昆津病毒和巴馬哈森林病毒雙重RT-PCR檢測方法的建立

林二妹 白紅巖 孫肖紅 徐寶梁*

（1.河北省承德醫(yī)學(xué)院 河北承德 067000；2.中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院）

1 前言

昆津病毒（Kunjin virus，KUNV）是黃病毒科黃病毒屬成員，1960年在澳大利亞昆士蘭北部的環(huán)喙庫蚊(Culex Annulirostris)中分離并以該地區(qū)一個(gè)土著部落名字命名[1]，其他蚊種如偽雜鱗庫蚊(Culex preudovishnui)，致倦庫蚊、Cx australicus 和Cx Squamosus等蚊種也曾分離出KUNV[2,3]。人感染KUNV后大多數(shù)無臨床癥狀，少數(shù)與一些非腦炎性疾病有關(guān)，伴有發(fā)熱、頭痛、肌痛和身體不適，有時(shí)還伴有關(guān)節(jié)粘連[4]。巴馬哈森林病毒（Barmah Forest virus，BFV）屬于甲病毒，首次分離于1974年[5]，主要傳播媒介是伊蚊屬和致倦庫蚊[6]。BFV感染可出現(xiàn)發(fā)熱、頭痛及肌肉和關(guān)節(jié)疼痛等癥狀，有時(shí)出疹，通常是在身軀或四肢上[7,8]。

隨著中國與世界其他國家之間的貿(mào)易、旅游、人員往來日益頻繁，KUNV、BFV通過各種途徑傳入的可能性很大，雖然我國尚未分離到這兩種病毒，但是存在有相關(guān)媒介蚊蟲，人群中也曾檢測有BFV抗體，如貴州省健康人群BFV IgG抗體陽性率為1.49%，不明原因發(fā)熱患者中檢出BFV IgM陽性率為1.96%[9]，提示我國人群可能存在該病毒的感染。目前，針對KUNV的檢測方法有血清學(xué)、組織免疫學(xué)檢測，可作為KUNV病毒病的診斷依據(jù),及分子生物學(xué)檢測[10]；針對BFV的檢測方法有IgM抗體和IgG抗體檢測[9]，但是能同時(shí)檢測這兩種病毒的具體方法尚無報(bào)道。鑒于這兩種病毒均主要分布于澳大利亞，傳播媒介以致倦庫蚊為主，建立能同時(shí)檢測這兩種病毒的雙重RTPCR方法，能有效作為口岸傳染病監(jiān)測的技術(shù)儲(chǔ)備。

2 材料與方法

2.1 材料

2.1.1 儀器

生物安全柜：美國NUAIR；普通PCR儀：美國ABI 2720；超微量分光光度計(jì)：美國NanoDrop ND-1000；電泳系統(tǒng)：美國Bio-Rad；組織研磨儀：日本TOMY；臺(tái)式冷凍離心機(jī)：德國Eppendorf；CO2培養(yǎng)箱，振蕩器，制冰機(jī)，-80℃冰箱，-40℃冰箱，水浴槽。

2.1.3 試劑

RNA提取試劑盒：Qiagen公司；轉(zhuǎn)錄試劑盒及反轉(zhuǎn)錄試劑盒：Promega公司。

2.2 方法

2.2.1 引物設(shè)計(jì)

從GenBank中檢索KUNV病毒34株，BFV病毒26株全基因序列，通過DNAstar軟件進(jìn)行序列比對分析，選擇其高度保守的E基因?yàn)槟康幕颍肂eacon Designer7.0軟件設(shè)計(jì)引物（表1）。KUNV和BFV的E基因片段及引物序列由英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司的合成。

表1 KUNV和BFV引物序列

2.2.2 模板的制備

將合成的KUNV和BFV的E基因片段構(gòu)建質(zhì)粒，搖菌，酶切，純化，然后進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄及反轉(zhuǎn)錄，按試劑盒說明操作，所得RNA于-80℃保存，cDNA于-20℃保存。

Lacross病毒(LAC)的S基因、雪靴野兔病毒(SSH)的S基因、瑪雅羅病毒(MAYV)的NS-5基因片段由上海英濰捷基貿(mào)易有限公司合成，構(gòu)建質(zhì)粒，搖菌，酶切，純化，然后進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄及反轉(zhuǎn)錄，均按試劑盒說明操作，所得RNA于-80℃保存，cDNA于-20℃保存。黃熱病毒（YFV）疫苗本實(shí)驗(yàn)室留存。

