生物節(jié)律基因Timeless的生物學(xué)功能研究進(jìn)展

宋何煜，張耀，江紅

北京交通大學(xué) 理學(xué)院生命科學(xué)與生物工程研究院，北京 100044

生物節(jié)律是生物體普遍存在的生命現(xiàn)象，參與多種生命活動(dòng)的調(diào)控。目前在哺乳動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)有10種節(jié)律基因，分別是Per1、Per2、Per3、Cry1、Cry2、Clock、Bmal1、Timeless、NPAS2和CK1ε。生物節(jié)律是由幾種核心節(jié)律基因通過(guò)轉(zhuǎn)錄-翻譯反饋環(huán)控制和維持的，反饋環(huán)由正激活因子（Clock和Bmal1）、負(fù)效應(yīng)因子（Per1、Per2、Per3、Cry1、Cry2和Timeless）和調(diào)節(jié)因子（CK1ε）組成[1]。Timeless是生物節(jié)律和細(xì)胞周期的直接連接者，同時(shí)參與ATR-Chk1和ATMChk2兩大DNA損傷修復(fù)通路[2]，在肺和腎的胚胎發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮重要作用[3]。并且，在多種癌組織中檢測(cè)到Timeless表達(dá)水平與癌旁非癌組織相比明顯不同[4-10]，提示它可能和癌癥的發(fā)生和預(yù)后密切相關(guān)。我們簡(jiǎn)要總結(jié)了Timeless在生物節(jié)律、細(xì)胞周期、胚胎發(fā)育、癌癥發(fā)生發(fā)展和診療中的生物學(xué)功能研究進(jìn)展。

1 Timeless基因的結(jié)構(gòu)

Timeless是Michael等在篩選影響果蠅生物節(jié)律的突變體時(shí)發(fā)現(xiàn)的，位于果蠅第2多線(xiàn)染色體的左臂，dpp和dp基因之間[11]。不同物種中都有Timeless同源基因的存在（表1）。人類(lèi)的Timeless基因位于第12號(hào)染色體，全基因長(zhǎng)約43 kb，編碼由1208個(gè)氨基酸殘基組成的蛋白TIMELESS，該蛋白在細(xì)胞質(zhì)中形成后，與PER家族成員形成二聚體入核[12]。

表1 不同生物Timeless基因的信息

2 Timeless在生物節(jié)律中的功能

生物節(jié)律是生物的一種生理和行為的周期性振蕩[19]，大部分生物的節(jié)律周期為24 h；在不同物種的生物節(jié)律活動(dòng)中，Timeless的作用各不相同。

在果蠅中，當(dāng)CLOCK-CYCLE二聚體激活Per和Timeless的表達(dá)時(shí)，新的節(jié)律周期開(kāi)始。在黑暗條件下，PER-TIMELESS二聚體入核后，抑制CLOCKCYCLE的活性，降低其表達(dá)水平，從而終止節(jié)律周期[20]。光照可以激活光受體CRY，它和Timeless結(jié)合后引起TIMELESS的泛素化降解，節(jié)律周期發(fā)生轉(zhuǎn)換[21]。蛋白激酶CK2可以對(duì)TIMELESS進(jìn)行磷酸化修飾，增加細(xì)胞質(zhì)中Timeless的表達(dá)水平，從而縮短節(jié)律周期[21]。在小鼠視交叉上核，下調(diào)Timeless表達(dá)水平會(huì)使Per1、Per2和Per3表達(dá)水平降低，而Cry1和Cry2表達(dá)水平升高[22]，Per1和Per2表達(dá)水平降低可使節(jié)律周期的振幅降低[23]，Cry是Per的負(fù)調(diào)控因子，缺失Cry1和Cry2的小鼠會(huì)出現(xiàn)節(jié)律紊亂[24]。細(xì)胞周期激酶CHEK1可以和Timeless及CK2發(fā)生相互作用，CHEK1表達(dá)水平降低可使小鼠的節(jié)律周期至少縮短1 h[25]，而下調(diào)DNA解旋酶結(jié)合蛋白CDH4的表達(dá)水平可以延長(zhǎng)節(jié)律周期。

