全柱成像毛細(xì)管等電聚焦電泳測(cè)定艾塞那肽等電點(diǎn)

劉潔欣，方均建，王心正，李海靜，程建華，吳勝明，董方霆

國(guó)家生物醫(yī)學(xué)分析中心，北京 100850

艾塞那肽是一種人工合成的含有39個(gè)氨基酸殘基的新型糖尿病治療藥物，為胰高血糖素樣肽-1類似物，對(duì)2型糖尿病患者的血糖有控制作用，能夠促進(jìn)胰腺β細(xì)胞增殖和胰島素的分泌，抑制胰高血糖素的分泌及減緩胃排空[1]。美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局于2005年批準(zhǔn)其上市，是近年來首個(gè)在全球范圍內(nèi)獲批的新型治療2型糖尿病的藥物。等電點(diǎn)是多肽和蛋白質(zhì)類藥物質(zhì)量控制的重要指征，它可以反映生物技術(shù)合成的多肽、蛋白質(zhì)類藥物的純度和空間構(gòu)象的均一性，以及生產(chǎn)過程中的可靠性，缺失肽、斷裂肽、酰胺化/去酰胺化、氨基酸側(cè)鏈的不完全脫保護(hù)[2]、多糖唾液酸化[3]等一些修飾都會(huì)改變樣品的等電點(diǎn)，影響藥物的生物活性。因此，等電點(diǎn)的準(zhǔn)確測(cè)定對(duì)于多肽、蛋白類藥物的質(zhì)量控制和新藥研發(fā)起著重要作用。

新一代的全柱成像毛細(xì)管等電聚焦電泳技術(shù)（capillary isoelectric focusing-whole column imag?ing detection，CIEF-WCID）[4-5]成功地解決了這一問題，這是一種將毛細(xì)管等電聚焦電泳與全柱成像技術(shù)相結(jié)合的新型電泳系統(tǒng)。當(dāng)樣品進(jìn)行等電聚焦時(shí)，互補(bǔ)性金屬氧化物半導(dǎo)體（complementary met?al-oxide-semiconductor translator，CMOS）作為成像檢測(cè)技術(shù)，可以對(duì)整個(gè)聚焦分離通道、聚焦過程進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)控和記錄，這個(gè)過程中不移動(dòng)毛細(xì)管柱，也無須移動(dòng)樣品。該方法使得分析結(jié)果不受干擾，提高了樣品等電點(diǎn)測(cè)定的準(zhǔn)確度和重復(fù)性。并且通常能在幾分鐘內(nèi)完成分析測(cè)定，所需時(shí)間大大縮短，可實(shí)現(xiàn)高通量檢測(cè)。另外，CIEF-WCID在復(fù)雜樣品等電點(diǎn)測(cè)定[6]、蛋白質(zhì)純度分析、蛋白質(zhì)藥物質(zhì)量控制、蛋白質(zhì)穩(wěn)定性研究[7]、相對(duì)分子質(zhì)量測(cè)定[8]、藥物與蛋白質(zhì)相互作用[9]等多個(gè)研究領(lǐng)域也有著重要的應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 材料

艾塞那肽為國(guó)內(nèi)公司生產(chǎn)；多肽（pI 6.60、7.40、8.50）、線性固相pH梯度膠條pI 3-10L購(gòu)自BIORAD公司；載體兩性電解質(zhì)3-10、陽(yáng)極電解液（0.1 mol/L H3PO4）、陰極電解液（0.1 mol/L NaOH）和marker（pI 4.65、5.91、6.14、6.61、7.05、7.40、7.90、8.18、9.22）均由 Advanced Electrophoresis Solutions公司提供；CEInfinite全柱成像毛細(xì)管等電聚焦電泳儀購(gòu)自Advanced Electrophoresis Solutions公司；PROTEAN IEF Cell等電聚焦電泳儀購(gòu)自BIO-RAD公司；Centrifuge 5415D離心機(jī)購(gòu)自Eppordorf公司；實(shí)驗(yàn)用水均為Milli-Q（Millipore公司）系統(tǒng)制備。

1.2 待測(cè)樣品

將艾塞那肽樣品配制成濃度為0.125 mg/mL的溶液，取100 μL該溶液與100 μL載體兩性電解質(zhì)混合，加入marker（pI 4.65、6.14）各2 μL，充分混勻，13 200 r/min離心1 min后取上清進(jìn)樣3次。

