以oprI為靶基因?qū)崟r(shí)熒光PCR法檢測(cè)化妝品中綠膿桿菌

蘇建暉 蔡 穎 許如蘇 周廣彪 曾梅錦

（汕頭出入境檢驗(yàn)檢疫局 廣東汕頭 515031）

1 前言

綠膿桿菌也稱(chēng)銅綠假單胞菌，在自然界分布廣泛，空氣、水、土壤中均有存在，易引起人皮膚化膿感染，特別是燒傷、燙傷、眼部疾病患者被感染后，常使病情惡化，并可引起敗血癥。因此，日本、歐盟、中國(guó)、美國(guó)等各國(guó)和地區(qū)均把它定為化妝品中的重要檢測(cè)指標(biāo)，規(guī)定在化妝品中不得檢出。

在現(xiàn)行國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)[1]中，化妝品中綠膿桿菌的檢驗(yàn)采用傳統(tǒng)方法，即選擇性增菌、平板分離培養(yǎng)、顯微鏡檢與生化鑒定。由于這種方法所需周期較長(zhǎng)，工作量大，消耗試劑多，操作者需要有較豐富的實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)，并且靈敏度較低，因此，已不能滿足現(xiàn)代快、準(zhǔn)、靈的要求。

PCR技術(shù)在微生物檢測(cè)中已有很多研究報(bào)道[2-5]，也被其他許多國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)或行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)采用[6-8]，本項(xiàng)目對(duì)以oprI為靶基因?qū)崟r(shí)熒光PCR法檢測(cè)化妝品中的綠膿桿菌進(jìn)行了研究，包括增菌液中DNA的提取方法、引物探針的設(shè)計(jì)及篩選、PCR反應(yīng)條件及參數(shù)的優(yōu)化、特異性及標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立以及靈敏度、重復(fù)性、穩(wěn)定性試驗(yàn)等，以期建立更快、更好、更節(jié)約的新檢測(cè)方法或初篩方法，應(yīng)用于化妝品生產(chǎn)企業(yè)對(duì)原材料、半成品、成品的質(zhì)量控制把關(guān)。

2 材料與方法

2.1 材料

2.1.1 試驗(yàn)樣品

粉餅、沐浴露、發(fā)油、睫毛膏、洗發(fā)香波、護(hù)發(fā)素、發(fā)膠、唇彩、眼影、指甲油、口紅、啫喱密、面霜、香水：來(lái)源于汕頭櫻姬化妝品廠、汕頭市深特寶潔實(shí)業(yè)有限公司、汕頭市奇?zhèn)?shí)業(yè)有限公司、汕頭市金奇日化有限公司、汕頭市艾迪絲化妝品有限公司、廣東拉芳日化有限公司等單位。

2.1.2 儀器

Lightcycler480熒光定量PCR儀：瑞士Roche；低溫高速離心機(jī)：12000r/min以上，德國(guó)貝克曼公司；生物安全柜：美國(guó)FORMA；電子天平：精度至0.01g，梅特勒公司；恒溫生化培養(yǎng)箱：上海一恒；FTA卡：美國(guó)Whatman公司；打孔機(jī)：美國(guó)Whatman公司；脈沖均質(zhì)器：英國(guó)PUL100E。

2.1.3 試劑

Takara 2×PCR反應(yīng)液：包括Taq DNA聚合酶、Mg2+、dNTP、TE液，寶生物工程大連有限公司；TE緩沖液：購(gòu)自寶生物工程大連有限公司；超純水：Milli-Q純水器制得；SCDLP液體培養(yǎng)基：北京陸橋技術(shù)有限公司。

2.1.4 試驗(yàn)菌株

15株冷凍干粉標(biāo)準(zhǔn)菌種：購(gòu)自中國(guó)普通微生物菌株保藏中心（CGMCC）、 工業(yè)微生物菌種保藏管理中心（CICC）、中國(guó)醫(yī)學(xué)細(xì)菌保藏管理中心（CMCC ）、美國(guó)菌種保藏中心（ATCC）、廣東省微生物研究所微生物菌種保藏中心（GIM）；21株陽(yáng)性工作菌株：來(lái)自CNAS能力驗(yàn)證、本單位實(shí)驗(yàn)室、汕頭市食品藥品監(jiān)督管理局、汕頭市金奇日化有限公司、汕頭市奇?zhèn)?shí)業(yè)有限公司、汕頭市中心醫(yī)院等單位；51株陰性菌株：來(lái)自中國(guó)菌種保藏中心、廣東省微生物研究所微生物菌種保藏中心等單位。詳見(jiàn)表1、表2、表3。

