HPLC—ELSD法同時測定痔速寧片中鵝去氧膽酸、豬去氧膽酸的含量

戚繼紅+++沈偉

[摘要] 目的 采用高效液相色譜法-蒸發(fā)光散射檢測法測定痔速寧片中豬去氧膽酸和鵝去氧膽酸的含量。 方法 采用Thermo U-3000液相色譜系統(tǒng)；ChromeleonTM 7工作站；ELSD 2000ES檢測器，檢測器條件：漂移管溫度：105℃，撞擊管關(guān)閉，增益為1，氣體流速：2.0 L/min。采用Thermo（4.6×150 mm，C18 5 μm 120 A）色譜柱；流動相：乙腈-0.1%冰醋酸（50∶50）；流速：0.9 mL/min；柱溫：20℃。結(jié)果 表明豬去氧膽酸在（21.530～262.884）μg/mL（r=0.9997），鵝去氧膽酸在（11.148～133.776）μg/mL（r=0.9995）的范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系；豬去氧膽酸平均加樣回收率為101.8%（n=9），RSD=2.8%；鵝去氧膽酸平均加樣回收率為98.0%（n=9），RSD=2.3%。 結(jié)論 本方法操作簡便、準確、靈敏度高，可用于痔速寧片的質(zhì)量控制。

[關(guān)鍵詞] 高效液相色譜法-蒸發(fā)光散射檢測法；痔速寧片；豬去氧膽酸和鵝去氧膽酸；含量測定

[中圖分類號] R286.0 [文獻標識碼] B [文章編號] 1673-9701（2014）26-0064-03

痔速寧片由豬膽膏、白蘞、槐花、五倍子、黑豆等中藥組方而成，具有解毒消炎、止血止痛、退腫通便、收縮痔核之功效。臨床用于治療內(nèi)痔、外痔、混合痔等[1]。本制劑收載于《中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標準中藥成方制劑第五冊》WS3-B-1026-91，豬膽具有清熱、潤燥、解毒、止咳平喘之功效，主要含有豬去氧膽酸、鵝去氧膽酸、膽紅素等活性成分[2]。該標準沒有對豬膽膏的有效成分進行相關(guān)質(zhì)量控制，為了更好地控制該產(chǎn)品質(zhì)量，本文采用高效液相色譜法-蒸發(fā)光散射檢測法同時測定痔速寧片中豬膽膏的主要成分豬去氧膽酸和鵝去氧膽酸的含量，該方法準確、穩(wěn)定、靈敏度高，可用于痔速寧片的質(zhì)量控制。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Thermo U-3000液相色譜系統(tǒng)；ChromeleonTM 7工作站；ELSD 2000ES檢測器；超聲波清洗器（上海吉理超聲議有限公司，型號：JL-360DT）；XS105DU電子天平（0.1 mg；0.01 mg）；HC-3018臺式高速離心機；SHY-2A恒溫水浴振蕩器。

1.2 試藥

鵝去氧膽酸化學(xué)對照品（來源：中國藥品生物制品檢定所，批號：110806-200704；供含量測定用）；豬去氧膽酸（國家藥品標準物質(zhì)，購自中國藥品生物制品檢定所，批號：100087-200610；供含量測定用，供HPLC法測定時含量為97.3%）；痔速寧片（吉林省輝南輝發(fā)制藥股份有限公司，批號：20120507、20120604、20120701、201305 06）； 乙腈為色譜純，水為純化水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1色譜條件及系統(tǒng)適用性試驗[3-5]

Thermo（4.6×150 mm，C18 5 μm 120 A）色譜柱；流動相：乙腈-0.1%冰醋酸（50∶50）；流速：0.9 mL/min；柱溫：20℃。進樣量：10 μL。檢測器條件：漂移管溫度：105℃；增益為1；撞擊管關(guān)閉；氣體流速：2.0 L/min；兩主峰分離度大于1.5，理論板數(shù)按豬去氧膽酸計算大于10000。

