抗糖尿病先導化合物Fla-CN的合成工藝研究

岳小龍，陳家浩，秦 楠，段宏泉

（天津醫(yī)科大學藥學院，基礎醫(yī)學研究中心，天津市臨床藥物關鍵技術重點實驗室，天津 300070）

本課題組前期對臨床應用確有療效的中藥委陵菜（Potentillachinensis）開展了有效成分研究，發(fā)現(xiàn)委陵菜黃酮（Tiliroside）是中藥委陵菜抗糖尿病作用的主要有效成分。委陵菜黃酮能夠顯著控制糖尿病小鼠的體質量，降低血糖，改善脂代謝[1]。進一步的藥代動力學研究結果表明，委陵菜黃酮容易分解，代謝迅速[2]。本課題組對委陵菜黃酮進行了衍生合成，得到了具有很強抗糖尿病作用的黃酮衍生物3-O-[（E）-4-(4-氰基苯基)-3-烯-2-酮丁基]山萘酚（Fla-CN）[3]。Fla-CN通過活化肝細胞（HepG2細胞）的腺苷單磷酸激酶（Adenosine-5′-monophosphate activated protein kinase,AMPK）信號分子，調節(jié)肝糖代謝，顯著提高胰島素抵抗的HepG2細胞對于葡萄糖的消耗[3]，并且Fla-CN還能促進骨骼肌細胞（L6和C2C12細胞）中葡萄糖轉運子4（Glucose transporter type 4，GLUT4）的轉位，從而增加葡萄糖在骨骼肌細胞中的代謝[4]。因此，黃酮衍生物Fla-CN是一種結構新穎的抗糖尿病先導化合物。在前期衍生合成研究中，成功實現(xiàn)了Fla-CN的半合成，由三步反應完成[3]，依次是克萊森-施密特（Claisen-Schimidt）反應、溴代反應和醚化反應，總收率小于20%。目前，尚無其他課題組報道Fla-CN的合成方法。本文在前期合成的基礎上，針對Fla-CN的三步合成，從反應溫度、底物濃度、反應物當量比以及催化劑等方面進行單因素考察試驗，摸索最佳反應條件，建立合成工藝，提高反應總收率。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 SHB-ⅢA循環(huán)水式多用真空泵，低溫冷卻液循環(huán)泵（上海豫康科教儀器設備有限公司），DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器，Advance 2B/400核磁共振儀（Bruker公司，TMS為內標），DZX-3型真空干燥箱，ZF-Ι型三用紫外分析儀，EYELAPSL-1810型低溫反應器。薄層層析硅膠，柱層析硅膠300-400目（青島海洋化學公司)，ToyoperalHW-40c型凝膠樹脂（日本Tosoh公司）；4-氰基苯甲醛為工業(yè)原料（天津希爾貝思科技有限公司），嗎啉，三氟乙酸（TFA），2-吡咯烷二酮氫三溴化物（Pyrrolidonehydrotribromide，PHT）購自北京百靈威化學技術有限公司，山萘酚購自陜西慧科植物技術開發(fā)有限公司,無水碳酸鉀、無水硫酸鎂購自天津市紅巖化學試劑廠,石油醚、乙酸乙酯、四氫呋喃、1,4-二氧六環(huán)、二氯甲烷和甲醇購自天津基準化學試劑公司，丙酮購自天津市江天化工技術有限公司。4-氰基苯甲醛純度為工業(yè)級，其他試劑均為分析純。

1.2 試驗方法

1.2.1 催化劑嗎啉三氟乙酸鹽的合成量 取100mL石油醚加入反應瓶中，于-20℃冰浴下攪拌，再量取8.74mL嗎啉加入反應瓶中。量取50mL石油醚于恒壓滴液漏斗中，再量取8.42mL三氟乙酸加入到恒壓滴液漏斗中，與石油醚混勻，然后緩慢滴加到反應瓶中，繼續(xù)冰浴攪拌1 h，抽濾，棄去濾液，沉淀用石油醚洗滌3次，干燥，得白色塊狀固體19.8 g，產率98.5%。

1.2.2 （E）－4－（4－氰基苯基）－3－烯－2－丁酮（1）的合成 稱取對氰基苯甲醛6.6 g和嗎啉三氟乙酸鹽5.0 g于反應瓶中，加入40mL丙酮溶解。于75℃油浴下回流攪拌24 h。TLC監(jiān)測完全后降至室溫，加入蒸餾水適量，抽濾并水洗沉淀3次，干燥后得淡黃色固體 8.4 g，產率 98.1%。1HNMR（400MHz，CDCl3）δ：7.52（2H，dd，J ＝ 8.0 Hz），7.48（1H，d，J＝ 16.4 Hz），7.09（2H，t），6.65（1H，d，J＝16.4Hz），2.38（3H，s）。