3 Timeless在細(xì)胞周期中的功能

細(xì)胞周期的順利進(jìn)行依賴(lài)于細(xì)胞周期檢測(cè)點(diǎn)機(jī)制的存在，其中的DNA損傷檢測(cè)點(diǎn)能夠延遲和阻止細(xì)胞分裂，主要有ATM（ataxia telangiectasia mutat?ed）依賴(lài)的 Chk2和 ATR（ataxia telangiectasia and Rad3-related）依賴(lài)的Chk1等2條DNA損傷信號(hào)通路[2]。出芽酵母Tof1基因和裂殖酵母Swi1基因可以激活DNA損傷檢測(cè)點(diǎn)，同時(shí)，Swi1可以阻止復(fù)制叉解體[19]。Tim-1是線(xiàn)蟲(chóng)染色體凝聚的必需因子，在DNA復(fù)制中扮演著重要的角色，它的缺失會(huì)引起線(xiàn)蟲(chóng)胚胎死亡?；趯?duì)線(xiàn)蟲(chóng)、果蠅和小鼠的TIMELESS同源物的比較，Barbara等[26]認(rèn)為T(mén)IMELESS樣蛋白保守的功能不僅僅是生物節(jié)律調(diào)節(jié)，同時(shí)調(diào)控染色體的凝聚。在小鼠和人類(lèi)細(xì)胞中，Timeless和復(fù)制叉共同移動(dòng)，它是復(fù)制子復(fù)合體的成員之一，它和Tip?in的相互作用可以穩(wěn)定復(fù)制叉和促進(jìn)姊妹染色單體凝聚[27]。Timeless或一些蛋白（如Hus1、claspin、Chk1和Tipin）的失活可以逆轉(zhuǎn)紫外線(xiàn)（UV）對(duì)DNA合成的抑制作用[28]。當(dāng)DNA損傷發(fā)生時(shí)，Tim-Tipin復(fù)合體啟動(dòng)UV介導(dǎo)的S期細(xì)胞周期檢測(cè)點(diǎn)，下調(diào)Time?less會(huì)抑制S期細(xì)胞周期檢測(cè)點(diǎn)的激活，這些正好說(shuō)明在小鼠Timeless缺失會(huì)引起胚胎致死現(xiàn)象[29]。雖然端粒長(zhǎng)度的維護(hù)依賴(lài)于端粒酶，但Timeless和Shelterin家族成員TRF1和TRF2相互作用，在端粒的DNA重復(fù)區(qū)域阻止復(fù)制叉降解，促進(jìn)DNA復(fù)制，進(jìn)而維護(hù)端粒長(zhǎng)度，保證染色體完整性的維持[30]。

當(dāng)DNA復(fù)制被UV或羥基脲（HU）干擾后，抑制ATR-Chk1通路中蛋白的表達(dá)，促進(jìn)早熟染色質(zhì)凝聚（prematurechromosomecondensation，PCC）[19]。小鼠[31]和人類(lèi)[2]的Timeless和Chk1相互作用，介導(dǎo)復(fù)制檢測(cè)點(diǎn)信號(hào)從ATR向Chk1傳遞，而Timeless的缺失也會(huì)引起PCC，提示Timeless參與了ATR-Chk1依賴(lài)的復(fù)制檢測(cè)點(diǎn)調(diào)控。阿霉素（doxorubicin，Dox）是一種治療癌癥的常用藥物，能夠激活A(yù)TM-Chk2反應(yīng)通路，使細(xì)胞周期阻滯在G2/M期。人類(lèi)Time?less不能激活A(yù)TM，但能激活A(yù)TM依賴(lài)的Chk2，下調(diào)Timeless使腫瘤細(xì)胞對(duì)Dox的細(xì)胞毒性更敏感[2]，提示降低Timeless表達(dá)水平的藥物可以作為提高Dox抗瘤效果的增敏劑。

