液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定枸杞、大青葉等中藥材中6種黃曲霉毒素

聶福平 易廷輝 唐柏彬 楊 俊 王 昱 郗存顯 李賢良 王國(guó)民*

（1.重慶出入境檢驗(yàn)檢疫局/重慶市進(jìn)出口食品安全工程技術(shù)研究中心 重慶 400020；2.重慶大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)院；3.重慶市農(nóng)業(yè)環(huán)境保護(hù)監(jiān)測(cè)站）

1 前言

我國(guó)是中藥的發(fā)源地，運(yùn)用中藥防病治病的歷史悠久，有豐富的臨床經(jīng)驗(yàn)。但是由于我國(guó)對(duì)中藥的生產(chǎn)加工過(guò)程缺乏監(jiān)管力度，也沒(méi)有與國(guó)際接軌的控制內(nèi)在質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，因此中藥的國(guó)際競(jìng)爭(zhēng)力遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于人們的預(yù)期，尤其是近幾年來(lái)，中藥中的有害物質(zhì)問(wèn)題日益突出，嚴(yán)重制約了中藥的出口。中藥中存在的有害物質(zhì)主要有重金屬、真菌毒素、農(nóng)藥殘留等，其中真菌毒素對(duì)人體危害最大。藥用植物采集后不及時(shí)干燥、貯存不當(dāng)或在制備與加工過(guò)程中處理不善，均可能被各種真菌污染并產(chǎn)生真菌毒素，污染最多的為黃曲霉毒素[1-5]。Roy 等[6]對(duì)印度甘草、胡椒、黃葵等藥用植物調(diào)查發(fā)現(xiàn)，15 個(gè)樣品中分離出13 種霉菌，黃曲霉污染率占46%；14個(gè)樣品檢出黃曲霉毒素為陽(yáng)性。

黃曲霉毒素主要有6種，即B1、B2、G1、G2、M1和M2，其中B1被公認(rèn)是主要的有毒物質(zhì)，主要存在于農(nóng)產(chǎn)品、飼料和中藥等產(chǎn)品中。歐洲藥典（EP6.2）規(guī)定黃曲霉毒素B1≤2 μg/kg，總量≤4 μg/kg；韓國(guó)新的許可標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定甘草、決明子、桃仁、半夏、柏子仁、擯榔子、酸棗仁、志遠(yuǎn)、紅花等9種中藥材中，黃曲霉毒素B1限量為10μg/kg；中國(guó)香港特區(qū)政府衛(wèi)生署公布的中藥材參考標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定黃曲霉毒素B ≤5 μg/kg，總量≤10 μg/kg；我國(guó)的藥用植物及制劑外經(jīng)貿(mào)綠色行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)（綠色中藥標(biāo)準(zhǔn)）中規(guī)定黃曲霉毒素B≤5μg/kg（暫定），2010版中國(guó)藥典規(guī)定了黃曲霉毒素的檢測(cè)方法，但未制定新的限量。

目前，中藥中的真菌毒素檢測(cè)多采用免疫親和柱凈化-液相色譜-熒光檢測(cè)方法[7]，而對(duì)于黃曲霉毒素的檢測(cè)有薄層色譜法（TLC）[8]、酶聯(lián)免疫法（ELISA）[9,10]、高效液相色譜法（HPLC），膠體金免疫層析法[11]等。TLC法雖然簡(jiǎn)單，但靈敏度較低，同時(shí)由于中藥中成分復(fù)雜，干擾較多，分離和確證難度大；ELISA法測(cè)定結(jié)果受試劑盒差異、實(shí)驗(yàn)溫度、儀器靈敏度等條件影響較大，重復(fù)性差，假陽(yáng)性率高，難以達(dá)到相關(guān)技術(shù)要求。Tassaneeyakul等[12]、鄭榮等[13]以及《中國(guó)藥典》均采用了免疫親和柱凈化-液相色譜-柱后衍生法測(cè)定中藥中黃曲霉毒素 B1、B2、G1、G2的含量；Trucksess 等[14]建立了免疫親和柱凈化-液相色譜-熒光檢測(cè)法測(cè)定人參中黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2及赭曲霉毒素的方法；Han等[15]采用固相萃取-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定了中藥中的黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2、M1、M2等真菌毒素，雖然靈敏度較高，但樣品處理較煩瑣，操作復(fù)雜。

本研究針對(duì)現(xiàn)有方法的不足，采用高選擇性的多功能免疫親和柱凈化技術(shù)，建立了液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)檢測(cè)中藥材中6種黃曲霉毒素的方法，旨在簡(jiǎn)化方法，降低成本，提高靈敏度，實(shí)現(xiàn)中藥材中6種黃曲霉毒素的同時(shí)測(cè)定。

