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    云南省江城縣雜鱗庫蚊復(fù)合組蚊蟲分子鑒定及COI基因序列分析

    2015-06-11 02:21:40鄧成杰王靜林何于雯李華春
    動物醫(yī)學(xué)進展 2015年11期
    關(guān)鍵詞:庫蚊江城蚊蟲

    鄧成杰,王靜林,周 洋,何于雯,胡 奇,李華春

    (1.云南省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院,云南昆明650224;2.云南省鎮(zhèn)雄縣畜牧獸醫(yī)局,云南鎮(zhèn)雄657200)

    雜鱗庫蚊復(fù)合組包括三帶喙庫蚊(C.tritaeniorhynchus)、雜鱗庫蚊(C.vishnui)、環(huán)帶庫蚊(C.annulus)、偽雜鱗庫蚊(C.pseudovishnui)等數(shù)種親緣關(guān)系較為密切的蚊種[1]。該復(fù)合組中三帶喙庫蚊、斑帶庫蚊等是乙型腦炎病毒等多種蟲媒病毒的主要傳播媒介,在我國分布較為廣泛,也是我國南方地區(qū)的主要優(yōu)勢蚊種,主要吸血對象是人和家畜動物,對人類和家畜動物危害極大[2-3]。但是該復(fù)合組蚊蟲形態(tài)學(xué)上非常相似,用傳統(tǒng)形態(tài)分類的方法很難對這些蚊蟲進行準確鑒定[4]。因此,本文對采集的雜鱗庫蚊進行分子鑒定及COI基因序列分析,從分子水平了解三帶喙庫蚊等雜鱗庫蚊遺傳進化關(guān)系,為研究我國蚊蟲分子分類提供資料,這對預(yù)防和控制以三帶喙庫蚊等雜鱗庫蚊為傳播媒介的疾病發(fā)生和傳播具有重要意義。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 標本采集 2013年5月在云南省江城縣農(nóng)戶牛圈采用誘蚊燈(功夫小帥,12V,300 mA,湖北武漢)采集標本,采集時間約為18∶00至次日早晨8:00 共14h。次日早晨收集標本,將標本置于-20℃冰箱中冷凍20min~30 min,待存活的蚊蟲剛好冷凍死亡后,取出標本根據(jù)蚊蟲形態(tài)學(xué)特征采用解剖鏡進行蚊蟲形態(tài)學(xué)鑒定,將形態(tài)學(xué)鑒定為雜鱗庫蚊復(fù)合組蚊蟲標本放入700 mL/L 乙醇中保存[5-6]。

    1.2 方法

    1.2.1 蚊蟲DNA 提取及PCR 擴增 從乙醇中取出雜鱗庫蚊復(fù)合組蚊蟲標本,用DNA 提取試劑盒(天根公司)按說明書提取蚊蟲DNA,操作步驟簡要如下:每只雜鱗庫蚊復(fù)合組蚊蟲標本用緩沖液GA 200μL,充分研磨,加20μL ProteinaseK,56℃溫浴過夜,加200μL緩沖液GB混勻,70℃放置10min。加200μL無水乙醇充分混勻15min,過柱,分別用500μL緩沖液GD 和600μL 漂洗液PW 洗滌,加60μL洗脫緩沖液TE 洗脫DNA。取2μL cDNA做反應(yīng)模板,分別用COI基因特異引物[5]進行PCR擴 增,依 次 加 入10×buffer 5 μL,2.5 mmol/L dNTP 5μL,上、下游引物各1.25μL,r Taq酶0.75 μL,去離子31.75μL,充分混勻。PCR 程序為94℃5min;94℃30s,52℃30s,72℃60s,35 個循環(huán);72℃延伸10min,10mL/L 瓊脂糖電泳檢查擴增條帶,用TaKaRa DNA fragment Purification Kit純化PCR 產(chǎn)物,PCR 產(chǎn)物通過華大基因公司進行測序[7-9]。

    1.2.2 序列分析 使用Clustal X Version 2.1 軟件包進行病毒基因核苷酸序列比對,DNA Star 軟件中 Meg Align 進行核苷酸同源性分析。用MEGA 4.1 軟件完成基于Neighbour-joining(NJ)方法的進化樹繪制,Bootstrap值為1 000[10]。

    2 結(jié)果

    2.1 蚊蟲采集

    2013年5月在江城縣共采集蚊蟲標本148只,經(jīng)形態(tài)學(xué)鑒定致倦庫蚊112只(75.67%)、三帶喙庫蚊12只(8.11%)、騷擾阿蚊17(11.49%)、其他蚊蟲7只(4.73%),表明了致倦庫蚊是當?shù)? 月的優(yōu)勢蚊蟲種類。

    2.2 核苷酸同源性分析

    對云南省江城縣采集到的12只形態(tài)學(xué)鑒定為三帶喙庫蚊標本(均為雌性,8只飽血,4只未吸血)進行DNA 提取和COI基因PCR 擴增,12只蚊蟲標本擴增均為陽性,經(jīng)序列測定獲得580個核苷酸序列。12只庫蚊COI基因核苷酸同源性在94.7%~100%,其中M2、M6、M7三只蚊蟲核苷酸同源性在99.5%~99.8%,M1、M3、M4、M5、M8、M9、M10、M11、M12共9 只蚊蟲核苷酸同源性在99.2%~99.8%,而兩者之間核苷酸同源性在94.7%~95.7%。12只庫蚊COI基因核苷酸與GenBank中雜鱗庫蚊復(fù)合組的三帶喙庫蚊、雜鱗庫蚊以及尖音庫蚊復(fù)合組的淡色庫蚊和致倦庫蚊相應(yīng)序列一起進行分析(表1),M1、M3、M4、M5、M8、M9、M10、M11、M12共9只蚊蟲與三帶喙庫蚊核苷酸同源性最高為98%~100%,與雜鱗庫蚊和偽雜鱗庫蚊同源性分別在94.7%~95.5%和94.2%~94.5%,與尖音庫蚊復(fù)合組的淡色庫蚊和致倦庫蚊同源性均低于93.2%;M2、M6、M7三只蚊蟲與三帶喙庫蚊核苷酸同源性在94.8%~95.9%,與雜鱗庫蚊和偽雜鱗庫蚊同源性分別在94.4%~94.5%和93.9%~94.3%,與尖音庫蚊復(fù)合組的淡色庫蚊和致倦庫蚊同源性均低于92.2%。