4 Timeless在小鼠組織胚胎的發(fā)育中的作用

Timeless對(duì)小鼠胚胎發(fā)育至關(guān)重要，它在器官發(fā)生的初期廣泛表達(dá)于大腦、肺、心臟、肝、胃和尿生殖嵴等[3]，如果缺失可導(dǎo)致胚胎死亡率升高[32]。在胚胎的肺、肝、腎及神經(jīng)上皮的發(fā)育過(guò)程中，Timeless表達(dá)水平較高，對(duì)上皮形成具有重要作用[33]。在9.5 d的胚胎，肺開(kāi)始形成，Timeless存在于上皮細(xì)胞和間充質(zhì)細(xì)胞中；在15 d胚胎的呼吸道上皮中Timeless仍維持較高的表達(dá)水平，但在間充質(zhì)中的表達(dá)水平降低。Northern印跡結(jié)果也提示與18 d的小鼠胚胎和成體小鼠相比，Timeless在15 d的小鼠胚胎中表達(dá)水平最高。在肺發(fā)育過(guò)程中，Timeless表達(dá)水平的動(dòng)態(tài)變化對(duì)肺的發(fā)育是至關(guān)重要的[3]。

在分支形成的器官中，Timeless基因的功能高度保守[3]。在腎發(fā)育過(guò)程中，輸尿管芽分支形成時(shí)，Timeless是一種分化表達(dá)序列，在胚胎中的表達(dá)方式與其在成體中的表達(dá)不同。Timeless表達(dá)水平降低會(huì)抑制腎的胚胎發(fā)育，提示在腎發(fā)生和其他上皮器官形成中有重要作用[33]。

5 Timeless在腫瘤發(fā)生、發(fā)展和診療中作用的研究進(jìn)展

5.1 腫瘤的發(fā)生和發(fā)展

惡性腫瘤的形成是一個(gè)涉及多因素多步驟的復(fù)雜過(guò)程。多項(xiàng)研究表明，大鼠和人類(lèi)腫瘤可能是一種節(jié)律失調(diào)相關(guān)疾病。已經(jīng)在多種腫瘤（如乳腺癌、卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌、前列腺癌和血液系統(tǒng)腫瘤等）中發(fā)現(xiàn)生物節(jié)律分子的遺傳或功能性異常，這種異常的表現(xiàn)可能與癌癥或其他疾病的發(fā)生有重要的相關(guān)性。與對(duì)應(yīng)的癌旁非癌組織相比，Timeless在不同癌組織中的表達(dá)水平明顯不同。Timeless在肺癌中mRNA和蛋白表達(dá)水平[7]以及結(jié)直腸癌中的mRNA表達(dá)水平[9]均升高，而腎癌和胰腺癌中mRNA表達(dá)水平降低，肝癌中的mRNA和蛋白水平表達(dá)也同樣下降[4,6,10]（表2）。不同文獻(xiàn)對(duì)乳腺癌中Timeless表達(dá)水平的報(bào)道不一致，Yong等的研究提示乳腺癌組織中Timeless的mRNA表達(dá)水平升高[8]，而Jan-Gowth等則認(rèn)為乳腺癌組織中Timeless蛋白表達(dá)水平降低[5]，結(jié)果不一致的原因可能與樣品來(lái)源和檢測(cè)方法不同有關(guān)，同時(shí)基因的表達(dá)受不同水平的諸多因素調(diào)控。