2.2.3 單模板單引物擴(kuò)增

以KUNV的cDNA為模板，用KUNV-F、KUNV-R進(jìn)行擴(kuò)增，以BFV的cDNA為模板，用BFV-F、BFV-R進(jìn)行擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系：10×Buffer 2.5μL，10mM的dNTP 2μL，Taq DNA聚合酶0.3μL，KUNV-F/R（200nM）、及BFV-F/R（200nM）各0.5μL，模板cDNA 2μL，其余用無菌去離子水補(bǔ)足，總體積25μL。擴(kuò)增條件為94℃、5min，94℃、30s，56℃、30s，72℃、1min，72℃、10min，4℃，∞。35個(gè)循環(huán)。

2.2.4 反應(yīng)條件的優(yōu)化

固定模板cDNA濃度為400nM，優(yōu)化確定最佳引物濃度和退火溫度。引物濃度：KUNV-F/R，BFV-F/R 分別為200nM，400nM，600nM，反應(yīng)體系同2.2.3，退火溫度為49℃、50℃、51℃、52℃、53℃、54℃、55℃、56℃（表2）。反應(yīng)條件：94℃、5min，94℃ 30sec，（49℃、50℃、51℃、52℃、53℃、54℃、55℃、56℃）30sec，72℃、1min，72℃、10min，4℃，∞。35個(gè)循環(huán)。

表2 KUNV、BFV引物濃度、退火溫度優(yōu)化

2.2.5 敏感性實(shí)驗(yàn)

用公式（R N A拷貝數(shù)=R N A濃度×6.02×1014/330×RNA的長度）計(jì)算拷貝數(shù)。

從KUNV的RNA濃度（4604 ng/μL），BFV的RNA濃度（4550ng/μL），得出KUNV拷貝數(shù)為1.83×1013copies/μL，BFV拷貝數(shù)為2.02×1013copies/μL。

取K U N V R N A 1 0 μ L進(jìn)行1 0倍稀釋為模板，即從1.83×1013copies/μL-1.83×100copies/μL；取BFV RNA 10μL進(jìn)行10倍稀釋為模板，即從2.02×1013copies/μL-2.02×100copies/μL。PCR反應(yīng)體系：Buffer 12.5μL，KUNV-F/R（200nM）、及BFV-F/R（200nM）各0.5μL，KUNV RNA 3μL ，BFV RNA 3μL，EnzymeMix 1μL，無RNA酶水3.5μL?？傮w積25μL。反應(yīng)條件：50℃，30min，94℃，2min，94℃ 30sec，56℃ 30sec，72℃，1min，72℃，10min。35個(gè)循環(huán)。

2.2.6 特異性實(shí)驗(yàn)

用優(yōu)化的最佳引物濃度和退火溫度，以KUNV和BFV、KUNV、BFV、LAC、SSH、MAYV、YFV的cDNA為模板。PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)條件同2.2.3。

3 結(jié)果

3.1 反應(yīng)條件的優(yōu)化

固定模板cDNA濃度為400nM，引物濃度：KUNV-F/R，BFV-F/R 分別為200nM，400nM，600nM，退火溫度從49℃-56℃，經(jīng)優(yōu)化后確定最佳引物KUNV-F/R、BFV-F/R的終濃度相同，均為200 nM，最佳退火溫度為56℃（圖1）。

圖1 KUNV-F/R、BFV-F/R濃度，退火溫度優(yōu)化結(jié)果

3.2 單模板單引物擴(kuò)增

用引物KUNV-F/R擴(kuò)增KUNV的E基因，出現(xiàn)了177bp條帶，與預(yù)期的擴(kuò)增片段大小相符；用引物BFV-F/R擴(kuò)增BFV的E基因，出現(xiàn)了337bp條帶，與預(yù)期的擴(kuò)增片段大小相符（圖2）。

圖2 KUNV和BFV的單引物單模板擴(kuò)增

3.3 敏感性實(shí)驗(yàn)