1.3 CIEF-WCID電泳

全柱成像毛細(xì)管等電聚焦電泳儀中的毛細(xì)管柱一端連接自動(dòng)進(jìn)樣器，另一端接入廢液瓶中。當(dāng)陰陽(yáng)極電解液兩端通入高壓直流電后，載體兩性電解質(zhì)在毛細(xì)管柱內(nèi)形成pH梯度，樣品在50 mm的分離通道內(nèi)根據(jù)所帶電性向陽(yáng)極或陰極移動(dòng)，當(dāng)樣品移動(dòng)到與其等電點(diǎn)相同的pH值時(shí)，該樣品凈電荷為零，即完成等電聚焦分離。

實(shí)驗(yàn)中采用自動(dòng)進(jìn)樣器進(jìn)樣，上樣量50 μL。等電聚焦過程設(shè)置為首先1000 V電壓聚焦1 min，然后2000 V聚焦1 min，最后3000 V聚焦4 min。在聚焦過程中采用采用CMOS成像技術(shù)對(duì)毛細(xì)管柱進(jìn)行全程動(dòng)態(tài)成像檢測(cè)，檢測(cè)信號(hào)為紫外吸收強(qiáng)度。

1.4 凝膠等電聚焦電泳

在30 μg艾塞那肽樣品中加入1.75 μL IPG緩沖液和348 μL重泡脹液，振蕩混勻，離心后上樣。等電聚焦過程為重泡脹1 h、30 V 10 h、500 V 30 min、2000 V 30 min、5000 V 30 min、8000 V 1 h、10 000 V 4 h，最后用考馬斯亮藍(lán)R250染色，50%甲醇脫色至條帶清晰。

1.5 方法驗(yàn)證

1.5.1 準(zhǔn)確性驗(yàn)證 采用BIO-RAD公司已知等電點(diǎn)的多肽驗(yàn)證檢測(cè)方法的準(zhǔn)確性。將已知等電點(diǎn)多肽（pI 6.60、7.40、8.50）分別稀釋至1/25，取多肽樣品各 22 μL、載體兩性電解質(zhì)300 μL，分別加入適宜marker各3 μL，充分混勻，13 200 r/min離心1 min后取上清進(jìn)樣。

1.5.2 重復(fù)性驗(yàn)證 將marker（pI 4.65、6.14、7.40）各4 μl加入400 μL載體兩性電解質(zhì)中，充分混勻，13 200 r/min離心1 min，取上清連續(xù)進(jìn)樣6次。

2 結(jié)果

2.1 準(zhǔn)確性驗(yàn)證

將BIO-RAD公司已知多肽（pI 6.60、7.40、8.50）作為未知樣品進(jìn)行等電點(diǎn)的測(cè)定，圖1為多肽（pI 6.60）等電聚焦電泳圖，根據(jù)聚焦完成時(shí)等電點(diǎn)到兩端marker的距離計(jì)算得到等電點(diǎn)為6.73，對(duì)參考值相對(duì)誤差為1.97%。其他多肽等電點(diǎn)測(cè)定結(jié)果見表1，相對(duì)誤差在2.5%以內(nèi)，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于0.08%。以上結(jié)果表明該方法準(zhǔn)確性良好，能夠用于對(duì)未知樣品的等電點(diǎn)測(cè)定。

2.2 重復(fù)性驗(yàn)證

對(duì)系統(tǒng)重復(fù)性進(jìn)行了考察。圖2為marker（pI 4.65、6.14、7.40）與兩性電解質(zhì)的混合溶液連續(xù)進(jìn)樣6次的等電聚焦電泳圖，marker峰形和峰位無明顯變化，峰位相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于0.5%。重復(fù)性良好，表明該方法能夠滿足實(shí)驗(yàn)要求。

2.3 艾塞那肽等電點(diǎn)測(cè)定

圖1 CIEF-WCID測(cè)定多肽（pI 6.60）電泳圖（marker pI 5.91、7.05）

表1 CIEF-WCID測(cè)定3種多肽的等電點(diǎn)結(jié)果

CIEF-WCID因采用全柱成像技術(shù)，能夠?qū)崟r(shí)記錄樣品動(dòng)態(tài)聚焦過程。圖3為艾塞那肽的等電聚焦過程。在未聚焦時(shí)，樣品均勻分布在毛細(xì)管中，開始聚焦后，樣品由陽(yáng)極和陰極向等電點(diǎn)處移動(dòng)，到360 s時(shí)譜圖不再改變，表明樣品聚焦完全。實(shí)時(shí)全柱成像技術(shù)不僅可以顯示蛋白質(zhì)等電聚焦過程，而且可以及時(shí)反映聚焦是否完成，以避免聚焦時(shí)間過長(zhǎng)引起蛋白質(zhì)沉淀。

