、石油醚 (國藥集團化學(xué)試劑有限公司武漢分公司，分析純)，DEAE-纖維素 (DE-52)100和Sephadex G-100(美國Whatman公司)，T-系列標準多糖 (美國Pharmacia公司)，考馬斯亮藍 G-250為(美 國 Sigma 公 司);DMEM/HIGH GLUCOSE(SH30022.01B，美國Hyclone公司)，1640培養(yǎng)基 (美國Hyclone公司)，改良型RPMI-1640培養(yǎng)基 (SH30809.01B，美國Hyclone公司)，胎牛血清 (110311，杭州四季青公司)，胰酶 (0458，美國Amresco公司)，雙抗 (武漢谷歌生物公司)，D'hanks(1009，武漢谷歌生物公司)，MTT(Ns8180，北京索萊寶公司)和DMSO(0231，索北京萊寶公司)。核糖核酸酶RNase A(g2-R8021，武漢谷歌生物科技有限公司)，碘化丙啶PI染液 (g4-pi10，武漢谷歌生物科技有限公司)。

1.2 儀器 HH-4型恒溫水浴鍋 (江蘇金壇市宏華儀器廠)，RE-52型減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 (上海亞榮生化儀器廠)，DZF-6021型真空干燥箱 (上海精密實驗設(shè)備有限公司)，LGJ冷凍干燥機 (北京四環(huán)科學(xué)儀器廠)，AUW220D電子天平 (日本島津公司)，離心機 (北京醫(yī)用離心機廠);CO2恒溫培養(yǎng)箱 (MCO-15AC，日本SANYO公司)，潔凈工作臺 (SW-CJ-1FD，蘇凈安泰)，生物倒置顯微鏡(XDS-18，重慶水電儀器總公司)，倒置熒光顯微鏡(TE2000，日本Nikon公司)，酶標檢測儀 (Rt2100c，美國Rayto)，離心機 (TD2SO-2H，上海飛鴿)，不銹鋼滅菌鍋(DSX-280A，上海申安醫(yī)療設(shè)備)，照相機 (fe5010，日本奧林巴斯)，流式細胞儀 (BD，F(xiàn)ACsort，美國 Becton-Dicknson公司)。

2 方法

2.1 白及多糖提取 白及莖塊加20倍體積蒸餾水，60℃回流提取4 h，重復(fù)提取1次，合并2次提取液，過濾，離心 (5000×g，10 min)，取上清液，加入相同體積石油醚，振蕩，取下層提取液，再加入2%活性碳，調(diào)節(jié)pH至3.5，40℃水浴30 min，過濾除去殘渣，70℃減壓濃縮至較小體積，加3倍體積無水乙醇沉淀，離心 (5000×g，10 min)，取沉淀，溶于最小體積蒸餾水中，Savage法脫蛋白至無中間層析出為止，離心 (5000×g，10 min)，取上層清液。采用考馬斯亮藍G-250法檢測至無蛋白質(zhì)被測出。所得溶液對流水透析3 d，蒸餾水透析2 d，真空冷凍干燥。冷凍干燥后的白及多糖溶于蒸餾水，配成1%溶液，在陰離子交換纖維素DE-52柱上層析。先以多于一個柱體積的蒸餾水洗脫，而后分別用0.05、0.1、0.5 mol/L NaCl各500 mL進行階段性洗脫，用自動收集器每管10 mL收集，體積流量為2 mL/min，蒽酮-硫酸法檢測，得到一水洗組分，收集該組分，對流水透析，冷凍干燥。冷凍干燥后的白及多糖溶于蒸餾水中，離心 (5000×g，10 min)，取上清，上Sephadex G-100柱，以0.02 mol/L NaCl洗脫，體積流量0.5 mL/min，3 mL收1管，蒽酮-硫酸法檢測，得一多糖洗脫峰，收集該洗脫峰，對流水透析，冷凍干燥得純化白及多糖，計算多糖平均得率 ［(純化白及多糖質(zhì)量/樣品總質(zhì)量)×100%］。

2.2 腫瘤細胞培養(yǎng) Sgc采用1640培養(yǎng)基，A2780和HepG2采用DMEM高糖培養(yǎng)基，在5%CO2、37℃細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)，細胞呈貼壁生長，用0.25%的胰酶消化傳代，用于實驗的細胞均處于對數(shù)生長期。

