小鼠發(fā)情周期中黃體大小及細(xì)胞的數(shù)量變化規(guī)律

宋孟秋，馬永生，曹玉鳳，劉 陽，楊 煥，范艷樂，陳 炯，殷玉鵬，趙善廷，陳樹林＊

（1.西北農(nóng)林科技大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，陜西楊凌712100；2.甘肅民族師范學(xué)院生命科學(xué)院，甘肅合作747000）

黃體（corpus luteam，CL）是哺乳動物卵巢排卵后其中的顆粒細(xì)胞和內(nèi)膜細(xì)胞分化而成的一個(gè)暫時(shí)性內(nèi)分泌器官，主要分泌孕酮，在哺乳動物的生殖調(diào)控中起著重要的作用［1］。黃體主要包括分泌類固醇類細(xì)胞和不分泌類固醇類細(xì)胞，其中，前者主要為大黃體細(xì)胞（large luteal cells，LLCs）和小黃體細(xì)胞（small luteal cells，SLCs），而后者則多為內(nèi)皮細(xì)胞、纖維母細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等［2］。由于LLCs與SLCs的分界線模糊，而SLCs又具有向LLCs分化的可能性［3］，同時(shí)離體黃體組織中LLCs和SLCs的數(shù)量比例并不能代表黃體中兩種細(xì)胞的真實(shí)比例［4-5］，因而，多年來關(guān)于兩種細(xì)胞的真實(shí)數(shù)據(jù)及大小也一直都是學(xué)者爭論的焦點(diǎn)。對黃體細(xì)胞大小通用的描述是通過黃體組織切片上黃體細(xì)胞的斷面進(jìn)行測量而得到的結(jié)果，而這并不能真實(shí)地反映黃體細(xì)胞的立體大小。為了探索周期性黃體大小及其不同類型細(xì)胞的數(shù)量變化規(guī)律，本研究分別采用自發(fā)生長的不同時(shí)期的黃體組織，測量不同時(shí)期黃體內(nèi)的細(xì)胞立體大小并計(jì)算不同立體大小的細(xì)胞所占比例，為新的黃體細(xì)胞分類體系的建立和計(jì)算機(jī)模擬構(gòu)建周期性黃體的三維立體構(gòu)象提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物 健康雌性昆明種小鼠，8周齡～10周齡，平均體重26g±0.5g，第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供。所有試驗(yàn)小鼠飼養(yǎng)在環(huán)境溫度17℃～24℃、相對濕度為55%±5%、自然光照條件下，自由采食、飲水。

1.1.2 主要試劑與儀器設(shè)備 蘇木精與伊紅染液，Solarbio公司產(chǎn)品；切片石蠟（硬蠟56℃～58℃，軟蠟54℃～56℃），上海華永石蠟有限公司產(chǎn)品；石蠟切片機(jī)RM2235，德國Leica公司生產(chǎn)；Olympus CHC型光學(xué)顯微鏡，日本Olympus光學(xué)工業(yè)株式會社；捷達(dá)801形態(tài)學(xué)分析軟件，江蘇捷達(dá)科技公司。

1.2 方法

1.2.1 發(fā)情周期鑒定及樣本采集 左手保定小鼠，右手將細(xì)棉簽用生理鹽水潤濕后緩緩插入陰道約0.5cm，輕輕轉(zhuǎn)動并將蘸有陰道分泌物的細(xì)棉簽在載玻片上均勻涂抺，待自然干燥后用堿性美藍(lán)染液染色5min后蒸餾水洗滌，并使之干燥，顯微鏡下觀察陰道涂片的細(xì)胞形態(tài)與分布變化以確定其發(fā)情狀況。用100mL／L水合氯醛腹腔注射對小鼠進(jìn)行麻醉，后迅速暴露胸腔，將注射用針頭刺入左心室用固定，同時(shí)用眼科剪剪開右心耳，之后緩慢注入100 mL左右生理鹽水以沖洗心血管中的血液，最后換用40mL／L多聚甲醛磷酸緩沖液（pH7.4）150mL進(jìn)行灌注固定。充分固定后，將兩側(cè)卵巢（如小米粒大小并帶有結(jié)締組織）小心地用眼科手術(shù)剪摘取，放入40mL／L多聚甲醛中保存。

1.2.2 石蠟切片制作及HE染色 從固定液中取出卵巢組織，流水沖洗12h，小心剝離剔除其上的結(jié)締組織和脂肪等組織，梯度酒精脫水后二甲苯透明并用石蠟進(jìn)行包埋，在石蠟切片機(jī)上把卵巢完整地切成厚度為6μm的連續(xù)縱向切片，標(biāo)明每一張切片的先后順序，并做好記錄，然后置于45℃恒溫箱中烘干。將干燥后的切片進(jìn)行脫蠟復(fù)水，蘇木精染色7min，鹽酸乙醇分化20s，伊紅染色7min，自來水洗去浮色后梯度酒精脫水，二甲苯透明后用中性樹膠封片。

