炎癥因子IL-23對(duì)黑色素瘤B16F10細(xì)胞增殖和侵襲能力的影響

田 原，馬躍美，劉艷榮，房東亮，趙秀蘭

（天津醫(yī)科大學(xué)1.外科手術(shù)學(xué)教研室；2.病理學(xué)教研室，天津300070）

白細(xì)胞介素-23（IL-23）在炎癥和自身免疫性疾病中具有重要的調(diào)節(jié)作用，目前研究表明IL-23可通過(guò)調(diào)控腫瘤微環(huán)境中的炎癥反應(yīng)[1]，從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生與侵襲遷移[2]。有關(guān)炎癥因子IL-23對(duì)黑色素瘤細(xì)胞增殖和侵襲力的直接影響少見(jiàn)報(bào)道。本研究在前期研究慢性炎癥與腫瘤關(guān)系的基礎(chǔ)上，通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)探討IL-23對(duì)黑色素瘤B16細(xì)胞增殖和侵襲能力的影響，為進(jìn)一步研究IL-23在慢性炎癥與腫瘤發(fā)生發(fā)展中所發(fā)揮的作用提供一定理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 小鼠黑色素瘤細(xì)胞株B16F10由天津醫(yī)科大學(xué)病理學(xué)教研室凍存。重組鼠IL-23購(gòu)自美國(guó)PeproTech公司，Transwell小室（直徑為 8μm）購(gòu)自Invitrogen公司，MTT購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，Matrigel膠購(gòu)自美國(guó)BD公司，細(xì)胞培養(yǎng)板購(gòu)自美國(guó)Costar公司，胎牛血清（FBS）購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司。兔抗鼠NF-κB磷酸化P65一抗購(gòu)自美國(guó)Santa Cruze公司，兔抗鼠β-actin一抗、山羊抗兔二抗購(gòu)自北京中杉金橋生物公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 小鼠黑色素瘤細(xì)胞B16F10，接種于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中（加入青霉素、鏈霉素各100 U/m L），置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，以0.25%胰蛋白酶消化傳代。所有實(shí)驗(yàn)均用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞。

1.2.2 MTT法檢測(cè)B16細(xì)胞的增殖能力 將B16細(xì)胞制備成1×104/mL單細(xì)胞懸液，按每孔200μL接種于96孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)24 h后在培養(yǎng)液中加入終濃度為10 ng/mL的IL-23，并設(shè)空白對(duì)照組，在培養(yǎng)箱中分別放置24、48、72、96 h后，加入MTT 100 μL培養(yǎng)4 h，吸棄液體，每孔加入100μLDMSO充分溶解15min。用酶標(biāo)儀于490 nm處測(cè)吸光度值(A值)，結(jié)果為5復(fù)孔的平均值。

1.2.3 Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)B16細(xì)胞的侵襲能力 用 50 mg/LMatrigel膠 1∶8稀釋液包被 Transwell小室的上室面，37℃孵育過(guò)夜。實(shí)驗(yàn)前細(xì)胞用無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)過(guò)夜，次日消化重懸細(xì)胞，于下室加入含10%胎牛血清的培養(yǎng)基、上室中加入無(wú)血清和濃度為10 ng/mL IL-23的B16細(xì)胞懸液各200 μL，并設(shè)空白對(duì)照組，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后取出小室，PBS淋洗，擦去上室中細(xì)胞，95%酒精固定10 min，4 g/L結(jié)晶紫染色，PBS清洗，200倍倒置顯微鏡下拍照穿膜細(xì)胞，隨機(jī)選10個(gè)視野，計(jì)算平均數(shù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，每組各設(shè)3復(fù)孔。

1.2.4 明膠酶譜檢測(cè)B16細(xì)胞MMP-2和MMP-9的表達(dá)活性 將無(wú)血清的B16細(xì)胞接種到24孔板，每孔500μL，培養(yǎng)24 h后，在培養(yǎng)液中加入10 ng/mL IL-23，培養(yǎng)48 h后，收集上清液，12 000 r/min，離心10min，進(jìn)一步取上清液進(jìn)行明膠酶譜檢測(cè)。以含0.1%明膠的10%聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳至溴酚蘭進(jìn)入陽(yáng)極緩沖液為止，分離凝膠，2.5%Triton-X100洗膠4次，每次30min。將膠完全浸入明膠酶孵育液（50mmol/L pH7.5Tris-HCl、10mmol/L CaCl2、200mol/LNaCl、1 μmol/LZnCl2）中，37 ℃孵育42 h，常規(guī)考馬斯亮藍(lán)染色，脫色液脫色至復(fù)染帶清晰，圖像分析系統(tǒng)測(cè)定凝膠中MMPs活性條帶活性水平，應(yīng)用Gel-pro analyzer分析軟件測(cè)定條帶平均灰度值。