2.2 混合對照溶液的制備

取豬去氧膽酸55.32 mg，鵝去氧膽酸27.87 mg，同置于25 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，得每毫升中含豬去氧膽酸2153.0 μg、含鵝去氧膽酸1114.8 μg的混合溶液，作為混合對照儲備液[6]。

2.3 供試品溶液的制備

取本品10片，除去包衣，精密稱定，研細，取細粉適量，置100 mL錐形瓶中，加10%氫氧化鈉10 mL，用牛皮紙將瓶口蓋上，置滅菌鍋中，于120℃、壓力103 kPa下加熱4 h，放冷，離心，上清液移至100 mL量瓶中，藥渣加水3 mL，震蕩洗滌，離心，取上清液再重復(fù)洗滌兩次，洗液并入量瓶中，用鹽酸調(diào)節(jié)pH至6～7，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.4 樣品陰性對照溶液

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1線性[7，8] 分別量取混合對照儲備液0.5、1.0、2.0、5.0、6.0 mL，置50 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，以各自峰面積的自然對數(shù)和濃度自然對數(shù)進行線性回歸，回歸方程分別為豬去氧膽酸：Y=1.2746X-1.9468（r=0.9997）；鵝去氧膽酸回歸方程： Y=1.1628X-1.6415（r=0.9995），豬去氧膽酸線性范圍為（21.530～262.884）μg/mL，鵝去氧膽酸線性范圍為（11.148～133.776）μg/mL。

2.5.2精密度試驗 取混合對照儲備液5.0 mL，置50 mL量瓶中，得對照溶液，10 μL對照溶液進樣，連續(xù)5次，豬去氧膽酸對照品峰面積分別為133.306、135.260、134.062、134.619、134.399，RSD=0.54%；鵝去氧膽酸對照品峰面積分別為45.986、45.500、46.458、47.465、46.110， RSD=1.6%。

2.5.3 穩(wěn)定性試驗[9] 取痔速寧片（批號：20120507）按“2.2”中制備方法制得供試品溶液，分別在0、2、4、6、8、10、12、14、16、18 h進樣測試，記錄色譜圖，結(jié)果豬去氧膽酸峰面積自然對數(shù)的RSD為0.3%，鵝去氧膽酸峰面積自然對數(shù)的RSD為1.0%。

2.5.4 重復(fù)性試驗 取痔速寧片按2.2.2制備方法制得供試品溶液共6份，各進樣2次，結(jié)果豬去氧膽酸的平均含量為14.8601 mg/g，RSD為1.5%，鵝去氧膽酸的平均含量為12.2313 mg/g，RSD為1.8%。endprint

2.5.5 加樣回收率試驗[10] 稱取痔速寧（批號：20120507），分別精密加入含豬去氧膽酸194.6 μg/mL、含鵝去氧膽酸189.0 μg/mL的混合對照品溶液3.2、4.0、4.8 mL，置于25 mL量瓶中，按“2.2”中制備方法得加樣回收率試驗溶液，注入液相色譜儀

2.6 樣品的測定

3 討論

目前，《中華人民共和國藥典》收載標準，如豬膽粉、藿膽丸等，多以薄層掃描法測定豬去氧膽酸和鵝去氧膽酸。由于豬去氧膽酸、鵝去氧膽酸屬甾體類物質(zhì)，均為紫外末端吸收，不適合用紫外檢測器測定，因此選用ELSD 檢測器檢測。

作為豬膽汁主要有效成分，很多研究檢測膽酸、豬去氧膽酸或膽酸、鵝去氧膽酸，也有同時測定豬去氧膽酸和鵝去氧膽酸的相關(guān)報道，本文采用專屬性更強、靈敏度更高、操作簡單的HPLC-ELSD 法對速痔寧片中豬去氧膽酸和鵝去氧膽酸進行了測定，并對含量測定方法進行了系統(tǒng)實驗考察，結(jié)果表明該方法結(jié)果準確，重復(fù)性好，可有效地控制該制劑的質(zhì)量。