1.2.3 圖像分析及數(shù)據(jù)處理 在10×10倍鏡野下對每一例卵巢切片上發(fā)育較好的黃體部分進(jìn)行拍照，將照片去除非黃體部分后用形態(tài)分析軟件對照片進(jìn)行分析，測量這些照片中黃體的最大切面的直徑大小，同時(shí)統(tǒng)計(jì)每張照片上黃體細(xì)胞的總數(shù)目，結(jié)果直接存于軟件系統(tǒng)，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。在40×10倍鏡野下隨機(jī)地對切片上某些細(xì)胞的平面細(xì)胞區(qū)域進(jìn)行拍照，然后對與此切片連續(xù)相鄰的若干張切片上和前述區(qū)域?qū)ξ坏钠矫婕?xì)胞區(qū)域進(jìn)行拍照，將這幾張切片的上述平面細(xì)胞區(qū)域組成一立體細(xì)胞區(qū)域并用軟件分析測量，每1個(gè)立體細(xì)胞區(qū)域內(nèi)測量8個(gè)黃體細(xì)胞的立體大小，得出這8個(gè)黃體細(xì)胞在這些照片上的最大斷面的長短徑，再根據(jù)這些細(xì)胞所在切片的張數(shù)得出細(xì)胞的縱徑估計(jì)值（縱徑以切片厚度6μm為單位），從而得出這個(gè)立體細(xì)胞區(qū)域內(nèi)8個(gè)黃體細(xì)胞的立體大小數(shù)據(jù)；共分析10個(gè)立體細(xì)胞區(qū)域得到80個(gè)黃體細(xì)胞的立體大小數(shù)據(jù)，然后對不同大小的黃體細(xì)胞所占比例進(jìn)行定量劃分。

2 結(jié)果

2.1 不同時(shí)期卵巢及黃體的大小

各時(shí)期黃體的形狀近似于球體，故其體積可以以其最大切面的直徑來表示。本研究中將小鼠周期性黃體從開始形成到生長增大直至退化的整個(gè)過程中劃為四個(gè)時(shí)期，分別為黃體Ⅰ期、黃體Ⅱ期、黃體Ⅲ期及黃體Ⅳ期，其與發(fā)情周期的一般相對應(yīng)關(guān)系是黃體Ⅰ期→發(fā)情后期、黃體Ⅱ期→發(fā)情間期、黃體Ⅲ期→發(fā)情前期和黃體Ⅳ期→發(fā)情期。數(shù)據(jù)表明，發(fā)情周期中，卵巢大小的變化無顯著性差異（表1）；而黃體體積變化中，發(fā)情后期與發(fā)情前期黃體最大切面大小無顯著性差異，發(fā)情間期與發(fā)情期黃體最大切面分別與其他時(shí)期相比均差異極顯著，其中，發(fā)情間期黃體切面最大，而發(fā)情期黃體切面最小，說明發(fā)情周期中黃體大小變化明顯（表2和圖1）。

表1 不同時(shí)期卵巢長、寬和高的乘積平均值及標(biāo)準(zhǔn)差（n＝10）Table 1 The average and standard deviation of products of length，width and high of every ovary in different periods（n＝10）

表2 不同時(shí)期黃體最大切面平均直徑（n＝10）Table 2 The average diameter of the biggest transverse section of corpus luteum in different periods（n＝10）

圖1 A.Ⅰ期黃體切片圖；B.Ⅱ期黃體切片圖；C.Ⅲ期黃體切片圖；D.Ⅳ期黃體切片圖（HE，400×）Fig.1 A.The paraffin section picture ofⅠperiod CL；B.The paraffin section picture ofⅡperiod CL；C.The paraffin section picture ofⅢperiod CL；D.The paraffin section picture of IV period CL（HE，400×）

2.2 不同時(shí)期黃體中細(xì)胞總數(shù)量的統(tǒng)計(jì)

不同時(shí)期黃體中細(xì)胞的總數(shù)量因卵巢與黃體自身活動狀況的不同而發(fā)生著變化。數(shù)據(jù)顯示，不同時(shí)期中黃體細(xì)胞的總數(shù)量各不相同且互相之間均存在顯著差異（表3）。

表3 各時(shí)期黃體的平均細(xì)胞數(shù)目Table 3 The average cell number of corpus luteum in each period