1.2.3 （E）－1－溴－4－（4－氰基苯基）－3－烯－2－丁酮（2）的合成[5]稱取342.4mg中間體1于反應瓶中，加入1.0mLTHF溶解。稱取782.0mg PHT，以40mL THF溶解，緩緩滴加到反應瓶中，30℃下攪拌，反應24 h后，取樣以1H NMR檢測計算產率為70.2%。反應液抽濾，濾液濃縮物以適量二氯甲烷溶解，飽和NaHCO3溶液洗滌3次，飽和食鹽水洗滌3次后減壓濃縮得到黃色油狀物粗品。粗品經硅膠柱層析純化，石油醚-乙酸乙酯（6∶1）洗脫，分離得到白色固體326.6mg。1H NM R（400MHz，CDCl3）δ：7.72－7.69（4H，m），7.69（1H，d，J＝15.7 Hz），7.05（1H，d，J＝15.7 Hz），4.09（2H，s）。

1.2.4 3-O-[（E）-4-（4－氰基苯基）-3-烯-2-酮丁基]山萘酚（Fla－CN）的合成 稱取137.4mg山萘酚和66.3mg無水K2CO3于反應瓶中，加入2.6 mL 1，4-二氧六環(huán)使之溶解，油浴升溫至80℃并攪拌。稱取100mg中間體2，以2.4mL 1，4-二氧六環(huán)溶解，用恒壓滴液漏斗緩緩滴加到反應瓶中，80℃攪拌7.5 h。TLC監(jiān)測反應完全后，冷卻至室溫，加入稀鹽酸適量終止反應，加入乙酸乙酯萃取3次，無水MgSO4干燥，過濾，濃縮得黃褐色粗品235.3mg。取樣以1H NMR檢測計算產率73.4%。粗品經HW-40C 凝膠柱層析純化，二氯甲烷-甲醇（2∶1）洗脫，得黃色粉末狀固體 119.3mg。1H NMR（400MHz，DMSO－d6）δ：12.53（1H，s，OH），10.89（1H，s，OH），10.25（1H，s，OH），8.04（2H，d，J＝8.9 Hz），7.91－7.86（4H，m），7.70（1H，d，J＝16.4Hz），7.19（1H，d，J＝16.4 Hz），6.91（2H，d，J＝ 8.9 Hz），6.47（1H，d，J＝2.0 Hz），6.22（1H，d，J＝2.0Hz），5.10（2H，s）。13CNMR（100MHz，DMSO－d6）δ：195.0，177.9，167.6，164.7，163.5，161.6，160.7，159.0，156.8，155.7，142.4，140.8，139.3，136.7，133.2，133.1，131.0，129.6，126.0，121.0，119.0，116.0，112.9，104.5，99.2，94.2，75.9.ESI-MS m/z：453.9[M-H]-。

2 結果

2.1 中間體1的制備條件考察 本文將文獻方法稍作調整，以嗎啉三氟乙酸鹽替代NaOH作為反應的催化劑，結果該步反應的產率達到98.1%。

2.2 中間體2的制備條件考察

2.2.1 反應溫度的考察 本文基于不飽和酮溴代方法，首先考察了反應溫度對產率的影響。結果顯示該反應的產率隨溫度的升高而下降，在30℃下進行反應得到的產率較高（表1）。

表1 反應溫度對溴代反應產率的影響Tab1 Effectsof tem peratureon yieldsofbrom ination

2.2.2 反應物當量比的考察 在一定的反應溫度和PHT濃度下，考察中間體1與PHT的當量比對產率的影響。結果顯示中間體1-PHT當量比在1∶0.8 至 1∶1.2 時，產率升高至 70.2%，在 1∶1.2 至 1∶2.0時產率逐步下降至53.6%，在當量比為1∶1和1∶1.2時，產率較高（表2）。

2.2.3 PHT滴加濃度的考察 在一定的反應溫度和反應物當量比下，進一步考察了PHT滴加濃度對產率的影響。結果顯示PHT滴加濃度過高或者過低時產率都會降低，其最佳滴加濃度為0.06mmol/mL（表 3）。

表2 反應物當量比對溴代反應產率的影響Tab2 Effectsof reactants ratio on yieldsof brom ination

表3 PHT滴加濃度對溴代反應產率的影響Tab3 Effectsof PHT’sadding concentr ationson yieldsof brom ination

2.3 Fla-CN的制備條件考察

2.3.1 反應溫度的考察 本文基于醚化反應的一般機制，首先考察反應溫度對反應完全所需時間以及產率的影響。結果顯示，隨著反應溫度的升高，反應完全所需時間減小，在80℃下進行反應得到的收率較高（表 4）。

表4 反應溫度對醚化反應產率的影響Tab4 Effectsof temperatureon yields of etheration

2.3.2 反應物當量比的考察 在一定溫度與反應液濃度下，考察了山萘酚與中間體2的當量比對反應完全所需時間和產率的影響，結果顯示當量比為1.2∶1時，反應產率較高。各反應物當量比對反應完全所需時間沒有明顯影響（表5）。

2.3.3 中間體2反應濃度的考察 在一定反應物當量比和反應溫度下，進一步考察了中間體2在反應液中的濃度對反應完全所需時間和產率的影響，結果顯示，當中間體2的濃度為0.08mmol/mL時，F(xiàn)la-CN的產率相對較高，中間體2的濃度對反應完全所需時間沒有明顯影響（表6）。