Timeless在癌組織和癌旁非癌組織中的差異表達(dá)和腫瘤的預(yù)后具有相關(guān)性。肝癌中Timeless表達(dá)水平的降低和腫瘤的分級(jí)相關(guān)[4]。肺癌中Timeless高表達(dá)的患者整體生存時(shí)間明顯縮短，但與腫瘤分期和組織學(xué)分型無(wú)關(guān)，Yoshida認(rèn)為T(mén)imeless可以作為肺癌診斷和預(yù)后的標(biāo)記物，對(duì)肺癌的治療效果有提示價(jià)值[7]。在結(jié)直腸癌中Timeless的mRNA表達(dá)水平和TNM分期關(guān)聯(lián)密切，在TNM的Ⅲ～Ⅳ階段，Time?less的mRNA表達(dá)水平達(dá)到最高，這種升高可能和結(jié)直腸癌的發(fā)生有關(guān)，也可能與對(duì)輔助化療反應(yīng)的減弱有關(guān)[9]。Yong等在80例乳腺癌組織和80例癌旁非癌組織中發(fā)現(xiàn)Timless啟動(dòng)子發(fā)生甲基化，并且甲基化程度在乳腺癌的Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期顯著降低，這和Timeless在乳腺癌組織中高表達(dá)是一致的[8]；而Jan-Gowth等在乳腺癌組織中未發(fā)現(xiàn)Timeless的啟動(dòng)子甲基化現(xiàn)象[5]，同樣，在子宮內(nèi)膜癌[34]、肝癌[4]中也得到相似的結(jié)果。在肺癌細(xì)胞NCI-H157和NCIH460中，如果下調(diào)Timeless的表達(dá)水平，可以抑制細(xì)胞增殖和克隆形成，同時(shí)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[7]，提示它可以作為肺癌診斷和預(yù)防的標(biāo)志物，同時(shí)也是具有較高治療價(jià)值的靶分子。

5.2 腫瘤的診療

鑒于Timeless連接了生物節(jié)律和細(xì)胞周期兩大調(diào)控系統(tǒng)，一些關(guān)于Timeless與癌癥易感性的遺傳學(xué)和表觀遺傳學(xué)研究成為當(dāng)下熱門(mén)課題。單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）在人類(lèi)基因組中廣泛存在，且分布具有高密度性和高保守性。研究發(fā)現(xiàn)，一些基因的SNP與腫瘤發(fā)生、預(yù)后和藥物敏感性相關(guān)，是一種便于利用的生物標(biāo)志物。在441例乳腺癌組織和479例癌旁非癌組織中，Timeless的2個(gè)SNP位點(diǎn)（rs2291738和rs7302060）與乳腺癌的發(fā)生密切相關(guān)[8]。而Kristan[35]和Yong等[1]分別發(fā)現(xiàn)，在乳腺癌組織和前列腺癌組織中所檢測(cè)的Timeless SNP位點(diǎn)與腫瘤的易感性和惡性程度無(wú)關(guān)。

表2 Timeless在各種癌組織中的差異表達(dá)及其預(yù)后相關(guān)性

節(jié)律調(diào)節(jié)是人類(lèi)抵制癌癥的重要先決條件。在小鼠和大鼠的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭?，用藥時(shí)間的變化會(huì)給30多種抗癌藥物的毒性和功效帶來(lái)約百分之五十的差異[36]。雌激素受體α（ERα）的表達(dá)水平可用來(lái)篩選對(duì)激素類(lèi)藥物（如它莫西芬，tamoxifen）反應(yīng)的乳腺癌患者，在體外實(shí)驗(yàn)中，Timeless的表達(dá)水平受17β雌二醇調(diào)控，并且可以在耐它莫西芬細(xì)胞株中過(guò)表達(dá)。Timeless有望成為篩選對(duì)它莫西芬耐藥的ERα陽(yáng)性乳腺癌患者的標(biāo)記物[37]。通過(guò)檢測(cè)腫瘤中Timeless基因的突變，可以預(yù)測(cè)藥物敏感性的變化[9]；同時(shí)，減低Timeless的表達(dá)水平可以增強(qiáng)一些化療藥物的活性，這些藥物能夠激活腫瘤細(xì)胞的DNA損傷通路，提示Timeless可能是一種新的治療癌癥的藥物靶分子[2]。

6 結(jié)語(yǔ)