表2 試驗(yàn)陽(yáng)性菌株的來(lái)源

表3 試驗(yàn)陰性菌株的來(lái)源

2.2 方法

2.2.1 引物和探針的設(shè)計(jì)與合成

從GenBank中找到綠膿桿菌有高度保守性的編碼外膜蛋白(oprI)基因，并以此為目的基因設(shè)計(jì)引物、探針。引物和探針由大連寶生物技術(shù)有限公司合成。

使用時(shí)，引物探針從冷凍冰箱取出后先回溫，需彈擊振勻，離心聚集后使用效果較佳。

2.2.2 樣品制備

參照化妝品衛(wèi)生規(guī)范（2007版）[1]，取樣品10mL（g），其中水溶性樣品加到90mL滅菌生理鹽水中，疏水性樣品加5mL石蠟、10mL吐溫80、75mL滅菌生理鹽水，脈沖均質(zhì)器均質(zhì)15s，制成取1:10樣品稀釋液。

2.2.3 增菌培養(yǎng)

取1:10樣品稀釋液10mL加到90mLSCDLP液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)6h。如有綠膿桿菌生長(zhǎng)，培養(yǎng)液常呈黃綠色或藍(lán)綠色，表面多有一層薄菌膜。

2.2.4 模板DNA提取

取1mL樣品增菌液于1.5mL離心管中，14000r/min離心3min，棄去上清液；加TE緩沖液洗滌沉淀1次，重復(fù)離心，棄去上清液；沉淀加100μL去離子水懸浮，于沸水浴中煮沸10min，冰浴5min，14000r/min離心3min，取上清液為模板。提取DNA時(shí)，由于1.5mL離心管存在內(nèi)外氣壓差，偶爾會(huì)出現(xiàn)沖蓋現(xiàn)象，因此在檢樣在上機(jī)擴(kuò)增前最好先在干熱孵育器上以90℃預(yù)熱后，蓋緊，加貼封口膜，這樣能防止溢出。

取1mL樣品增菌液于1.5mL離心管中，14000r/min離心3min，棄去上清液，加TE緩沖液洗滌沉淀1次，重復(fù)離心，棄去上清液，沉淀加100μL去離子水懸浮，于沸水浴中煮沸10min，冰浴5min，14000r/min離心3min，取上清液為模板。

2.2.5 實(shí)時(shí)熒光PCR試驗(yàn)

反應(yīng)總體積為20μL，其中Takara 2×PCR反應(yīng)液10μL，20μmol/L上下游引物混合液1.0μL，20μmol/L探針0.1μL，模板2.0μL，超純水8.9μL。反應(yīng)參數(shù)為：95℃ 50s，95℃ 5s，60℃ 40s（檢測(cè)熒光信號(hào)），40個(gè)循環(huán)。

熒光信號(hào)采集波長(zhǎng)：Hex(523nm-568nm)。

2.2.6 結(jié)果判定

反應(yīng)結(jié)束后，取出PCR反應(yīng)板。常規(guī)按照默認(rèn)的二階求導(dǎo)法計(jì)算CP值數(shù)值，查看樣品、陽(yáng)性和陰性對(duì)照擴(kuò)增情況。陽(yáng)性對(duì)照CP值＜30，陰性對(duì)照無(wú)CP值，實(shí)驗(yàn)成立，可進(jìn)行實(shí)驗(yàn)樣品的結(jié)果判定：CP值＜35為試驗(yàn)陽(yáng)性；檢測(cè)不到CP值為試驗(yàn)陰性；如CP值≥35，且擴(kuò)增曲線明顯呈對(duì)數(shù)增長(zhǎng)，判為可疑，應(yīng)延長(zhǎng)增菌培養(yǎng)時(shí)間至少2h，甚至培養(yǎng)過(guò)夜后重新試驗(yàn)，若CP值明顯變小，則判為陽(yáng)性，否則判為陰性。

3 結(jié)果與分析

3.1 引物和探針序列

引物和探針的序列見(jiàn)表4。

表4 引物和探針的序列

3.2 DNA提取方法

3.2.1 不同方法比較

本研究采用了兩種D N A提取方法進(jìn)行比較。方法1：參照許如蘇[5]沸騰方法（見(jiàn)2.2.3、2.2.4），將上清液轉(zhuǎn)移至新管備用（不能及時(shí)檢驗(yàn)，則放置于-20 ℃保存）。每20μL PCR反應(yīng)體系中加入2μL模板。方法2：化妝品樣品經(jīng)SCDLP培養(yǎng)后，滴加200μL增菌液于FTA卡片圓圈中，風(fēng)干1h后備用，以直徑0.5mm打孔器在FTA卡片上取1孔加入20μL PCR反應(yīng)體系中。

