?；撬釋?duì)大鼠缺血心肌血管新生作用的研究

王亞霓 ，劉 欣 ，張 穎，張 曦 ，王意涵 ，徐哲龍

（1.天津醫(yī)科大學(xué)病理生理學(xué)教研室，天津300070；2.天津醫(yī)科大學(xué)藥理學(xué)教研室，天津300070；3.天津醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院泌尿外科，天津300211）

?；撬幔╰aurine，Tau）是心肌細(xì)胞內(nèi)含量最為豐富的游離氨基酸[1]，具有調(diào)節(jié)細(xì)胞鈣穩(wěn)定，清除自由基和穩(wěn)定細(xì)胞膜等功能。研究發(fā)現(xiàn)，牛磺酸在心血管方面具有心肌保護(hù)抗心律失常、抗高血壓和抗動(dòng)脈粥樣硬化、降低血脂、抑制血小板凝集與血栓形成，抗心力衰竭等多種心血管藥理作用[2]。外源性刺激或促進(jìn)缺血組織的血管新生（亦稱治療性血管新生），是近年來(lái)治療缺血性心臟病的研究熱點(diǎn)之一。血管新生方法可通過(guò)血管生長(zhǎng)因子調(diào)節(jié)蛋白的參與促進(jìn)血管生成，建立有效的側(cè)支循環(huán)以改善心肌缺血狀態(tài)。新近的研究表明：內(nèi)皮細(xì)胞特異的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）、低氧誘導(dǎo)因子（HIF）等對(duì)缺血心肌血管新生有益，有助于促進(jìn)缺血周邊組織側(cè)支循環(huán)的建立，參與治療缺血性心臟病。本實(shí)驗(yàn)研究了心肌保護(hù)物質(zhì)牛磺酸對(duì)缺血再灌（I/R）損傷大鼠心肌促進(jìn)血管新生的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑與藥品 牛磺酸（天津聯(lián)星生物工程研究所進(jìn)口分裝）、烏拉坦、肝素鈉注射劑、10%福爾馬林、生理鹽水、2，3，5－氯化三苯基四氮唑（TTC）、臺(tái)盼藍(lán)、VEGF試劑盒、HIF－α試劑盒、血小板－內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子（CD34）試劑盒（天津聯(lián)星生物工程研究所）。

1.1.2 儀器和設(shè)備 小動(dòng)物呼吸機(jī)(成都泰盟科技有限公司)、血壓傳感器、心電傳感器、BL-420E生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)(成都泰盟科技有限公司)、電子天平、肝素化試管、1.5mL離心管、10mL離心管、20℃冰箱、-80℃冰箱、組織研磨器、低溫離心機(jī)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康的Wistar大鼠（中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)：SCXK（軍）2007-004），雄性，體質(zhì)量 220～250 g，大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，標(biāo)準(zhǔn)飼料和自來(lái)水置于動(dòng)物房飼養(yǎng)。

1.3 實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷慕?/p>

1.3.1 分組及動(dòng)物模型 Wistar大鼠分為4組，每組20只。各組給藥途徑均為口服。缺血再灌注模型組（I/R）：生理鹽水（NS）10mL/kg，每天 1次，連續(xù) 7 d；?；撬岬蛣┝拷M（L）：?；撬?200mg/kg，每天 1次，連續(xù)7 d；?；撬嶂袆┝拷M（M）：?；撬?00mg/kg，每天 1 次，連續(xù) 7 d；牛磺酸高劑量組（H）：?；撬?00mg/kg，每天1次，連續(xù)7 d。