    表1 云南省江城縣雜鱗庫蚊復(fù)合組COI基因核苷酸序列同源性分析Table 1 The homologous analysis of COI genes of Culex vishnui complex in Jiangcheng County,Yunnan Province

    2.3 遺傳進化分析

    云南省江城縣采集12只蚊蟲與GenBank中12條庫蚊COI基因序列一起構(gòu)建系統(tǒng)進化樹(圖1)。結(jié)果顯示所有24條庫蚊COI基因序列形成2個較大進化分支,即雜鱗庫蚊復(fù)合組庫蚊進化分支和尖音庫蚊復(fù)合組庫蚊進化分支;云南省江城縣采集的12只蚊蟲序列位于雜鱗庫蚊復(fù)合組庫蚊進化分支內(nèi),提示云南省江城縣采集的12只蚊蟲標本均為雜鱗庫蚊復(fù)合組庫蚊。進一步對雜鱗庫蚊復(fù)合組庫蚊分析發(fā)現(xiàn)M1、M3、M4、M5、M8、M9、M10、M11、M12共9只蚊蟲與三帶喙庫蚊位于同一進化分支內(nèi),提示這9只庫蚊為三帶喙庫蚊;而M2、M6、M7蚊蟲明顯區(qū)別于雜鱗庫蚊復(fù)合組庫蚊的三帶喙庫蚊、雜鱗庫蚊和偽雜鱗庫蚊,單獨形成一個進化簇,提示這3只蚊蟲為雜鱗庫蚊復(fù)合組的庫蚊,分類地位的確定還有待于進一步的研究。

    圖1 云南省江城縣采集雜鱗庫蚊復(fù)合組蚊蟲COI基因(600nt)遺傳進化分析(◆代表本次采集蚊蟲標本)Fig.1 Phylogenetic analysis of COI genes(600nt)of Culex vishnui complexs in Jiangcheng county,Yunnan province(Diamonds represent insects collected this time)

    3 討論

    DNA 序列分析是鑒定生物體不同種、亞種和地理株,以及研究其系統(tǒng)進化關(guān)系的方法之一[11-12]。近年來,一些國內(nèi)外學(xué)者采用線粒體基因COI、COII、COIII和ITS基因序列以及其他一些基因作為分子靶標進行蚊蟲種類鑒定,其中線粒體基因COI進化速率適中,在能夠保證足夠變異的同時又很容易被通用引物擴增。目前,國內(nèi)外眾多學(xué)者采用COI基因作為分子靶標對等翅目、跳蟲類和鞘翅目等昆蟲進行深入研究,結(jié)果顯示無論在物種鑒定還是系統(tǒng)發(fā)育方面COI基因都是不錯的選擇。因此,本次研究采用COI基因作為分子靶標對云南省江城縣采集到的蚊蟲標本進行分子鑒定,結(jié)果顯示12只形態(tài)方法均鑒定為三帶喙庫蚊的標本,在系統(tǒng)進化樹上形成2個進化簇,這2個進化簇的蚊蟲標本之間的核苷酸同源性均低于95.7%,這個值明顯低于蚊蟲COI基因種內(nèi)判定值在98%以上[13-14],表明這12只形態(tài)學(xué)鑒定為三帶喙庫蚊的標本分屬于2種雜鱗庫蚊復(fù)合組不同庫蚊種。其中M1、M3、M4、M5、M8、M9、M10、M11、M12等9只蚊蟲與三帶喙庫蚊形成通一進化簇,核苷酸同源性均在98%以上,表明這9只蚊蟲標本為三帶喙庫蚊,而M2、M6、M7蚊蟲在雜鱗庫蚊復(fù)合組庫蚊中單獨形成一個進化簇,與三帶喙庫蚊和雜鱗庫蚊核苷酸同源性均明顯低于98%,提示這三只蚊蟲并不是三帶喙庫蚊,而是雜鱗庫蚊復(fù)合組的一種庫蚊,分類地位的確定還有待于進一步的研究。

    蚊蟲是一類醫(yī)學(xué)上非常重要的昆蟲,其種類多,分布廣。不同蚊蟲種類的生活以及吸血等行為存在明顯差異,這些差異直接關(guān)系到蚊傳疾病的傳播、流行及分布,因此必須對蚊科昆蟲進行系統(tǒng)發(fā)育的研究,從蚊蟲種群的演化歷史和進化關(guān)系分析環(huán)境變遷因子對蚊類生物學(xué)特性的制約和影響,是解釋現(xiàn)存蚊類的生態(tài)特性和傳病關(guān)系的重要基礎(chǔ)。本次研究開展形態(tài)學(xué)上相似的雜鱗庫蚊復(fù)合組蚊蟲種類的分子鑒定和遺傳進化關(guān)系的研究,避免了形態(tài)學(xué)對相近蚊蟲種類的錯誤分類,從分子水平較好明確這些蚊蟲分類,為人和動物蚊傳疾病的傳播控制提供科學(xué)依據(jù)。

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