Timeless是重要的生物節(jié)律基因，在生物節(jié)律、細(xì)胞周期、胚胎發(fā)育、癌癥發(fā)生發(fā)展和診療中發(fā)揮重要的生物學(xué)作用，如何將這些生物學(xué)功能用于臨床尚有許多問(wèn)題需要解決。Timeless在癌組織和癌旁非癌組織中的差異表達(dá)特點(diǎn)是否與癌癥的組織類(lèi)型和發(fā)病地區(qū)有關(guān)？是否在體外和體內(nèi)降低Timeless的表達(dá)水平都能夠抑制腫瘤細(xì)胞增殖、并誘導(dǎo)其凋亡？Timeless的SNP位點(diǎn)對(duì)于腫瘤易感性和治療效果的預(yù)測(cè)是否具有實(shí)用性？隨著研究數(shù)據(jù)的不斷累積和豐富，期望能夠闡明Timeless表達(dá)水平與腫瘤發(fā)生發(fā)展和預(yù)后的聯(lián)系，明確其中的作用機(jī)制，充分發(fā)揮Timeless作為腫瘤診斷和治療的靶分子的作用。

[1]Zhu Y,Stevens R G,Hoffman A E,et al.Testing the circadi?an genehypothesis in prostatecancer:apopulation-based case-control study[J].Cancer Res,2009,69(24):9315-9322.

[2]Yang X,Wood P A,Hrushesky W J.Mammalian TIMELESS is required for ATM-dependent CHK2 activation and G2/M checkpoint control[J].J Biol Chem,2010,285(5):3030-3034.

[3]Xiao J,Li C,Zhu N L,et al.Timeless in lung morphogenesis[J].Dev Dyn,2003,228(1):82-94.

[4]Lin Y M,Chang J H,Yeh K T,et al.Disturbance of circadi?an gene expression in hepatocellular carcinoma[J].Mol Car?cinog,2008,47(12):925-933.

[5]Kuo S J,Chen S T,Yeh K T,et al.Disturbance of circadi?an gene expression in breast cancer[J].Virchows Arch,2009,454(4):467-474.

[6]Mazzoccoli G,Piepoli A,Carella M,et al.Altered expression ofthe clock genemachinery in kidney cancerpatients[J].Biomed Pharmacother,2012,66(3):175-179.

[7]Yoshida K,Sato M,Hase T,et al.TIMELESS is overex?pressed in lung cancerand itsexpression correlateswith poor patient survival[J].Cancer Sci,2013,104(2):171-177.

[8]Fu A,Leaderer D,Zheng T,et al.Genetic and epigenetic as?sociations of circadian gene TIMELESS and breast cancer risk[J].Mol Carcinog,2012,51(12):923-929.

[9]Mazzoccoli G,Panza A,Valvano M R,et al.Clock gene ex?pression levels and relationship with clinical and pathological features in colorectal cancer patients[J].Chronobiol Int,2011,28(10):841-851.

[10]Relles D,Sendecki J,Chipitsyna G,et al.Circadian gene ex?pression and clinicopathologic correlates in pancreatic cancer[J].J Gastrointest Surg,2013,17(3):443-450.

[11]劉仲敏,張亞平.Timeless與生物鐘基因[J].動(dòng)物學(xué)研究,2001,22(6):497-501.

[12]Panda S,Hogenesch J B,Kay S A.Circadian rhythms from flies to human[J].Nature,2002,417(6886):329-335.

[13]Philippsen P,Kleine K,P?hlmann R,et al.The nucleotide se?quence of Saccharomyces cerevisiae chromosome XIV and its evolutionary implications[J].Nature,1997,387(6632 Suppl):93-98.

[14]Bussey H,Storms R K,Ahmed A.The nucleotide sequence of Saccharomyces cerevisiae chromosome XVI[J].Nature,1997,387(6632 Suppl):103-105.

[15]C.eleganssequencing consortium.Genome sequence ofthe nematode C.elegans:a platform for investigating biology[J].Sci?ence,1998,282(5396):2012-2018.

[16]Hoskins R A,Carlson J W,Kennedy C,et al.Sequence fin?ishing and mapping of Drosophila melanogaster heterochromatin[J].Science,2007,316(5831):1625-1628.

[17]O'Reilly L P,Watkins S C,Smithgall T E.An unexpected role for the clock protein timeless in developmental apoptosis[J].PLoS One,2011,6(2):e17157.

[18]Dheekollu J,Chen H S,Kaye K M,et al.Timeless-depen?dent DNA replication-coupled recombination promotes Kapo?si's Sarcoma-associated herpesvirus episome maintenance and terminal repeat stability[J].J Virol,2013,87(7):3699-3709.