1.3.2 I/R損傷模型 大鼠給藥7 d后，以25%氨基甲基乙酰（烏拉坦4mL/kg）腹腔注射大鼠體內(nèi)進(jìn)行麻醉，背部固定于手術(shù)臺(tái)，四肢皮下連接電機(jī)，氣管、頸動(dòng)脈插管，連接BL-420E生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)連續(xù)監(jiān)測(cè)血壓及II導(dǎo)心電圖，連接呼吸機(jī)。備皮，進(jìn)行常規(guī)消毒，于胸骨左緣2mm縱行剪斷第3～4胸肋關(guān)節(jié)開(kāi)胸，刺破胸膜和心包膜，暴露心臟。以左冠狀靜脈為標(biāo)志，用4×10號(hào)縫合針穿000號(hào)絲線，從左心耳下緣約1mm處水平進(jìn)針，經(jīng)冠狀動(dòng)脈左前降支（LAD）下方，于肺動(dòng)脈圓錐旁出針，術(shù)后穩(wěn)定15min。絲線兩端共同交叉穿過(guò)一下段為球形的聚乙烯小管形成活結(jié)，拉緊活結(jié)造成LAD供血區(qū)心肌缺血，以左室前壁呈紫紺藍(lán)或紫色及II導(dǎo)聯(lián)S-T段弓背上抬大于0.1mV并持續(xù)30min為結(jié)扎成功。30min后，放松活結(jié)，心肌恢復(fù)血流灌注2 h，此為心肌I/R損傷模型。

心肌再灌注標(biāo)志：抬高的S-T段逐步恢復(fù)；平均動(dòng)脈壓（MAP）逐步恢復(fù)；左心室顏色轉(zhuǎn)紅。具有下列情況之一者退出實(shí)驗(yàn)：術(shù)中出血過(guò)多；在穩(wěn)定過(guò)程中，動(dòng)物出現(xiàn)較嚴(yán)重的心律失常；結(jié)扎冠狀動(dòng)脈失敗或未發(fā)生再灌注；呼吸心跳停止超過(guò)30 s者；出現(xiàn)自發(fā)性室顫，60 s內(nèi)未自行轉(zhuǎn)復(fù)者。

1.4 標(biāo)本收集 大鼠行I/R模型結(jié)束，腹主動(dòng)脈取血，制備血清，立即處死動(dòng)物取出心臟，NS沖洗，用濾紙吸干后稱重，在冰浴中取出心室部分和心尖部分。心室部分用NS制備心臟勻漿，4 000 r/min（-4℃）離心10min，取上清測(cè)生化指標(biāo)。心尖固定于10%福爾馬林，做HE染色。每組取部分大鼠心臟做TTC染色。

1.5 觀察指標(biāo)

1.5.1 血壓和心率 于缺血前30min、缺血后立即、15min和30min，再灌注30min和2 h用BL-420E生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)記錄收縮壓、舒張壓和心率（HR），并計(jì)算 MAP。

1.5.2 心電圖 （1）ST-段：觀察時(shí)間段心電圖ST段抬高振幅（mV）。（2）心律失常：記錄缺血再灌期間心律失常發(fā)生的類型，包括室早（VPC）出現(xiàn)時(shí)間、持續(xù)時(shí)間，室速（VT）和室顫（VF）發(fā)生率。持續(xù)時(shí)間是指VPC首次出現(xiàn)至消失的時(shí)間間隔。

1.5.3 心肌梗死面積 2 h再灌注結(jié)束結(jié)扎LAD，由下腔靜脈注射0.6℅臺(tái)盼藍(lán)2mL，迅速將大鼠心臟剪下，用生理鹽水洗凈，濾紙吸干，置于-20℃冰箱冷凍20min。由心尖部向心臟基底部將心臟切成厚度約0.1 cm薄片，分離出不同著色的危險(xiǎn)區(qū)（AAR）部分，放置于pH7.4的1℅TTC染液中避光放置，37℃孵育20min，然后放入10%甲醛溶液中固定24 h。在分離出的危險(xiǎn)區(qū)部分，瀕死區(qū)心肌部分被染成磚紅色，而梗死區(qū)（IS）心肌呈灰白色。固定24 h后將梗死區(qū)從危險(xiǎn)區(qū)中分離，用電子天平精確稱重，心臟梗死面積為IS與AAR重量比值（即IS/AAR）。

1.5.4 光鏡觀察 取心尖部分以10%甲醛固定，乙醇脫水后石蠟包埋，常規(guī)制片，HE染色：石蠟切片經(jīng)二甲苯I脫蠟→酒精梯度脫水→自來(lái)水洗→蘇木精染色→自來(lái)水洗→1%鹽酸酒精分化→自來(lái)水洗→1%稀氨水反藍(lán)→自來(lái)水洗→伊紅染色→自來(lái)水洗→酒精梯度脫水→二甲苯I→二甲苯II→中性樹(shù)膠封片→光鏡觀察。