檢測條件優(yōu)化及柱溫：有文獻報道采用30℃、40℃的柱溫，通過試驗比較，升高柱溫，分離效果、峰形及面積并沒有改善，本文采用20℃的柱溫即達到滿意效果；漂移管溫度：通過試驗比較105℃、95℃[11]，結(jié)果105℃時峰面積達到最大；在色譜條件選擇的過程中，經(jīng)試驗選擇乙腈-0.1%冰醋酸（50∶50）為流動相，流速為0.9 mL/min分離度大于1.5，樣品中其他成分對二者無干擾。

[參考文獻]

[1] 中華人民共和國衛(wèi)生部藥典委員會. 中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標準中藥成方制劑第四冊[S]. 1991：136-137.

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[6] 麥意梅，于永洲. 霍膽丸中豬去氧膽酸和鵝去氧膽酸的含量測定[J]. 時珍國醫(yī)國藥，2010，21（10）：2702-2703.

[7] 盛燕，陸靜嫻，趙衛(wèi)民，等. 膽酸止咳片中豬去氧膽酸和鵝去氧膽酸的含量測定[J]. 醫(yī)藥導(dǎo)報，2013，32（12）：1645-1647.

[8] 張鵬威，蘇文琴，楊柳，等. 高效液相-蒸發(fā)光散射法測定藿膽滴丸中豬去氧膽酸含量[J]. 醫(yī)藥導(dǎo)報，2011，30（3）：377-378.

[9] 江英橋. HPLC-ELSD 法測定清開靈注射液中膽酸和豬去氧膽酸的含量[J]. 中國藥品標準，2006，7（4）：31-33.

[10] 謝志宏，周燾，汪曉凌，等. HPLC- EL SD 法測定清開靈栓中膽酸和豬去氧膽酸的含量[J]. 中國藥房，2009， 20（9）：696-697.

[11] 婁玉霞，聶桂華，劉乃強. HPLC-ELSD法測定痰熱清注射液中黃芩苷、熊去氧膽酸和鵝去氧膽酸3種成分的含量[J]. 中國中藥雜志，2009，34（14）：1862-1864.

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2.5.5 加樣回收率試驗[10] 稱取痔速寧（批號：20120507），分別精密加入含豬去氧膽酸194.6 μg/mL、含鵝去氧膽酸189.0 μg/mL的混合對照品溶液3.2、4.0、4.8 mL，置于25 mL量瓶中，按“2.2”中制備方法得加樣回收率試驗溶液，注入液相色譜儀

2.6 樣品的測定

3 討論

目前，《中華人民共和國藥典》收載標準，如豬膽粉、藿膽丸等，多以薄層掃描法測定豬去氧膽酸和鵝去氧膽酸。由于豬去氧膽酸、鵝去氧膽酸屬甾體類物質(zhì)，均為紫外末端吸收，不適合用紫外檢測器測定，因此選用ELSD 檢測器檢測。

作為豬膽汁主要有效成分，很多研究檢測膽酸、豬去氧膽酸或膽酸、鵝去氧膽酸，也有同時測定豬去氧膽酸和鵝去氧膽酸的相關(guān)報道，本文采用專屬性更強、靈敏度更高、操作簡單的HPLC-ELSD 法對速痔寧片中豬去氧膽酸和鵝去氧膽酸進行了測定，并對含量測定方法進行了系統(tǒng)實驗考察，結(jié)果表明該方法結(jié)果準確，重復(fù)性好，可有效地控制該制劑的質(zhì)量。

檢測條件優(yōu)化及柱溫：有文獻報道采用30℃、40℃的柱溫，通過試驗比較，升高柱溫，分離效果、峰形及面積并沒有改善，本文采用20℃的柱溫即達到滿意效果；漂移管溫度：通過試驗比較105℃、95℃[11]，結(jié)果105℃時峰面積達到最大；在色譜條件選擇的過程中，經(jīng)試驗選擇乙腈-0.1%冰醋酸（50∶50）為流動相，流速為0.9 mL/min分離度大于1.5，樣品中其他成分對二者無干擾。

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[8] 張鵬威，蘇文琴，楊柳，等. 高效液相-蒸發(fā)光散射法測定藿膽滴丸中豬去氧膽酸含量[J]. 醫(yī)藥導(dǎo)報，2011，30（3）：377-378.