[19]Unsal-Ka?maz K,Mullen T E,Kaufmann W K,et al.Cou?pling of human circadian and cell cycles by the timeless pro?tein[J].Mol Cell Biol,2005,25(8):3109-3116.

[20]Kaushik R,Nawathean P,Busza A,et al.PER-TIM interac?tions with the photoreceptor cryptochrome mediate circadian temperature responses in Drosophila[J].PLoS Biol,2007,5(6):e146.

[21]Meissner R A,Kilman V L,Lin J M,et al.TIMELESS is an important mediator of CK2 effects on circadian clock func?tion in vivo[J].J Neurosci,2008,28(39):9732-9740.

[22]Barnes J W,Tischkau S A,Barnes J A,et al.Requirement of mammalian Timeless for circadian rhythmicity[J].Science,2003,302(5644):439-442.

[23]Zheng B,Larkin D W,Albrecht U,et al.The mPer2 gene en?codesa functionalcomponentofthemammalian circadian clock[J].Nature,1999,400(6740):169-173.

[24]Gauger M A,Sancar A.Cryptochrome,circadian cycle,cell cycle checkpoints,and cancer[J].CancerRes,2005,65(15):6828-6834.

[25]Wallach T,Schellenberg K,Maier B,et al.Dynamic circadi?an protein-protein interaction networks predict temporal organi?zation of cellular functions[J]. PLoS Genet, 2013,9(3):e1003398.

[26]Chan R C,Chan A,Jeon M,et al.Chromosome cohesion is regulated by a clock gene paralogue TIM-1[J].Nature,2003,423(6943):1002-1009.

[27]Leman A R,Noguchi C,Lee C Y,et al.Human Timeless and Tipin stabilize replication forks and facilitate sister-chro?matid cohesion[J].J Cell Sci,2010,123(Pt 5):660-670.

[28]Kaufmann W K.Initiating the uninitiated:replication of dam?aged DNA and carcinogenesis[J].Cell Cycle,2007,6(12):1460-1467.

[29]Unsal-Ka?maz K,Chastain P D,Qu P P,et al.The human Tim/Tipin complex coordinates an Intra-S checkpointre?sponse to UV that slows replication fork displacement[J].Mol Cell Biol,2007,27(8):3131-3142.

[30]Leman A R,Dheekollu J,Deng Z,et al.Timeless preserves telomere length by promoting efficient DNA replication through human telomeres[J]. CellCycle,2012,11(12):2337-2347.

[31]Smith K D,Fu M A,Brown E J.Tim-Tipin dysfunction cre?ates an indispensible reliance on the ATR-Chk1 pathway for continued DNA synthesis[J].J Cell Biol,2009,187(1):15-23.

[32]Gotter A L,Manganaro T,Weaver D R,et al.A time-less function for mouse timeless[J].Nat Neurosci,2000,3(8):755-756.

[33]Li Z,Stuart R O,Qiao J,Pavlova A,et al.A role for Time?less in epithelial morphogenesis during kidney development[J].Proc Natl Acad Sci USA,2000,97(18):10038-10043.

[34]Shih M C,Yeh K T,Tang K P,et al.Promoter methylation in circadian genes of endometrial cancers detected by methyla?tion-specific PCR[J].Mol Carcinog,2006,45(10):732-740.

[35]Grundy A,Schuetz J M,Lai A S,et al.Shift work,circadian gene variants and risk of breast cancer[J].Cancer Epidemiol,2013,37(5):606-612.

[36]Mormont M C,Levi F.Cancer chronotherapy:principles,appli?cations,and perspectives[J].Cancer,2003,97(1):155-169.

[37]Tozlu-Kara S,Roux V,Andrieu C,et al.Oligonucleotide mi?croarray analysis of estrogen receptor alpha-positive postmeno?pausal breast carcinomas:identification of HRPAP20 and TIME?LESS asoutstanding candidate markersto predictthe re?sponse to tamoxifen[J].J Mol Endocrinol,2007,39(4):305-318.