1.2.5 Western blot檢測(cè) 加入細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，加樣行10%聚丙烯酰胺凝膠電泳。將蛋白從SDS-PAGE膠轉(zhuǎn)膜至PVDF膜，利用5%脫脂奶粉封閉，然后分別加入兔抗鼠NF-κB磷酸化 P65 一抗（1∶200）、β-actin 一抗（1∶200），在37℃下作用2 h；用TBST漂洗3次，每次10min后與山羊抗兔 IgG 抗體（1∶2 000）反應(yīng)，37℃作用 2 h；然后用TBST漂洗，10min/次，洗滌3次；在暗室避光X光膠片曝光，進(jìn)行顯影、定影、拍照。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差 （x±s）表示，采用SPSS 17.0軟件做統(tǒng)計(jì)分析，兩獨(dú)立樣本比較采用t檢驗(yàn)，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 IL-23對(duì)B16細(xì)胞增殖能力的影響 MTT法檢測(cè)結(jié)果顯示，10 ng/mL IL-23作用于B16細(xì)胞24、48、72和96 h時(shí)，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比，細(xì)胞活力均無(wú)顯著變化，IL-23對(duì)細(xì)胞的增殖無(wú)影響，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）（圖 1）。

圖1 IL-23對(duì)B16細(xì)胞增殖能力的影響Fig 1 Theeffectof IL-23 on proliferation ability of B16 cells

2.2 IL-23對(duì)B16細(xì)胞侵襲能力的影響 Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)顯示，10 ng/mL IL-23作用于B16細(xì)胞24 h后，與對(duì)照組相比，穿過(guò)基底膜的數(shù)目明顯增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）（表 1）。

表1 IL-23對(duì)B16細(xì)胞侵襲能力的影響（x±s）Tab1 Effectof IL-23 on invision ability of B16 cells（x±s）

2.3 IL-23對(duì)B16細(xì)胞MMP-2和MMP-9表達(dá)活性的影響 與對(duì)照組相比，10 ng/mL IL-23作用于B16細(xì)胞48 h后，可明顯增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞MMP-9活性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），MMP-2活性未見(jiàn)顯著變化（P>0.05）（圖 2）。

2.4 IL-23對(duì)B16細(xì)胞磷酸化NF-κB P65表達(dá)水平的影響 Western blot結(jié)果與對(duì)照組相比，IL-23處理組腫瘤細(xì)胞磷酸化P65蛋白表達(dá)水平顯著升高（P<0.01），見(jiàn)圖 3。

圖2 IL-23對(duì)B16細(xì)胞MMP-9和MMP-2表達(dá)活性的影響Fig 2 Effectsof IL-23 on MMP-9 and MMP-2 expression activitiesof B16 cells

圖3 IL-23處理組腫瘤細(xì)胞磷酸化P65蛋白的表達(dá)Fig 3 The expression of phosphorylated P65 in IL-23 treated B16 cells

3 討論

慢性炎癥在多種腫瘤的啟動(dòng)、進(jìn)展及轉(zhuǎn)移潛能中起著致病因子作用，炎癥性細(xì)胞因子的異常表達(dá),可以在體內(nèi)募集單核巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等到達(dá)腫瘤臨近的部位，形成有利于腫瘤生長(zhǎng)和侵襲的微環(huán)境，誘導(dǎo)腫瘤血管生成促進(jìn)腫瘤發(fā)展進(jìn)程。IL-23是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一種同時(shí)參與慢性炎癥形成和腫瘤發(fā)生的細(xì)胞因子，研究表明IL-23可促進(jìn)局部環(huán)境中炎癥介質(zhì)的釋放，抑制機(jī)體特異性免疫監(jiān)視，促進(jìn)黑色素瘤的發(fā)生與生長(zhǎng)[3]；IL-23可激活Stat3信號(hào)通路，在肺癌細(xì)胞的增殖過(guò)程中發(fā)揮重要作用，并呈現(xiàn)其濃度依賴(lài)性[4]；IL-23也可在肝癌的發(fā)展過(guò)程中激活NF-κB信號(hào)通路加速其轉(zhuǎn)移和侵襲[5]。因此針對(duì)IL-23與腫瘤細(xì)胞關(guān)系的研究對(duì)腫瘤的防治、免疫應(yīng)答及調(diào)節(jié)都有重要意義。