2 材料與方法

2.1 材料

2.1.1 試驗(yàn)樣品

枸杞、大青葉、陳皮、黃芪、金銀花、甘草：市售中藥材。

2.1.2 試劑

黃曲霉毒素B1（AFB1)、黃曲霉毒素B2（AFB2）、黃曲霉毒素G1（AFG1）、黃曲霉毒素G2（AFG2）、黃曲霉毒素M1（AFM1）、黃曲霉毒素M2（AFM2）等標(biāo)準(zhǔn)品：純度均為99%，F(xiàn)ermentek公司；甲醇、乙腈：均為色譜純，美國(guó)TEDIA公司；醋酸銨：色譜純，天津光復(fù)精細(xì)化工研究所；氯化鈉、氯化鉀、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉、鹽酸：均為分析純，重慶川東化工集團(tuán)有限公司；含1%吐溫的PBS：美國(guó)Vicam公司，臨用前用超純水稀釋10倍，配成含0.1%吐溫的PBS；AflaTest VICAM免疫親和柱：美國(guó)Vicam公司。

2.1.3 儀器設(shè)備

高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀：API 4000，美國(guó)APPLIED BIOSYSTEMS公司；Slient Crusher M高速均質(zhì)器：Heidolph公司；強(qiáng)力振蕩器SR-2DS：日本TAITEC公司；臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)：3-30K，德國(guó)Sigma公司；AS系列超聲波清洗機(jī)：天津奧特恩斯儀器有限公司；振蕩器：日本YAMA-TO公司；MILLI-Q純水器：美國(guó)Millipore公司。

2.2 方法

2.2.1 溶液配制

（1）PBS配制：稱取0.20 g氯化鉀、0.20 g磷酸二氫鉀、2.92 g磷酸氫二鈉和8.00 g氯化鈉，用900 mL超純水溶解，用鹽酸調(diào)節(jié)pH到7. 4，超純水定容至1000 mL。此PBS溶液現(xiàn)用現(xiàn)配。

（2）真菌毒素儲(chǔ)備液及工作液的配制：用乙腈將適量的各真菌毒素固體標(biāo)準(zhǔn)品溶解并配制成100 mg/L的單標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，于-20℃冰箱中保存，有效期為6個(gè)月。取適量的各單儲(chǔ)備液，用乙腈配制成1.0 mg/L的混合工作液，于-20℃冰箱內(nèi)保存，有效期為1個(gè)月。

2.2.2 樣品前處理

稱取磨碎后的粉末樣品5 g，加入1 g NaCl（精確至0.01 g），置于50 mL無(wú)菌塑料離心管中；準(zhǔn)確加入甲醇水（70：30，v/v）30 mL，21000 r/min高速攪拌2 min，超聲提取15 min，振蕩混勻，7000 r/min離心5 min，用玻璃濾紙過(guò)濾；準(zhǔn)確移取濾液15 mL置50 mL容量瓶中，用去離子水稀釋至刻度，搖勻；量取稀釋液10 mL以3 mL/min的流速全部通過(guò)免疫親和柱，然后用20 mL去離子水清洗親和柱，直至空氣進(jìn)入柱子，棄去廢液。用2 mL甲醇洗脫親和柱，當(dāng)甲醇充滿免疫親和柱時(shí)，停止加壓，靜置孵育 5 min，讓溶液重力滴下，收集全部洗脫液，搖勻，待測(cè)定。

2.2.3 LC-MS/MS測(cè)定條件

2.2.3.1 色譜條件

色譜柱：SHIMADZU SHIM-PACK VP-ODS（150×2 mm內(nèi)徑，5μm）；流動(dòng)相：（A）乙腈和（B）2 mmol/L乙酸銨溶液（含0.1%甲酸）；流速：0.3 mL/min；柱溫：40℃；進(jìn)樣量：10μL；洗脫程序見(jiàn)表1。

表1 LC-MS/MS 進(jìn)樣洗脫程序

2.2.3.2 質(zhì)譜條件

離子源: 電噴霧離子源(ESI)；離子化模式: 正離子模式；掃描方式: 多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)模式；電噴霧電壓（IS）：5500 V；霧化氣壓力（GS1）：70 Psi；氣簾氣壓力（CUR）：30 Psi；輔助氣壓力（GS2）：60 Psi；離子源溫度（TEM）：600℃；駐留時(shí)間：100 ms；6種黃曲霉毒素的定性離子對(duì)、定量離子對(duì)、去簇電壓（DP）、碰撞氣能量（CE）、碰撞室入口電壓（EP）及碰撞室出口電壓（CXP）見(jiàn)表2。6種黃曲霉毒素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（10 μg /L）的選擇離子流色譜圖見(jiàn)圖1。