15株標(biāo)準(zhǔn)菌株、21株參考菌株、51株非綠膿桿菌菌株的檢測(cè)結(jié)果顯示兩種方法在特異性方面沒(méi)有明顯區(qū)別，均為100%。但卡片法在靈敏度上比沸騰法低一個(gè)量級(jí)，因?yàn)樵诘渭尤隨CDLP增菌液時(shí)，是以若干個(gè)點(diǎn)為中心進(jìn)行擴(kuò)散，菌濃度在卡片上的分布不甚均勻，故在低濃度時(shí)效果欠佳，不易檢出，而且FAT卡片法成本相對(duì)高，所以本研究采用沸騰法。靈敏度試驗(yàn)結(jié)果詳見(jiàn)表6。

3.2.2 洗滌步驟比較

對(duì)沸騰法提取DNA是否一定要經(jīng)過(guò)兩次洗滌離心步驟進(jìn)行了比較。比較對(duì)象為添加大約2000CFU/mL綠膿桿菌的各種化妝品SCDLP培養(yǎng)基，分經(jīng)洗滌與不經(jīng)洗滌進(jìn)行測(cè)定，其余步驟均相同。

結(jié)果顯示，不經(jīng)洗滌的樣品，除發(fā)膠外，其余如潤(rùn)膚露、洗發(fā)水、淋浴露、粉餅、眼影等一般化妝品，提取效果良好，說(shuō)明可不經(jīng)離心洗滌，直接沸騰10min，冰冷后離心取上清液測(cè)定。采用這種方式具有：①減少污染環(huán)境，更加符合生物安全操作；②實(shí)驗(yàn)證明由于減少了洗滌步驟，從而可以減少DNA損失；③減少操作步驟，能提高工作效率。但未經(jīng)洗滌，個(gè)別樣品的擴(kuò)增曲線較平，波形欠佳。此外，發(fā)膠可能含有抑制熒光的物質(zhì)，故檢測(cè)不出綠膿桿菌。而經(jīng)過(guò)洗滌的測(cè)試樣品均可檢出綠膿桿菌，但CP值稍大些。具體結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 樣品前處理經(jīng)TE液洗滌效果比較

綜合考慮，所有化妝品統(tǒng)一采用經(jīng)過(guò)洗滌的步驟，雖然降低一點(diǎn)靈敏度，但在準(zhǔn)確度與擴(kuò)增曲線線形上能取得較好效果。

3.3 儀器條件的優(yōu)化

反應(yīng)退火溫度為60℃時(shí)，靈敏度較高，但一些非綠膿桿菌的假單胞菌，如惡臭假單胞菌、親水假單胞菌、洋蔥假單胞菌等的CP值在33-35之間，易造成可疑性干擾；而退火溫度為59℃時(shí)，既有較高的靈敏度，非綠膿桿菌的假單胞菌CP值均>35，不會(huì)干擾目標(biāo)菌檢測(cè)。

儀器檢測(cè)器采用523-568nm（Hex）通道采集熒光信號(hào)。

3.4 特異性試驗(yàn)

以表1-表3的87株標(biāo)準(zhǔn)和參考菌株提取的DNA為模板，對(duì)綠膿桿菌進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR試驗(yàn)，同時(shí)檢測(cè)10份污染大量雜菌（無(wú)綠膿桿菌）的樣品，以驗(yàn)證本方法對(duì)綠膿桿菌和自然界其他微生物的特異性。

試驗(yàn)結(jié)果顯示，只有相對(duì)應(yīng)的菌株出現(xiàn)陽(yáng)性反應(yīng)，其他非對(duì)應(yīng)菌株和污染雜菌的樣品全部均為陰性反應(yīng)，說(shuō)明針對(duì)綠膿桿菌建立的實(shí)時(shí)熒光PCR方法具有高度特異性。

陰性反應(yīng)中的惡臭假單胞菌、洋蔥假單胞菌、親水假單胞菌等均有擴(kuò)增，但CP值處于≥35、<40之間，延長(zhǎng)增菌培養(yǎng)時(shí)間至16h后重新試驗(yàn)，CP值無(wú)明顯變小，仍處于≥35、<40之間;陰性反應(yīng)中金黃色葡萄球菌、大腸埃希氏菌、黑曲霉、白色念珠球菌等檢測(cè)不到CP值。陽(yáng)性反應(yīng)的CP值均＜30；當(dāng)綠膿桿菌菌濃度＜1CFU/反應(yīng)體系時(shí)，CP值有時(shí)會(huì)處于≥35、<40之間，但延長(zhǎng)增菌培養(yǎng)時(shí)間至16h后重新試驗(yàn)，CP值明顯變小至＜30。

3.5 靈敏度試驗(yàn)