1.5.5 血清 VEGF、HIF-α、CD34含量 再灌注結(jié)束時(shí)經(jīng)腹主動(dòng)脈采血，3 000r/min離心15min，分離血清。按說(shuō)明書(shū)利用分光光度儀測(cè)定血清VEGF、HIF-α、CD34的含量。

1.5.6 心肌勻漿液VEGF含量的測(cè)定 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后立即取下心臟，用濾紙吸干水分，取心室前壁組織約0.1 g，制成10℅心肌組織勻漿，采用ELISA法，按試劑盒說(shuō)明書(shū)要求測(cè)定組織VEGF的含量。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 16.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以x±s表示，因各組樣本含量相等，故多組間比較采用單因素方差分析，兩兩相比采用LSD檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 血壓與心率 與缺血前比較，I/R模型組，Tau低、中和高劑量組MAP和HR呈顯著降低趨勢(shì)（P<0.01），再灌后有所回升，但均低于缺血前水平，4組之間無(wú)顯著性差異。

2.2 ST段 與缺血前比較，缺血期每組的ST段均顯著抬高（P<0.01）,至缺血15min達(dá)峰值，與I/R模型組比較，Tau低、中、高劑量組ST段抬高幅度顯著降低（P<0.01）。再灌注后，各組ST段均逐漸降低，至再灌注30min后恢復(fù)至結(jié)扎前水平（圖1）。

圖1 ?；撬釋?duì)缺血大鼠ST段的影響(n=8)Fig 1 Theeffectsof taurieon ST segm ent during I/R in rats(n=8)

2.3 心律失常 在缺血期，I/R模型組VPC出現(xiàn)時(shí)間為（5.8±2.9）min，持續(xù)時(shí)間為（13.3±5.6）min。與 I/R組比較，Tau低、中、高劑量組VPC出現(xiàn)時(shí)間分別推遲 65.4℅、71.9℅、93.7℅（P<0.01）,持續(xù)時(shí)間分別縮短 34.8℅、49.5℅、55.6℅（P<0.01），低、中和高劑量組之間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖2）。I/R組VT、VF發(fā)生率分別為65.7℅、42.3℅,與I/R組比較，高、中和低劑量組VT、VF發(fā)生率明顯降低（P<0.05），高、中和低劑量組之間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖3）。再灌注期間，I/R組有VPC發(fā)生，但出現(xiàn)頻率明顯少于缺血期，高、中和低劑量組僅偶見(jiàn)VPC出現(xiàn)；I/R組偶有VT發(fā)生；各組均無(wú)VF發(fā)生。故未對(duì)再灌注期間室性心律失常做統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。

圖3 牛磺酸對(duì)缺血VT、VF發(fā)生率的影響（n=8）Fig 3 Theeffectsof taurineon the incidenceof ventricular arrhythm ia during ischem ia in ratswith different time(n=8)

2.4 心肌梗死評(píng)價(jià) 4組AAR差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但與I/R模型組比較，不同劑量牛磺酸處理組IS/AAR比值顯著降低（表1）。

表1 ?；撬釋?duì)缺血/再灌注梗死面積的影響（，n=8）Tab1 Theeffectsof taurineon infarcted area inmyocardial I/R injury rats（，n=8）

表1 ?；撬釋?duì)缺血/再灌注梗死面積的影響（，n=8）Tab1 Theeffectsof taurineon infarcted area inmyocardial I/R injury rats（，n=8）

與I/R模型組比較，*P＜0.05；與Tau低劑量組比較，a P＜0.05；與Tau中劑量組比較，b P＜0.05

組別 IS/mg AAR/mg 心肌梗死面積/%I/R 模型組 78.2±25.4 237.4±53.2 32.9±11.1 Tau低劑量組 52.8±19.8* 198.2±39.1 26.6± 8.9*Tau 中劑量組 47.4±31.5*a 227.8±44.7 20.8±13.2*a Tau高劑量組 34.1±28.3*b 227.1±29.3 15.0± 7.3*b