Langowski[3]發(fā)現(xiàn)IL-23p19缺失的小鼠能夠抵抗腫瘤發(fā)生，同時(shí)阻斷IL-23信號(hào)通路也能抑制腫瘤生長(zhǎng)。本文前期建立荷瘤小鼠-慢性炎癥復(fù)合模型[6]研究中，進(jìn)一步證實(shí)了IL-23對(duì)腫瘤的生長(zhǎng)具有調(diào)節(jié)作用。最近研究表明低濃度外源性IL-23可直接促進(jìn)肺癌腫瘤細(xì)胞的增殖，并參與腫瘤微環(huán)境的形成；高濃度IL-23則抑制腫瘤細(xì)胞增殖[4]。而本實(shí)驗(yàn)體外IL-23刺激B16細(xì)胞，腫瘤細(xì)胞增殖活性卻未見(jiàn)明顯提升，提示IL-23在不同腫瘤疾病中作用機(jī)制可能存在差異，不同IL-23濃度下腫瘤細(xì)胞的增殖效應(yīng)也不盡相同。綜合前期體內(nèi)模型結(jié)果[6]，實(shí)驗(yàn)組血清檢測(cè)IL-23表達(dá)升高的同時(shí)，移植瘤微血管密度（MVD）等指標(biāo)顯著增加，本文推測(cè)在黑色素瘤發(fā)生發(fā)展的過(guò)程中，IL-23可能通過(guò)誘導(dǎo)黑色素瘤細(xì)胞或基質(zhì)細(xì)胞分泌MMPs、VEGF等介質(zhì)，促進(jìn)腫瘤血管生成進(jìn)而促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)。

IL-23促進(jìn)腫瘤微環(huán)境中Th0細(xì)胞分化為T(mén)h17細(xì)胞，Th17細(xì)胞產(chǎn)生IL-17A，IL-17A可以通過(guò)NF-κB上調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶的表達(dá)來(lái)促進(jìn)肝癌細(xì)胞的侵襲和遷移[7]，但I(xiàn)L-23對(duì)腫瘤的侵襲是否有直接的作用少見(jiàn)報(bào)道。本文侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，IL-23處理后B16細(xì)胞穿膜細(xì)胞數(shù)明顯增多，上述增殖實(shí)驗(yàn)提示穿膜數(shù)的增加并非由增殖引起，說(shuō)明IL-23促進(jìn)了B16細(xì)胞的體外侵襲。MMPs是一類(lèi)與腫瘤侵襲相關(guān)的鋅依賴(lài)性肽鏈內(nèi)切酶家族，其相關(guān)的信號(hào)傳導(dǎo)通路參與了腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、腫瘤侵襲及腫瘤血管的形成[8]，目前發(fā)現(xiàn)的MMPs有23種，MMP-2、MMP-9等與腫瘤的侵襲和遷移相關(guān)，本文明膠酶譜分析IL-23處理B16細(xì)胞的MMP-9活性明顯增強(qiáng)，說(shuō)明IL-23可通過(guò)上調(diào)MMP-9的活性促進(jìn)B16細(xì)胞的侵襲。Western blot分析顯示IL-23促進(jìn)了磷酸化P65的表達(dá)，從而激活NF-κB信號(hào)通路，說(shuō)明NF-κB是MMP-9表達(dá)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，印證了NF-κB通路是炎癥與腫瘤相聯(lián)系的關(guān)鍵點(diǎn)[9]，NF-κB信號(hào)通路的活化參與了惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展的多個(gè)環(huán)節(jié)[10]。

綜上所述，IL-23對(duì)黑色素瘤B16細(xì)胞的增殖無(wú)明顯的刺激作用，可通過(guò)提高M(jìn)MP-9的活性而增強(qiáng)細(xì)胞的體外侵襲能力，這一促進(jìn)作用與腫瘤細(xì)胞NF-κB信號(hào)通路的上調(diào)有關(guān)。本文研究IL-23在慢性炎癥與腫瘤進(jìn)展中的調(diào)節(jié)作用，并為以IL-23作為新的生物治療靶點(diǎn)應(yīng)用于臨床提供了一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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