[9] 江英橋. HPLC-ELSD 法測定清開靈注射液中膽酸和豬去氧膽酸的含量[J]. 中國藥品標準，2006，7（4）：31-33.

[10] 謝志宏，周燾，汪曉凌，等. HPLC- EL SD 法測定清開靈栓中膽酸和豬去氧膽酸的含量[J]. 中國藥房，2009， 20（9）：696-697.

[11] 婁玉霞，聶桂華，劉乃強. HPLC-ELSD法測定痰熱清注射液中黃芩苷、熊去氧膽酸和鵝去氧膽酸3種成分的含量[J]. 中國中藥雜志，2009，34（14）：1862-1864.

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2.5.5 加樣回收率試驗[10] 稱取痔速寧（批號：20120507），分別精密加入含豬去氧膽酸194.6 μg/mL、含鵝去氧膽酸189.0 μg/mL的混合對照品溶液3.2、4.0、4.8 mL，置于25 mL量瓶中，按“2.2”中制備方法得加樣回收率試驗溶液，注入液相色譜儀

2.6 樣品的測定

3 討論

目前，《中華人民共和國藥典》收載標準，如豬膽粉、藿膽丸等，多以薄層掃描法測定豬去氧膽酸和鵝去氧膽酸。由于豬去氧膽酸、鵝去氧膽酸屬甾體類物質(zhì)，均為紫外末端吸收，不適合用紫外檢測器測定，因此選用ELSD 檢測器檢測。

作為豬膽汁主要有效成分，很多研究檢測膽酸、豬去氧膽酸或膽酸、鵝去氧膽酸，也有同時測定豬去氧膽酸和鵝去氧膽酸的相關(guān)報道，本文采用專屬性更強、靈敏度更高、操作簡單的HPLC-ELSD 法對速痔寧片中豬去氧膽酸和鵝去氧膽酸進行了測定，并對含量測定方法進行了系統(tǒng)實驗考察，結(jié)果表明該方法結(jié)果準確，重復(fù)性好，可有效地控制該制劑的質(zhì)量。

檢測條件優(yōu)化及柱溫：有文獻報道采用30℃、40℃的柱溫，通過試驗比較，升高柱溫，分離效果、峰形及面積并沒有改善，本文采用20℃的柱溫即達到滿意效果；漂移管溫度：通過試驗比較105℃、95℃[11]，結(jié)果105℃時峰面積達到最大；在色譜條件選擇的過程中，經(jīng)試驗選擇乙腈-0.1%冰醋酸（50∶50）為流動相，流速為0.9 mL/min分離度大于1.5，樣品中其他成分對二者無干擾。

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[7] 盛燕，陸靜嫻，趙衛(wèi)民，等. 膽酸止咳片中豬去氧膽酸和鵝去氧膽酸的含量測定[J]. 醫(yī)藥導(dǎo)報，2013，32（12）：1645-1647.

[8] 張鵬威，蘇文琴，楊柳，等. 高效液相-蒸發(fā)光散射法測定藿膽滴丸中豬去氧膽酸含量[J]. 醫(yī)藥導(dǎo)報，2011，30（3）：377-378.

[9] 江英橋. HPLC-ELSD 法測定清開靈注射液中膽酸和豬去氧膽酸的含量[J]. 中國藥品標準，2006，7（4）：31-33.

[10] 謝志宏，周燾，汪曉凌，等. HPLC- EL SD 法測定清開靈栓中膽酸和豬去氧膽酸的含量[J]. 中國藥房，2009， 20（9）：696-697.

[11] 婁玉霞，聶桂華，劉乃強. HPLC-ELSD法測定痰熱清注射液中黃芩苷、熊去氧膽酸和鵝去氧膽酸3種成分的含量[J]. 中國中藥雜志，2009，34（14）：1862-1864.

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