2.3 不同時(shí)期黃體細(xì)胞立體大小及其比例

不同時(shí)期黃體細(xì)胞的立體大小及其數(shù)量因卵巢所處的發(fā)情周期階段不同而存在差異。因數(shù)值過多，在10個(gè)細(xì)胞區(qū)域中各隨機(jī)選取1個(gè)黃體細(xì)胞最大斷面的長徑、短徑及縱徑數(shù)據(jù)并由表格的形式列出（表4）。

表4 不同時(shí)期黃體中的黃體細(xì)胞立體大小（μm）Table 4 The three-dimensional size of corpus luteum cells in different period corpus luteum（μm）

將每個(gè)細(xì)胞的長徑、短徑和縱徑數(shù)值相乘，其中縱徑數(shù)值以其中間值作近似處理，所得數(shù)據(jù)按500 μm3為單位的劃分區(qū)間進(jìn)行分布統(tǒng)計(jì)，從而將每一時(shí)期的80個(gè)上述數(shù)據(jù)在不同數(shù)值區(qū)間內(nèi)分布的情況進(jìn)行分析統(tǒng)計(jì)，從而得出不同時(shí)期的黃體中不同立體大小的黃體細(xì)胞所占比例。餅狀圖顯示，Ⅰ期黃體中黃體細(xì)胞主要以數(shù)值乘積在2 501μm3～3 000μm3和3 001μm3～3 500μm3的細(xì)胞居多，1 001μm3～1 500μm3的細(xì)胞也占一定比例，其他數(shù)值區(qū)間內(nèi)的細(xì)胞所占比例較小。Ⅱ期黃體中黃體細(xì)胞以數(shù)值乘積在3 001μm3～3 500μm3的細(xì)胞最多，其次是比例相當(dāng)?shù)臄?shù)值乘積在2 501μm3～3 000μm3和3 501μm3～4 000μm3的細(xì)胞，其他數(shù)值區(qū)間內(nèi)的細(xì)胞所占比例較小，另外這一時(shí)期的黃體中有一定比例的數(shù)值乘積很大的細(xì)胞。Ⅲ期黃體中黃體細(xì)胞總體上與Ⅱ期黃體一致的同時(shí)，數(shù)值乘積比較小的1 001μm3～1 500μm3的小細(xì)胞明顯的比Ⅱ期黃體多。Ⅳ期黃體中黃體細(xì)胞以數(shù)值乘積在1 001μm3～1 500μm3的細(xì)胞最多且比例很大，其他數(shù)值區(qū)間內(nèi)的細(xì)胞所占比例相當(dāng)，但這一時(shí)期的黃體中數(shù)值乘積在3 000μm3以上的細(xì)胞很少（圖2）。

3 討論

周期性黃體的體積大小在發(fā)情周期的不同時(shí)期存在著顯著的差異，說明周期性黃體自發(fā)生、生長直至退化的不同時(shí)期內(nèi)其體積發(fā)生了明顯的變化。然而，在整個(gè)發(fā)情周期中，盡管黃體體積的變化較為明顯，卵巢體積卻沒有明顯的變化，無論是在卵巢中黃體占優(yōu)勢的時(shí)期還是卵泡占優(yōu)勢的時(shí)期，卵巢內(nèi)部只是發(fā)生著卵泡和黃體的體積大小此消彼長的變化，而卵巢體積的始終如一可能是保持卵巢功能穩(wěn)定的一個(gè)調(diào)控途徑。

圖2 不同時(shí)期黃體中細(xì)胞三維數(shù)值相乘所得數(shù)據(jù)在不同數(shù)值區(qū)間內(nèi)的分布Fig.2 The product distribution of three-dimensional size of different period CL cells in different numerical areas