表5 反應物當量比對醚化反應產率的影響Tab5 Effectsof reactants ratio on yieldsof etheration

表6 中間體2反應濃度對醚化反應產率的影響Tab6 Effectsof concentrations in the reaction solution of interm idate2 on yieldsof etheration

通過以上條件的考察，確定了Fla-CN的最優(yōu)合成工藝（圖1）。

圖1 Fla-CN最優(yōu)合成工藝Fig 1 Theoptim ized synthetic routeof Fla-CN

3 討論

前期合成中首步反應使用NaOH來完成對氰基苯甲醛和丙酮的縮合[6]，產率為50%，且生成的副產物較多，后處理工作繁瑣。改用嗎啉三氟乙酸鹽為催化劑[7]后，反應產物單一，后處理步驟得到簡化，中間體1的收率有很大的提高，達到98.1%，該反應條件簡單溫和可用于工業(yè)化生產。

中間體2的制備為溴代反應，以PHT作為溴代試劑[8-10]，較高的溫度、高濃度或者過量的PHT均能提高反應速度，但生成的目標產物會繼續(xù)反應從而降低了中間體2的收率。因此，在單因素考察中，對反應溫度、反應物當量比和PHT的滴加濃度進行了考察。試驗結果表明，中間體2的收率隨溫度的升高而降低。中間體1和溴代試劑PHT的當量比在1∶1和1∶1.2時反應產率相當。從回收原料降低成本的角度出發(fā)，本研究選用1∶1的物料當量比為優(yōu)選反應條件。同時溴代試劑PHT的滴加濃度對產率也有影響，試驗結果表明，0.06mmol/mL的PHT滴加濃度為優(yōu)選濃度，低濃度時反應慢產率低，高濃度時反應迅速，同時副產物較多而產率較低。

最后一步醚化反應為親核取代反應，山萘酚中有4個酚羥基，其中5位酚羥基與羰基形成穩(wěn)定的氫鍵很難發(fā)生親核取代反應，3位、7位和4’位羥基反應活性各不相同，3位羥基反應活性大于7位羥基，而4’位羥基反應活性最弱。3、7位羥基的競爭性反應是決定反應條件的關鍵因素。單因素考察試驗的結果也證實了上述推斷：較高的溫度雖然加快了反應速度，但是副產物也更容易生成。進一步對反應物的當量比進行考察發(fā)現(xiàn)，山萘酚稍過量時反應產率較好。同樣，過量或高濃度的中間體2會增加副產物，降低反應收率。

綜合上述結果，結合生產成本的考慮，本文建立的Fla-CN的合成工藝為：嗎啉三氟乙酸鹽做催化劑，以丙酮為溶劑回流反應24 h，合成中間體1。30℃溫度條件下，中間體1與PHT當量比為1∶1，PHT滴加濃度為0.06mmol/mL反應24 h，合成中間體2。80℃溫度條件下，山萘酚與中間體2的當量比為1.2∶1，中間體2在反應液中濃度為0.08mmol/mL反應8 h，合成Fla-CN。

[1]趙川，喬衛(wèi)，張彥文，等.委陵菜抗糖尿病有效部位及有效成分的研究[J].中國中藥雜志，2008，33（6）：680

[2]齊悅，唐鋮，段宏泉.委陵菜黃酮在大鼠體內的藥動學研究[J].藥物評價研究，2010，33（3）：187

[3]Qin N,Li C B,Jin M N,etal.Synthesis and biological activity of novel tilirosi dederivants[J].Eur JMed Chem,2011,46（10）,5189

[4]Shi L H,Qin N,Hu L J,etal.Tiliroside-derivatives enhance GLUT4 translocation via AMPK in muscle cells[J].Diabetes Res Clin Pract,2011,92（2）：e41

[5]Babu K S,Li X C,Jacob M R,etal.Synthesis,antifungal activity,and structure-activity relationshipsof coruscanone A analogues[J].JMed Chem,2006,49（26）:7877

[6]Tatsuzaki J,Bastow K F,Nakagawa-Goto K,etal.Dehydrozingerone,chalcone,and isoeugenol analogues as in vitro anticanceragents[J].JNatProd,2006,69（10）:1445

[7]Zumbansen K,Doehring A,List B.Morpholiniumtrifluoroacetatecatalyzed aldol condensation of acetone with both aromatic and aliphatic aldehydes[J].Adv Synth Catal,2010，352（7）:1135

[8]CromwellNH.α,β-Unsaturated aminoketones V.reaction ofpyrrolidine and tetrahydroquinoline with bromine derivatives of benzalacetophenone[J].JAm Chem Soc,1941,63（11）:2984

[9]Harvey RG,Jung TH,Bukowska M.A new chromone and flavone synthesis and its utilization for the synthesis of potentially antitumorigenic polycyclic chromones and flavones[J].J Org Chem,1990,55（25）：6161

[10]Kreis LM,Carreira EM.Total synthesis of（－）-dendrobine[J].Angew Chem IntEd,2012,51（14）:3436