2.3 白及多糖對腫瘤細胞的生長抑制作用 將對數(shù)生長期的腫瘤細胞用胰蛋白酶消化后配制成密度為1×104個/mL的細胞懸液，按10000細胞/孔接種于96孔板，每孔加200 μL。然后將平板置37℃、5%CO2濕度培養(yǎng)箱中24 h后，于24、48、72 h分別加入各個細胞樣品對應(yīng)的白及多糖(50、100、200、400 μg/mL)的培養(yǎng)基，每個樣本質(zhì)量濃度設(shè)定平行的3個孔，對照組加不含白及多糖的培養(yǎng)液200 μL，再放入培養(yǎng)箱中孵育。每孔加入用按5 mg/mL新鮮配制的MTT溶液50 μL，孵育4 h，使MTT還原為甲瓚，當在倒置顯微鏡下看到孔板內(nèi)的細胞周圍出現(xiàn)絲狀紫色結(jié)晶體時去除上清液，每孔加二甲基亞砜200 μL，當平板搖床搖勻后，再使用酶標儀測定光密度值 (檢測波長570 nm)，以溶劑對照處理細胞為對照組，按公式計算白及多糖對細胞的抑制率。抑制率 =(1－實驗組/空白組)×100%。

2.4 腫瘤細胞周期分布 收集作用到72 h，白及多糖處理質(zhì)量濃度為200 μg/mL的腫瘤細胞，每種細胞設(shè)為2組，即空白對照組與實驗組，用70%乙醇4℃固定過夜，PBS洗兩遍，加入100 μg/mL RNA酶，37℃消化30 min，酶切RNA;加50 μg/mL碘化丙啶，避光4℃染色30 min后，用流式細胞儀檢測，計算出腫瘤細胞周期分布。

3 數(shù)據(jù)處理

4 結(jié)果

4.1 白及多糖對3種腫瘤細胞增殖抑制作用 提取的白及多糖為乳白色無嗅無味粉末，常溫下微溶于水，溶于熱水，不溶于有機溶劑，其水溶液幾乎為無色透明狀。DE-52柱層析得到一水洗脫多糖組成成分，再經(jīng)Sephadex G-100柱層析均呈單一的對稱峰，表明樣品為均一組成成分，白及多糖的平均得率為 (1.9±0.2)%。白及多糖對3種腫瘤細胞的增殖抑制率具有時間及劑量依賴性，不同質(zhì)量濃度的白及多糖與腫瘤細胞一起培養(yǎng)后，白及多糖對3種腫瘤細胞的生長均有抑制 (圖1～3)。隨著與白及多糖培養(yǎng)時間的延長，白及多糖質(zhì)量濃度的增高，對腫瘤細胞的抑制率越高，但白及多糖質(zhì)量濃度過高時，抑制率并不能繼續(xù)增高。經(jīng)計算，72 h后白及多糖對 sgc、A2780、HepG2的IC50分別為:26.5 μg/mL、65.7 μg/mL、3.7 ×1012μg/mL，由此可知，在3種腫瘤細胞中，白及多糖對sgc的抑制作用最強，對HepG2的抑制作用較小。

圖1 白及多糖對胃癌細胞抑制率曲線

圖2 白及多糖對卵巢癌細胞抑制率曲線

4.2 白及多糖對3種腫瘤細胞周期分布的影響 流式細胞檢測顯示白及多糖培養(yǎng)sgc后，G0/G1期細胞增多，S期細胞無明顯變化，G2/M期細胞減少;白及多糖培養(yǎng)A2780后，S期細胞增多，G2/M期細胞減少，G0/G1期細胞無明顯變化;白及多糖培養(yǎng)HepG2后，G0/G1期細胞增多，S期細胞無明顯變化，G2/M期細胞減少 (見表1)。由此可知，白及多糖將sgc細胞和HepG2細胞阻滯在G0/G1期，將A2780細胞阻滯在S期。