2.5 心肌形態(tài)學(xué)指標(biāo) 光鏡下觀察可見(jiàn)，肌纖維完整，心肌細(xì)胞形態(tài)規(guī)則，I/R模型組間質(zhì)無(wú)毛細(xì)血管新生；T au低劑量組間質(zhì)未見(jiàn)新生毛細(xì)血管；T au中劑量組可見(jiàn)少量的新生毛細(xì)血管，Tau高劑量組間質(zhì)可見(jiàn)較多新生的毛細(xì)血管（圖4）。

2.6 牛磺酸對(duì)心肌組織指標(biāo)濃度的影響 與I/R模型組比較，Tau高、中、低劑量組心肌組織各指標(biāo)含量上升顯著（P<0.01）,且隨劑量增加作用明顯（表 2）。

表2 ?；撬釋?duì)缺血/再灌注心肌組織各指標(biāo)濃度的影響（，n=8）Tab2 The effects of taurine on concentration of m yocardial indexesduring I/R（，n=8）

表2 ?；撬釋?duì)缺血/再灌注心肌組織各指標(biāo)濃度的影響（，n=8）Tab2 The effects of taurine on concentration of m yocardial indexesduring I/R（，n=8）

與I/R模型組比較，*P＜0.01；與Tau低劑量組比較，a P＜0.01；與Tau中劑量組比較，b P＜0.01

組別VEGF/（pg·mL-1）HIF-α/（ng·mL-1）CD34/（ng·mL-1）I/R 模型組 24.41±5.24 0.07±0.02 0.09±0.02 Tau低劑量組 109.72±23.24* 0.32±0.12* 1.70±0.49*Tau 中劑量組 155.54±29.30*a 0.94±0.19*a 4.79±0.53*a Tau 高劑量組 246.60±22.97*ab 2.13±0.23*ab 9.13±1.53*ab

2.7 ?；撬釋?duì)大鼠血清VEGF濃度的影響 與I/R模型組比較，Tau高、中、低劑量組血清VEGF含量上升顯著（P<0.01），且隨劑量增加作用明顯（表3）。

表3 ?；撬釋?duì)缺血/再灌注各組大鼠血清VEGF濃度的影響（，n=8）Tab3 The effectsof taurineon serum concentration VEGF during I/R for thegroups（，n=8）

表3 ?；撬釋?duì)缺血/再灌注各組大鼠血清VEGF濃度的影響（，n=8）Tab3 The effectsof taurineon serum concentration VEGF during I/R for thegroups（，n=8）

與I/R模型組比較，*P＜0.01；與Tau低劑量組比較，a P＜0.01；與Tau中劑量組比較，b P＜0.01

組別VEGF/（pg·mL-1）I/R模型組 0.99±0.24 Tau低劑量組 62.15±11.17*Tau中劑量組 132.38±9.88*a Tau高劑量組 228.32±32.92*ab

3 討論

心肌缺血/再灌注損傷即缺血心肌在成功恢復(fù)血液供應(yīng)后，引起心肌損傷進(jìn)一步加重的情況，包括梗死面積擴(kuò)大、心律失常等[3]。大量研究表明，在長(zhǎng)時(shí)間缺血再灌注損傷前，經(jīng)歷多次反復(fù)給予某些藥物處理可以增加心肌對(duì)損傷的耐受性。牛磺酸是維持機(jī)體自穩(wěn)態(tài)的重要細(xì)胞保護(hù)物質(zhì)之一，能調(diào)節(jié)心血管系統(tǒng)的功能,保護(hù)心血管免于多種不良因素的影響與損害,其作用靶點(diǎn)十分廣泛[4-6]。本研究采用在體大鼠心肌缺血再灌注損傷模型，研究多次反復(fù)給予牛磺酸對(duì)缺血心肌血管新生的作用。