采用CIEF-WCID對(duì)艾塞那肽的等電點(diǎn)進(jìn)行測(cè)定時(shí)，所用marker的pI為4.65和6.14，連續(xù)進(jìn)樣3次，結(jié)果如圖4所示，分別測(cè)得艾塞那肽等電點(diǎn)為5.46、5.45和5.46，平均值為5.46，變異系數(shù)為0.11%，檢測(cè)所需時(shí)間僅為6 min。另外，還采用凝膠等電聚焦電泳測(cè)定了艾塞那肽的等電點(diǎn)，結(jié)果如圖5，電泳測(cè)得的艾塞那肽的等電點(diǎn)為5.40，所需時(shí)間為18 h，是CIEF-WCID方法的近200倍。結(jié)果表明，CIEF-WCID測(cè)定等電點(diǎn)的方法準(zhǔn)確度和重復(fù)性均良好，而且相比凝膠等電聚焦電泳能大大縮短檢測(cè)時(shí)間。

圖2 marker（pI 4.65、6.14、7.40）連續(xù)進(jìn)樣6次CIEF-WCID電泳圖

圖3 CIEF-WCID測(cè)定艾塞那肽等電點(diǎn)的動(dòng)態(tài)聚焦過程聚焦時(shí)間分別為40、60、360 s

3 討論

CIEF-WCID是在毛細(xì)管等電聚焦電泳的基礎(chǔ)上，采用全柱成像技術(shù)，聚焦和檢測(cè)過程不移動(dòng)毛細(xì)管柱即可實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品的檢測(cè)，通過實(shí)時(shí)記錄動(dòng)態(tài)聚焦過程，確定最佳聚焦時(shí)間，使得檢測(cè)結(jié)果更加真實(shí)可靠，且檢測(cè)時(shí)間大幅度縮短。凝膠電泳與CIEFWCID相比，存在分析時(shí)間長(zhǎng)、自動(dòng)化程度低的問題；而傳統(tǒng)的毛細(xì)管等電聚焦電泳雖然能克服這些不足，縮短檢測(cè)時(shí)間，但由于檢測(cè)器為單點(diǎn)檢測(cè)器，聚焦完成后需要移動(dòng)樣品通過檢測(cè)窗口，因此在移動(dòng)的過程中可能會(huì)造成pH梯度改變、分辨率下降、蛋白質(zhì)沉淀，從而影響分析測(cè)試結(jié)果[10]。本實(shí)驗(yàn)對(duì)CIEF-WCID方法的準(zhǔn)確性進(jìn)行了考察，對(duì)不同等電點(diǎn)的樣品均能準(zhǔn)確測(cè)定；在重復(fù)實(shí)驗(yàn)中，marker峰形和峰位基本無明顯變化。這表明該技術(shù)準(zhǔn)確度、重復(fù)性良好，能夠應(yīng)用于樣品等電點(diǎn)的測(cè)定。對(duì)于艾塞那肽等電點(diǎn)的測(cè)定，CIEF-WCID與凝膠等電聚焦電泳結(jié)果之間無明顯差別，但CIEF-WCID方法自動(dòng)化程度高，可自動(dòng)進(jìn)樣，對(duì)于聚焦過程可以實(shí)時(shí)記錄，聚焦時(shí)間上也縮短至幾十分之一，而且無需染色、脫色等步驟，比凝膠等電聚焦電泳方法更加方便快捷。綜上所述，應(yīng)用CIEF-WCID可以很好地對(duì)艾塞那肽等電點(diǎn)進(jìn)行分析，所需時(shí)間短，準(zhǔn)確性和重復(fù)性良好，相比于其他電泳技術(shù)具有高通量的優(yōu)勢(shì)，這將為多肽的質(zhì)量控制提供一種更為高效的方法。

圖4 連續(xù)3次CIEF-WCID測(cè)定艾塞那肽等電點(diǎn)結(jié)果

圖5 凝膠電泳測(cè)定艾塞那肽等電點(diǎn)

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