圖3 白及多糖對肝癌細胞抑制率曲線

表1 白及多糖對3種腫瘤細胞周期分布的影響

5 討論

多糖是自然界普遍存在的一類生物大分子，具有廣泛的生物學(xué)活性，作為免疫調(diào)節(jié)劑可激活多種免疫細胞，促進細胞因子生成，活化補體而發(fā)揮抗腫瘤、抗病毒、抗菌、抗炎、抗氧化等作用［5］。目前研究認為多糖抗腫瘤作用:一是對腫瘤細胞的直接作用，即多糖直接殺死腫瘤細胞，包括對腫瘤細胞膜的特異性作用、抗自由基作用、誘導(dǎo)分化與誘導(dǎo)凋亡、對腫瘤基因的改變及對腫瘤細胞超微結(jié)構(gòu)的影響等［6］;二是作為免疫反應(yīng)調(diào)節(jié)劑，通過增強機體的免疫功能而間接抑制或者殺滅腫瘤細胞［7］。本實驗結(jié)果顯示，白及多糖在體外對3種腫瘤細胞的生長均有抑制作用，且抑制效應(yīng)隨白及多糖質(zhì)量濃度的不同而明顯不同 (P＜0.05)，說明白及多糖具有抑制sgc、A2780和Hep-G2增殖的作用，并且，IC50值提示對sgc的抑制作用最明顯。

以往的研究表明多糖抑制腫瘤細胞增殖的效果與劑量雖然存在依賴關(guān)系，但這種關(guān)系并不十分嚴格［8］。當多糖質(zhì)量濃度過高時，多糖對腫瘤細胞的抑制增殖作用反而有所減弱［9］。出現(xiàn)這種現(xiàn)象，可能與多糖是混合多糖的特征有關(guān)［10］。多糖成分復(fù)雜，可能也是造成對多糖抑制腫瘤細胞增殖效果和機理研究結(jié)果難于統(tǒng)一的原因之一，這無疑也是將多糖真正用于腫瘤臨床治療的障礙之一［11］。本實驗結(jié)果顯示隨著白及多糖質(zhì)量濃度的逐漸增加，對3種腫瘤細胞的抑制率也逐漸上升，但增加到最高質(zhì)量濃度后反而抑制率有所下降。提高多糖的純化率可能是有效的實現(xiàn)多糖真正發(fā)揮抑制腫瘤增殖作用的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，其必將依賴多糖提取與純化技術(shù)的進一步提高。

在本實驗中經(jīng)流式細胞儀檢測腫瘤細胞周期的結(jié)果顯示，經(jīng)白及多糖處理后，3種腫瘤細胞的細胞周期均發(fā)生了停滯，sgc細胞和HepG2細胞停滯在G0/G1期，A2780細胞停滯在S期。細胞周期在腫瘤的生長調(diào)控中具有非常重要的作用，細胞周期有G1期關(guān)鍵點和G2期關(guān)鍵點，G1期檢驗點決定細胞能否通過G1期進入S期，它是細胞周期的始動機制;G2期向M期的轉(zhuǎn)變涉及到細胞的有絲分裂，包括胞質(zhì)分裂和核DNA分裂，完成由1個細胞向2個細胞的轉(zhuǎn)化［12-14］。許多抗腫瘤藥對腫瘤細胞的分裂周期具有選擇性，本實驗結(jié)果顯示經(jīng)白及多糖處理后，3種腫瘤細胞于不同的細胞周期發(fā)生增殖抑制，可能與此有關(guān)。細胞凋亡又稱為細胞程序性死亡［15］，目前認為，許多腫瘤的發(fā)生就是由于該腫瘤細胞凋亡通道受阻而引起的。白及多糖對腫瘤細胞周期的阻滯作用，為其具有抗腫瘤作用提供了實驗證據(jù)，也為以后更進一步地進行抗腫瘤實驗提供初步的實驗依據(jù)，但是白及多糖具體通過哪些通道而發(fā)生抗腫瘤作用，是否通過凋亡途徑，仍然是今后進一步研究的課題。

天然多糖臨床不良反應(yīng)小，目前不少多糖已應(yīng)用于臨床治療，在多個領(lǐng)域內(nèi)顯示出良好的應(yīng)用前景。本實驗所用的白及多糖是經(jīng)過層析柱分離純化的多糖組分，而非單糖結(jié)構(gòu)，因此其顯著抑制腫瘤細胞生長的作用很可能是多種單糖聚合在一起的協(xié)同作用。白及多糖可抑制腫瘤細胞的生長，影響腫瘤細胞的生長周期，但是否與多糖誘發(fā)細胞凋亡、影響細胞間信號分子表達、改變腫瘤基因等因素有關(guān)，值得進一步深入研究。

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