表2 6種真菌毒素的串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定參數(shù)

圖1 6種黃曲霉毒素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（10μg/L）的選擇離子流色譜圖

3 結(jié)果

3.1 樣品提取條件的優(yōu)化

中藥材基質(zhì)較復(fù)雜，通常采用極性溶液提取真菌毒素，主要有甲醇溶液和乙腈溶液，并且因甲醇毒性較低，故使用甲醇-水作為提取液的報(bào)道較多。此外，中藥材種類繁多，基質(zhì)不一，一些樣品的提取液呈酸性，將影響毒素與免疫親和柱的結(jié)合，導(dǎo)致毒素提取回收率偏低，而NaCl具有一定的調(diào)節(jié)緩沖能力，可改善部分樣品回收率偏低的情況。因此，本研究選擇NaCl和甲醇作為提取溶劑。同時(shí)，振蕩時(shí)間和頻率對(duì)中藥材毒素的提取效果也有較大影響，實(shí)驗(yàn)以大青葉為基質(zhì)，將振蕩提取60min的效果與高速均質(zhì)進(jìn)行比較，振蕩提取60min的回收率在47%-86%，以2.15×1000 r/min高速均質(zhì)提取的回收率在76%-112%，因此實(shí)驗(yàn)選擇用2.15×1000 r/min高速均質(zhì)提取，如果樣品基質(zhì)較復(fù)雜可適當(dāng)提高攪拌速度。不同離心速度（3000 r/min-7000 r/min）離心5min的對(duì)比試驗(yàn)結(jié)果表明，7000 r/min離心5min效果最佳。采用加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)（加標(biāo)水平為4μg/kg）比較了PBS緩沖液、0.1%吐溫PBS、甲醇-水（70：30，v /v）溶液、乙腈-水（80∶20，v /v）溶液、NaCl-甲醇依次提取的提取效果，結(jié)果表明NaCl-甲醇提取效果最佳（見(jiàn)表3）。

表3 3種提取方式下中藥材（大青葉）中真菌毒素的回收率比較

3.2 洗脫條件的選擇

實(shí)驗(yàn)比較了直接用甲醇洗脫和用2 mL甲醇孵育后再進(jìn)行洗脫的洗脫效果，結(jié)果顯示直接采用甲醇洗脫和孵育后再洗脫都能取得滿意的回收率，但直接洗脫需要消耗的甲醇量較大；而孵育后再洗脫，當(dāng)甲醇用量在2 mL時(shí)即可將待測(cè)物全部洗脫，洗脫回收率均能達(dá)到91%以上。因此，實(shí)驗(yàn)采用用2 mL甲醇，靜置孵育 5 min后洗脫。

3.3 方法的線性范圍、檢出限（LOD）與定量限（LOQ）

用10 mmol/L乙酸銨-甲醇(6∶4，v/v)配制系列質(zhì)量濃度的真菌毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液并分別進(jìn)行測(cè)定，以標(biāo)準(zhǔn)溶液中真菌毒素的質(zhì)量濃度（X，μg/L）為橫坐標(biāo)，峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸；以信噪比（S/N）=3確定LOD ，S/N=10確定LOQ。6種黃曲霉毒素的結(jié)果詳見(jiàn)表4。

表4 6種黃曲霉毒素的線性回歸方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)及LOQ和LOD

結(jié)果顯示，本方法的LOD為0.3μg/kg，LOQ為1.0μg/kg。其中，LOQ與葛寶坤等[7]報(bào)道的真菌毒素LOQ一致，但LOD更低。

3.4 方法的回收率與精密度

分別在枸杞、大青葉、陳皮、黃芪中按 1.0 μg/kg、5.0 μg/kg、10.0 μg/kg 3個(gè)水平添加黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)品，平行測(cè)定5份樣品，考察方法的回收率與重現(xiàn)性，結(jié)果見(jiàn)表5。大青葉添加不同濃度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的選擇離子流色譜圖見(jiàn)圖2-圖5。

表5 4種中藥材基質(zhì)中6種黃曲霉毒素的加標(biāo)回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n =5)

圖2 大青葉添加0.3 μg/kg標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的選擇離子流色譜圖

圖3 大青葉添加1.0 μg/kg標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的選擇離子流色譜圖

圖4 大青葉添加5.0 μg/kg標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的選擇離子流色譜圖

圖5 大青葉添加10 μg/kg標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的選擇離子流色譜圖

結(jié)果顯示，6種黃曲霉毒素的回收率為78.9%-100.2%，RSD為4.2%-12.6%，比現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道的回收率高[16,17]。