血管新生是指從現(xiàn)有血管滋生出新的血管，在心臟中建立側(cè)支循環(huán)，從而減輕心肌缺血、防止細(xì)胞壞死、達(dá)到預(yù)防和延緩缺血性心肌病的目的[7-9]。研究表明以下指標(biāo)可反映血管新生狀況：（1）VEGF：是目前發(fā)現(xiàn)最強(qiáng)烈的血管生成因子，既能增加內(nèi)皮細(xì)胞胞漿內(nèi)Ca2+的濃度使毛細(xì)血管對(duì)大分子物質(zhì)的通透性增高，又能從多種途徑使內(nèi)皮細(xì)胞狀態(tài)呈細(xì)長(zhǎng)狀并刺激復(fù)制，并促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)使其發(fā)生移位，誘導(dǎo)其他內(nèi)皮細(xì)胞蛋白酶的表達(dá)[10]。（2）HIF-α：在缺氧環(huán)境下廣泛存在于人體和哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，可以啟動(dòng)多種基因的轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)血管生成，調(diào)控細(xì)胞增殖和凋亡[11]。（3）CD34：最常用的血管內(nèi)皮標(biāo)志物，是高度糖基化的i型跨膜糖蛋白，選擇性地表達(dá)于人類及其他哺乳動(dòng)物造血干細(xì)胞表面，對(duì)處于激活的或者是處于增殖狀態(tài)的小血管內(nèi)皮細(xì)胞染色具有很高的敏感性[12]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，給藥組VEGF的表達(dá)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于模型組，且給藥濃度越高，越明顯；HIF-α在給藥組的表達(dá)明顯高于對(duì)照組，隨給藥濃度增加，HIF-α表達(dá)也增加；給藥后CD34含量有所增加,且隨劑量呈遞增趨勢(shì)，高劑量給藥組最為明顯。

?；撬釋?duì)心血管系統(tǒng)作用廣泛，機(jī)制復(fù)雜，而就本實(shí)驗(yàn)而言牛磺酸可以刺激VEGF生成、促進(jìn)HIF-α表達(dá)、增高CD34含量，從而促進(jìn)缺血心肌血管新生，達(dá)到心肌保護(hù)作用。

（本文圖4見(jiàn)封三）

圖4 各組大鼠心梗區(qū)一般組織形態(tài)學(xué)觀察（HE×400）Fig 4 M orphology changes inm yocardium infarction for thegroups（HE ×400）

[1]Li X L,Yin Q M,Jiao L L,etal.A convenient synthesis of novel thiazolidin-4-one-linked pseudodisaccharides by tandem staudinger/aza-wittig/cyclization and their biological evaluation[J].Carbohydr Res,2011,346(3):401

[2]李大慶,吳明均,胡曉華,等.?；撬嵫芯窟M(jìn)展[J].現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2011,2(11):390

[3]Heusch G. Cardioprotection:chances and challenges of its translation to the clinic[J].Lancet,2013,381(9861):166

[4]范謙,楊新春,王樹(shù)巖,等.“漸處理”降低了犬心肌缺血/再灌注損傷[J].中華心血管病雜志,2006,34(4):363

[5]Wu Q,LiH,Wu Y,etal.Protective effectsofmuscone on ischemia-reperfusio injury in cardiacmyocytes[J].JEthnopharmacol,2011,138(1):34

[6]Musiolik J,van Caster P,Skyschally A,etal.Reduction of infarct size by gentle reperfusion without activation of reperfusion injury salvagekinases in pigs[J].Cardiovasc Res,2010,85(1):110

[7]Beyersdorf F.Theuseofcontrolled reperfusion strategies in cardiacsurgery tominimize ischaemia/reperfusion damage[J].Cardiovasc Res,2009,83(2):262

[8]徐波華,許立.中藥抗心肌缺血作用機(jī)制的研究進(jìn)展[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志,2011,17（15）:265

[9]Miyamoto TA,Ueno T,Iguro Y,etal.Taurine-mediated cardioprotection is greaterwhen administered upon reperfusion than prior to ischemia[J].Adv Exp Med Biol,2009,643:27

[10]Sahin M A,Yucel O,Guler A,etal.Is there any cardioprotective role of taurine during cold ischemic period following global myocardial ischemia?[J].JCardiothorac Surg,2011,6(31):1

[11]Mabjeesh N J,Willard M T,Frederickson C E,etal.Androgens stimulate hypoxia inducible factor activation via autocrine loop of tyrosine kinase receptor/phosphatidylinositol13 kinase/protein kinase B in prostate cancer cells[J].Clin Cancer Res,2003,9(7):2416

[12]A kagi K,Ikeda Y,Sumiyoshi Y,etal.Estimation of angiogenesis with anti-CD105 immunostaining in the processof colorectal cancer development[J].Surgery,2002,131(Suppl1):S109