富勒烯與β淀粉樣肽低聚體結(jié)合的分子動(dòng)力學(xué)模擬

周曉穎 郗文輝 韋廣紅

(應(yīng)用表面物理國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,計(jì)算物質(zhì)科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,復(fù)旦大學(xué)物理系,上海 200433）

1 引言

一系列重大疾病與蛋白或多肽的淀粉樣聚集有關(guān),如阿茲海默氏癥(AD）、帕金森癥、二型糖尿病等.1,2其中阿茲海默氏癥,由于患者眾多,一直備受人們的關(guān)注.3,4AD患者會(huì)出現(xiàn)出一系列神經(jīng)退行性癥狀,如記憶功能退化、語(yǔ)言及認(rèn)知能力的喪失等,嚴(yán)重時(shí)將致死.AD發(fā)病幾率隨著年齡增長(zhǎng)呈現(xiàn)幾何級(jí)數(shù)增長(zhǎng),在美國(guó)AD已經(jīng)成為僅次于心臟病和癌癥的第三大致死疾病.由于目前尚沒有治療AD的特效藥物,對(duì)AD的研究受到各界人士的廣泛重視.5,6通常認(rèn)為AD的成因主要與大腦內(nèi)的Aβ、Tau等蛋白的錯(cuò)誤折疊和淀粉樣聚集密切相關(guān).Aβ是一種通過(guò)多種分泌酶剪切淀粉質(zhì)前體蛋白而得到的多肽,長(zhǎng)度約為37-43個(gè)氨基酸,其中以Aβ40和Aβ42這兩種具有神經(jīng)細(xì)胞毒性的淀粉樣聚集體最為常見.7-9Aβ40在大腦內(nèi)的濃度數(shù)倍于Aβ42,但后者具有更強(qiáng)的毒性.正常狀態(tài)下Aβ并不具有特定的三維結(jié)構(gòu),其本身的生理功能也尚不清楚;然而在病理狀態(tài)下,Aβ會(huì)在大腦內(nèi)形成淀粉樣纖維并大量沉淀,最終形成光學(xué)顯微鏡下可見的斑塊.10通過(guò)電鏡、固相核磁共振(ss-NMR）等多種實(shí)驗(yàn)手段,人們已經(jīng)大致了解該淀粉樣聚集體的分子結(jié)構(gòu)特征.11-13Aβ40/42通過(guò)鏈間平行β片,排列成可以無(wú)限延伸的原纖維;進(jìn)而多條原纖維之間互相纏繞,最終形成電鏡下可觀察到的細(xì)長(zhǎng)纖維狀的聚集體.14有實(shí)驗(yàn)表明,Aβ在聚集過(guò)程中形成的低聚物和纖維均具有神經(jīng)毒性,15是導(dǎo)致AD的原因之一.研究如何破壞或抑制Aβ的淀粉樣聚集,對(duì)理解Aβ的聚集機(jī)理以及開發(fā)治療AD的方案具有重要意義.

雖然Aβ可以在試管中自發(fā)從可溶單體狀態(tài)聚集為淀粉樣沉淀,但是在細(xì)胞內(nèi),Aβ處于一個(gè)復(fù)雜的溶液環(huán)境,將受到諸多因素的影響,如pH、16,17小分子18或納米顆粒19-21等.不同因素會(huì)對(duì)Aβ聚集產(chǎn)生促進(jìn)或抑制作用,因此若干治療策略都是基于某種調(diào)控機(jī)制來(lái)抑制或破壞Aβ的聚集過(guò)程.22碳納米顆粒,作為納米顆粒的一種,具有如工藝成熟、表面修飾便利、生物毒性低等一系列優(yōu)點(diǎn),在藥物運(yùn)輸、表面催化等領(lǐng)域均有廣泛運(yùn)用.23-25不少富勒烯或石墨烯等碳納米顆粒相關(guān)的實(shí)驗(yàn)和模擬側(cè)重于淀粉樣聚集蛋白體系.26-29最近一系列的研究工作表明,碳納米顆粒的曲率等物理化學(xué)性質(zhì)將對(duì)淀粉樣多肽及非淀粉樣多肽的吸附和聚集產(chǎn)生一定的影響.27,30,312003年Kim和Lee32發(fā)現(xiàn)修飾后的富勒烯可以有效抑制全長(zhǎng)Aβ的聚集,這一結(jié)果為開發(fā)C60類抗聚集藥物提供了良好的指引方向.Andujar等33利用分子對(duì)接研究了富勒烯與Aβ的結(jié)合位點(diǎn),得到了在有序的β-sheet頂部的位點(diǎn)為能量有利的結(jié)合位點(diǎn),并采用分子動(dòng)力學(xué)模擬研究了富勒烯在此結(jié)合位點(diǎn)上與Aβ的相互作用及其對(duì)Aβ結(jié)構(gòu)的破壞,此結(jié)果為理解富勒烯的抑制效應(yīng)提供了一些初步的思路,但有一些不清楚的地方,例如:(1）如果不用對(duì)接方法,而是采用分子動(dòng)力學(xué)模擬,從富勒烯與Aβ沒有接觸的狀態(tài)出發(fā),是否能找到更多的結(jié)合位點(diǎn)?(2）從此狀態(tài)出發(fā)富勒烯結(jié)合Aβ的動(dòng)力學(xué)過(guò)程是怎樣的?(3）富勒烯在不同位點(diǎn)上對(duì)Aβ低聚體的結(jié)構(gòu)有什么樣的影響?這些問題均有待進(jìn)一步的深入研究.