4 實(shí)際樣品檢測(cè)

應(yīng)用本研究建立的方法對(duì)重慶地區(qū)市售的枸杞、大青葉、陳皮、黃芪、金銀花、甘草等6種中藥材共20個(gè)樣品進(jìn)行測(cè)定，在其中3個(gè)樣品中檢出黃曲霉毒素，但未超出LOQ。

5 結(jié)論

本研究首次采用多功能免疫親和柱，并分別優(yōu)化了提取方式、提取溶劑、儀器檢測(cè)條件等，建立了中藥材中6種黃曲霉毒素的LC-MS/MS檢測(cè)方法，LOD為0.3μg/kg，LOQ為1.0μg/kg，能滿足國(guó)內(nèi)外對(duì)中藥材黃曲霉毒素相關(guān)限量的要求。本方法檢測(cè)速度快，靈敏度高，準(zhǔn)確性好，可為研究中藥材中真菌毒素的污染本底及進(jìn)一步的風(fēng)險(xiǎn)分析，提高中藥材的安全性，打破國(guó)外技術(shù)壁壘，促進(jìn)中藥材出口貿(mào)易提供技術(shù)支持。

［1］楊建伯. 真菌毒素與人類疾病[J]. 中國(guó)地方病學(xué)雜志，2002，21(4)：76-79.

［2］陳麗星. 真菌毒素研究進(jìn)展[J]. 河北工業(yè)科技，2006，23(2)：124-126.

［3］黃莉，張浩，丁偉琴，等. 中藥中真菌毒素污染問(wèn)題[J]. 海峽藥學(xué)，2009，21(6)：97-101.

［4］葛寶坤，趙孔祥. 我國(guó)進(jìn)出口中藥材中的生物毒素及其污染分析[J]. 口岸衛(wèi)生控制，2012，1：56-62.

［5］王文麗，徐暉，陳慧芝，等. 15 種中藥材表面污染真菌的分離與分子鑒定[J]. 中國(guó)中藥雜志，2013，38（12）：1910-1914..

［6］Roy A K, Sinha K K, Chourasia H K. Aflatoxin contamination of somecomm on drug plants [J]. Appl Environ Microbiol，1988，54( 3): 842.

［7］葛寶坤，趙孔祥，王偉，等. 免疫親和柱凈化-液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定中藥材中的14 種真菌毒素[J]. 色譜，2011，29（6）：495-500.

［8］Rizzo I, Vedoya G, Maurutto S, et al. Assessment of toxigenic fungi on Argentinean medicinal herbs[J]. Microbiol Res, 2004, 159(2):113.

［9］[9]柳潔，何碧英，孫俊紅. ELISA和免疫親和柱HPLC方法測(cè)定糧油食品中黃曲霉毒素B1[J]. 現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué)，2005，32(6): 653

［10］計(jì)融，柳楨， 江濤，等. 總黃曲霉毒素ELISA定量檢測(cè)試劑盒研制[J]. 中國(guó)公共衛(wèi)生， 2007，23( 3): 331

［11］曹紀(jì)亮，孔維軍，楊美華，等. 真菌毒素快速檢測(cè)方法研究進(jìn)展[J]. 藥物分析雜志，2013，33( 1):159-164.

［12］Tassaneeyakul W, Razzazi-Fazeli E, Porasuphatana S, et al.Contamination of aflatoxins in herbal medicinal products in Thailand[J]. Mycopathologia，2004，158( 2): 239-244.

［13］鄭榮，毛丹，王少敏，等. 薏苡仁中7 種真菌毒素的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定法[J]. 中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2011，21( 2): 318.

［14］Trucksess M W, Scott P M. Mycotoxins in botanicals and dried fruits:A review[J]. Food Addit Contam Part A: Chem Anal, Control Expo Risk Assess, 2008，25( 2): 181-192.

［15］Han Z, Zheng Y L，Luan L J. An ultra-high-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry method for simultaneous determination of aflatoxins B1, B2, G1, G2, M1, and M2 in traditional Chinese medicines[J]. Anal Chim Acta，2010，664( 2): 165.

［16］譚婧，鄭潤(rùn)生，王文麗，等. 中藥飲片中黃曲霉毒素和玉米赤霉烯酮的液質(zhì)聯(lián)用檢測(cè)分析[J]. 時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2012，23（10）：2469-2472.

［17］馮旭，孔維軍，楊美華，等. 中藥中真菌毒素檢測(cè)方法的最新研究進(jìn)展[J]. 中醫(yī)藥現(xiàn)代化，2012，1（5）：1944-1952.