用不同稀釋度的K U N V和B F V的R N A為模板，最低檢測限均為1 0-7，對應(yīng)的拷貝數(shù)為KUNV：1.83×106copies/μL，BFV：2.02×106copies/μL（圖3）。

圖3 KUNV和BFV的敏感性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.4 特異性實(shí)驗(yàn)

以LAC，SSH，MAYV，YFV cDNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增，均未出現(xiàn)擴(kuò)增條帶（圖4）。

圖4 KUNV和BFV的特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

4 討論

蟲媒病毒是由吸血節(jié)肢動(dòng)物傳播的病毒，蟲媒病毒病屬于自然疫源性疾病，這其本身就存在于自然界，隨時(shí)都有可能造成感染或流行。目前，全世界已發(fā)現(xiàn)500余種蟲媒病毒，其中100余種可致人、畜疾病，傳播媒介中蚊蟲達(dá)300余種[9]。隨著全球經(jīng)濟(jì)一體化、貿(mào)易自由化，中國與世界其他國家之間的貿(mào)易、旅游、人員往來日益頻繁，蚊蟲攜帶的病毒在宿主間極易進(jìn)行傳播?？诎缎l(wèi)生檢疫部門應(yīng)加強(qiáng)監(jiān)測，防止蚊媒在口岸生存和擴(kuò)散，及時(shí)發(fā)現(xiàn)疫情，對來自KUNV，BFV病毒病疫區(qū)的交通工具、行李、貨物和集裝箱等加強(qiáng)衛(wèi)生檢查[11]。秦皇島檢驗(yàn)檢疫局曾從來自17個(gè)國家和地區(qū)的入境外籍貨輪上捕獲的蚊蟲中分離到13株蟲媒病毒[12]，提示應(yīng)加強(qiáng)醫(yī)學(xué)媒介攜帶蟲媒病毒的監(jiān)測及檢測工作，建立快速、敏感的方法用于國境口岸蟲媒病毒的監(jiān)測與檢測。

目前針對KUNV的檢測方法有血清學(xué)、組織免疫學(xué)及分子生物學(xué)檢測[10]，常見的血清和組織免疫學(xué)檢測方法主要有表位封閉ELISA (an epitope blocking ELISA)法[13,14]、中和試驗(yàn)(微量法)[14,15]、血凝抑制試驗(yàn)[14]和組織中病毒抗原的檢測[14,16]。近年來,KUNV 蛋白單克隆抗體(MAb)3.1112G[13,14]、10A1(8153)[17]、3.67G 和3.91D 等已先后研制出來廣泛應(yīng)用于KUNV 的實(shí)驗(yàn)室檢測[17], 其中除3.1112G 是針對NS1 蛋白外, 其余都是針對E蛋白的；分子生物學(xué)檢測：逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT- PCR)法應(yīng)用于RNA 病毒的診斷, 針對不同的擴(kuò)增片段、結(jié)構(gòu)區(qū)、非結(jié)構(gòu)區(qū)、NS5 末端和3’UTR 等[18]設(shè)計(jì)不同的引物, 用一步法RT- PCR檢測KUNV RNA[19]，針對BFV的檢測方法有IgM抗體和IgG抗體檢測[9], 但這些方法比較耗時(shí)費(fèi)力，對標(biāo)本要求高，本研究建立的KUNV和BFV雙重RT-PCR方法具有高靈敏度、高特異性、低污染及耗時(shí)短等特點(diǎn)，并且最低檢測限為KUNV：1.83×106copies/μL，BFV：2.02×106copies/μL。雖然我國到目前為止還未發(fā)現(xiàn)KUNV病和BFV病，但鑒于這兩種病毒的傳播媒介在我國也有分布[9,12]，并且我國有多種庫蚊屬的蚊蟲，傳入的風(fēng)險(xiǎn)很大，因此建立KUNV和BFV雙重RT-PCR方法能為邊境口岸病原體的快速檢測提供先進(jìn)的技術(shù)保障。

5 結(jié)論

本研究建立的昆津病毒和巴馬哈森林病毒雙重RT-PCR檢測方法靈敏度高，特異性好，檢測限低（最低檢測限KUNV為1.83×106copies/μL，BFV為2.02×106copies/μL），可為邊境口岸昆津病毒和巴馬哈森林病毒的快速檢測提供先進(jìn)的技術(shù)保障。

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