綠膿桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株經(jīng)營(yíng)養(yǎng)肉湯復(fù)壯、十六烷甲基溴化銨培養(yǎng)基分純培養(yǎng)后，劃血平板，以接種環(huán)挑取新鮮菌苔若干環(huán)配成一定麥?zhǔn)隙鹊木鷳乙海蝗?.0mL該菌液加入90mLSCDLP液中，再添加1.0g模擬潤(rùn)膚露作化妝品本底后，振蕩均勻；將該SCDLP液依次進(jìn)行10倍稀釋?zhuān)涑?0-1-10-9濃度的系列標(biāo)準(zhǔn)菌株稀釋樣液；各取1.0mL該系列標(biāo)準(zhǔn)菌株稀釋樣液，以營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板培養(yǎng)，計(jì)數(shù)菌含量，同時(shí)按化妝品中實(shí)時(shí)熒光PCR方法對(duì)該系列標(biāo)準(zhǔn)菌株稀釋樣液提取DNA后測(cè)定綠膿桿菌，結(jié)果見(jiàn)表6。

表6 靈敏度試驗(yàn)結(jié)果

結(jié)果顯示，沸騰法實(shí)時(shí)熒光PCR試驗(yàn)的靈敏度均能達(dá)到低于2CFU/反應(yīng)體系，非常靈敏。

3.6 線性關(guān)系

按照與3.5同樣的步驟進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)圖1、圖2。

圖1 引物1綠膿桿菌靈敏度擴(kuò)增曲線

圖2 引物1綠膿桿菌標(biāo)準(zhǔn)曲線

結(jié)果顯示，當(dāng)綠膿桿菌濃度處于103-107CFU/mL，初始菌濃度對(duì)數(shù)值與CP值呈良好的線性關(guān)系。

3.7 重復(fù)性試驗(yàn)

配制含綠膿桿菌高、中、低不同菌濃度的模擬潤(rùn)膚露SCDLP培養(yǎng)液，每個(gè)濃度各測(cè)定5次，計(jì)算變異系數(shù)，結(jié)果見(jiàn)表7、圖3。

表7 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

圖3 重復(fù)試驗(yàn)擴(kuò)增曲線

結(jié)果顯示，其批內(nèi)CP值的變異系數(shù)小于2%?？梢?jiàn)該實(shí)時(shí)熒光PCR方法具有良好的可重復(fù)性，滿足實(shí)驗(yàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)要求。

3.8 熒光PCR試劑的穩(wěn)定性檢測(cè)結(jié)果

試劑組成如下：TE緩沖液、Takara 2×PCR反應(yīng)液、引物探針?lè)磻?yīng)液1套、陽(yáng)性對(duì)照模板、陰性對(duì)照模板、去離子水。

穩(wěn)定性檢測(cè)已進(jìn)行12次，延續(xù)12個(gè)月，檢測(cè)結(jié)果仍保持穩(wěn)定。因此，試劑組成的有效期至少12個(gè)月。

3.9 與GB方法的比較

綠膿桿菌實(shí)時(shí)熒光PCR方法與GB標(biāo)準(zhǔn)傳統(tǒng)方法比較，方法特異性吻合率達(dá)100%，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

當(dāng)染菌量>50CFU/g時(shí)，實(shí)時(shí)熒光PCR方法的檢測(cè)結(jié)果與GB標(biāo)準(zhǔn)傳統(tǒng)方法檢測(cè)結(jié)果一致，但檢測(cè)速度快10倍以上；當(dāng)染菌量<50CFU/g時(shí)，兩者的檢測(cè)結(jié)果出現(xiàn)波動(dòng)，即有的樣品為陽(yáng)性，有的樣品為陰性，且不完全一致，但實(shí)時(shí)熒光PCR方法的檢出率較GB標(biāo)準(zhǔn)傳統(tǒng)方法稍高，原因是實(shí)時(shí)熒光PCR方法的提取DNA后有一個(gè)濃縮10倍的操作，如果進(jìn)一步縮小定容體積，擴(kuò)大濃縮倍數(shù)，也可以再提高檢出限附近的陽(yáng)性率。

4 結(jié)論

（1）以oprI為靶基因的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)化妝品中綠膿桿菌的方法，具有準(zhǔn)確、靈敏、快速、操作簡(jiǎn)便與高通量檢測(cè)等特點(diǎn)，可在食藥局、技監(jiān)局、檢驗(yàn)檢疫局、化妝品企業(yè)中推廣應(yīng)用。

（2）由于化妝品中綠膿桿菌檢測(cè)尚無(wú)有關(guān)PCR技術(shù)的標(biāo)準(zhǔn)方法，因此建議將此方法上升為標(biāo)準(zhǔn)方法。

（3）據(jù)查ATCC綠膿桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株有近300株，由于資金不足等條件限制，本研究只對(duì)現(xiàn)有的15株標(biāo)準(zhǔn)菌株與21株陽(yáng)性工作菌株進(jìn)行了試驗(yàn)，效果均滿意，但未能進(jìn)行更多試驗(yàn)，因此普遍性適用研究還有待更深入的驗(yàn)證。

［1］化妝品衛(wèi)生規(guī)范（2007版）[S].

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