黃體中大小黃體細(xì)胞的數(shù)量比例在不同報(bào)道中差異較大，其原因是兩種細(xì)胞分類標(biāo)準(zhǔn)在各個(gè)研究中存在很大差異，很難直接比較［6］。在牛黃體中，有學(xué)者認(rèn)為直徑大于18μm的細(xì)胞為LLCs［7］，而也有文獻(xiàn)中認(rèn)為大于23μm的才為LLCs［4］；在羊黃體中，LLCs和SLCs的最小與最大直徑分別被報(bào)道為30μm和16μm［8］。而本研究數(shù)據(jù)顯示，在周期性黃體自發(fā)生、生長直至退化的過程中，其黃體細(xì)胞數(shù)目先是成一個(gè)上升態(tài)勢直至Ⅱ期黃體，而后隨著黃體組織的開始退化，其中的細(xì)胞數(shù)目也隨之減少，整個(gè)過程中細(xì)胞數(shù)目呈正態(tài)分布的趨勢發(fā)生變化。通過統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，在不同時(shí)期的周期性黃體中細(xì)胞總數(shù)目依時(shí)期不同而存在極顯著差異，且其中某一時(shí)期的細(xì)胞總數(shù)目與其他任一時(shí)期的細(xì)胞總數(shù)目間存在極顯著差異。究其原因，可能是在黃體化時(shí)，由于激素、細(xì)胞因子等一些生物活性物質(zhì)的作用，黃體細(xì)胞分化增殖，導(dǎo)致其數(shù)量逐漸地達(dá)到一個(gè)高峰，黃體發(fā)育達(dá)到成熟，以支持黃體功能的發(fā)揮，如卵泡抑素（follistatin，F(xiàn)S）可通過與活化素結(jié)合，以自分泌形式參與顆粒細(xì)胞內(nèi)甾體激素和糖蛋白激素合成與分泌的調(diào)節(jié)，從而促進(jìn)顆粒細(xì)胞分化與黃體形成［3］；優(yōu)勢卵泡發(fā)生排卵形成紅體后，其中合成的白細(xì)胞介素-1（interleukin-1，IL-1）可通過旁分泌方式促進(jìn)黃體細(xì)胞增殖及本身的分化［9-10］。而當(dāng)周期性黃體退化時(shí)，大量黃體細(xì)胞的染色質(zhì)濃縮、邊聚，在核膜下形成電子密度較高的半圓形或不規(guī)則結(jié)構(gòu)，細(xì)胞內(nèi)空泡較多，并且形成由質(zhì)膜包裹形成表面光滑的半圓形凋亡小體，后者被巨噬細(xì)胞或周圍鄰近的同類細(xì)胞吞噬［11］，這樣就造成了黃體細(xì)胞數(shù)目自Ⅲ期黃體后逐漸減少的情況，尤其是黃體組織在進(jìn)入Ⅲ期黃體階段時(shí)因黃體的顯著退化而使得黃體細(xì)胞數(shù)目急劇減少。

本研究中，我們獲得了黃體各個(gè)方面的靜態(tài)信息，這些靜態(tài)信息體現(xiàn)了周期性黃體自發(fā)生、生長直至退化消失的整個(gè)過程中其內(nèi)部組織結(jié)構(gòu)發(fā)生的動態(tài)變化，有利于計(jì)算機(jī)模擬重構(gòu)周期性黃體組織的立體構(gòu)象，從而為開展相關(guān)的一些研究提供便利；這也對通過在組織和細(xì)胞水平上獲得數(shù)據(jù)，繼而利用計(jì)算機(jī)模擬重構(gòu)生物組織乃至器官等的立體構(gòu)象提供了思路。

［1］Uniyal S，Panda R P，Chouhan V S，et al.Expression and localization of insulin-like growth factor system in corpus luteum during different stages of estrous cycle in water buffaloes（Bubalusbubalis）and the effect of insulin-like growth factorⅠon production of vascular endothelial growth factor and progesterone in luteal cells culturedinvitro［J］.Theriogenology，2015，1（83），58-77.

［2］Baithalu R K，Singh S K，Gupta C，et al.Insulin stimulates progesterone secretion to a greater extent than LH in early pregnant buffalo luteal cells culturedinvitro［J］.Anim Reprod Sci，2013，142（3-4）：131-136.

［3］陳北亨，王建辰.獸醫(yī)產(chǎn)科學(xué)［M］.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2001.

［4］Weber D M，F(xiàn)ields P A，Romrell L J，et al.Functional differences between small and large luteal cells of the late-pregnant vs non-pregnant cow［J］.Biol Reprod，1987，37（3）：685-697.

［5］Hansel W，Alila H W，Dowd J P，et al.Control of steroidogenesis in small and large bovine luteal cells［J］.Aust J Biol Sci，1987，40（3）：331-347.

［6］蒙學(xué)蓮，劉學(xué)榮，崔 燕.哺乳動物發(fā)情周期黃體的組織學(xué)研究進(jìn)展［J］.動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2004，25（6）：10-13.

［7］Chegini N，Ramani N，Rao C V.Morphological and biochemical characterization of small and large bovine luteal cells during pregnancy［J］.Mol Cell Endocrinol，1984，37（1）：89-102.

［8］Oshea J D，Rodgers R J，Wright P J.Cellular composition of the sheep corpus luteum in the mid-and late-luteal phases of the estrous cycle［J］.J Reprod Fertil，1986，76（2）：685-691.

［9］陳其新，毛鑫智，楊利國.細(xì)胞因子對動物卵巢生殖活動的調(diào)控［J］.國外畜牧科技，2000，27（3）：37-39.

［10］范瑞文.IFN和IL對卵巢生殖活動及胚胎附著的生理調(diào)控［J］.畜牧獸醫(yī)雜志，2001，20（2）：13-15.

［11］Choi J，Jo M，Lee E，Choi D.The role of autophagy in corpus luteum regression in the rat［J］.Biol Reprod，2011，85（3）：465-472.