為了回答上述問題,本工作中利用分子動(dòng)力學(xué)(MD）模擬的方法,從富勒烯與Aβ沒有接觸(即二者之間的原子間的最近距離為2.0 nm）的狀態(tài)出發(fā),研究了富勒烯與Aβ42聚集體的結(jié)合及相互作用的動(dòng)力學(xué)過(guò)程.我們不僅得到了與之前研究結(jié)果吻合的位點(diǎn),而且發(fā)現(xiàn)了新的重要位點(diǎn).在核心疏水區(qū)域,觀察到C60擠入多肽表面疏水口袋的現(xiàn)象.在N端的位點(diǎn)中,富勒烯具有破壞其末端β結(jié)構(gòu)的能力.通過(guò)分析結(jié)合的動(dòng)力學(xué)特征及結(jié)合能,發(fā)現(xiàn)了富勒烯在淀粉樣多肽表面結(jié)合所特有的溝槽滾動(dòng)機(jī)制.這些結(jié)果對(duì)理解富勒烯抑制Aβ聚集的聚集機(jī)制給出了更全面的解釋,為相關(guān)抗聚集藥物分子的設(shè)計(jì)提供了有益的思路.

2 模擬方法

2.1 Aβ42與富勒烯的模擬體系

圖1 Aβ42六聚體與富勒烯模擬體系的三種初始結(jié)構(gòu)Fig.1 Three different initial conformations of Aβ42 hexamer-fullerene system

本文中的分子模擬選取Aβ42和富勒烯C60分子作為研究體系,見圖1.其中多肽體系選取1-42全長(zhǎng)Aβ的六聚體,其序列見圖1(d）.Aβ的聚集體具有多種形貌,實(shí)驗(yàn)上通過(guò)各種手段已經(jīng)獲得若干種Aβ的聚集體結(jié)構(gòu).所有結(jié)構(gòu)均具有U turn形狀且鏈間平行β片結(jié)構(gòu)的共性,但細(xì)節(jié)卻存在差異.13如N端部分的結(jié)構(gòu),有些工作認(rèn)為N端的若干殘基處于無(wú)規(guī)構(gòu)象,12,34而另一些工作則解出N端具有結(jié)構(gòu)特征,35,36這種多結(jié)構(gòu)與淀粉樣多肽聚集形貌的多樣性是吻合的.本文中采用了Ma和Nussinov36于2006年提出的Aβ1-42結(jié)構(gòu),該結(jié)構(gòu)的特征是Aβ的N端的1-16號(hào)殘基形成β片結(jié)構(gòu),而17-42號(hào)殘基的結(jié)構(gòu)則與Luhrs等12的結(jié)果相似.我們選取了該結(jié)構(gòu)的六聚體作為研究對(duì)象.相對(duì)于富勒烯分子,多肽體系的尺寸可以近似認(rèn)為是無(wú)限長(zhǎng)的原纖維.C60的結(jié)構(gòu)和參數(shù)則使用Roccatano等37于2011年得到的結(jié)果.

為了消除初始構(gòu)象對(duì)模擬采樣的影響,我們選取了三種不同的初始狀態(tài),見圖1中(a-c）.三種初始構(gòu)象中,多肽的初始結(jié)構(gòu)完全相同,C60與多肽體系的最近距離均為2 nm,但放在了不同的位置.在初始構(gòu)象(c）中,C60放置于Aβ的生長(zhǎng)軸方向,而(a,b）中則位于與(c）方向垂直的平面內(nèi).水盒子的邊界設(shè)為2 nm,由于模擬采取了周期邊界條件,C60位于相反方向的初始構(gòu)象也可以被考慮在內(nèi).從每個(gè)初始構(gòu)象出發(fā),進(jìn)行了10條模擬,共計(jì)30條.作為對(duì)照組,沒有C60的純多肽體系也單獨(dú)進(jìn)行了相同條件的模擬.

2.2 分子動(dòng)力學(xué)模擬細(xì)節(jié)及分析方法

本工作使用全原子層次的分子動(dòng)力學(xué)模擬(MD）及顯式水模型.所有的模擬均采用Gromacs 4.5.3軟件包38計(jì)算,多肽體系選用GROMOS 43a1力場(chǎng)39參數(shù),溶液分子則使用簡(jiǎn)單點(diǎn)電荷(SPC）模型.40靜電計(jì)算使用了Particle-Mesh-Ewald(PME）方法,41靜電及范德華作用的截?cái)喟霃椒謩e為0.9和1.4 nm,因此初始構(gòu)象中多肽和C60之間沒有直接相互作用.蛋白體系及溶液分子的鍵長(zhǎng)分別使用LINCS算法42及SETTLE算法43加以約束,故積分步長(zhǎng)設(shè)為2 fs.整個(gè)模擬過(guò)程中,溫度始終保持310 K,壓強(qiáng)為一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)大氣壓.由于不同的模擬中多肽與C60結(jié)合的過(guò)程不同,因此模擬的時(shí)間也各不相同.所有的模擬都在二者緊密結(jié)合不再分開后至少延長(zhǎng)5 ns,故模擬時(shí)間從10 ns到40 ns不等,詳情見后,而對(duì)照組的多肽體系則模擬了50 ns.

所有的軌跡均采用VMD軟件仔細(xì)加以觀察監(jiān)測(cè).所有的分析均采用AmberTool2013工具包44內(nèi)提供的工具完成,結(jié)合位點(diǎn)的分析統(tǒng)一采用每條軌跡中C60結(jié)合多肽后的最后5 ns軌跡.二級(jí)結(jié)構(gòu)傾向性(SSP）分析采用DSSP算法;45而分子的溶劑可及表面積(SASA）使用Connolly46提出的方法.Cluster構(gòu)象分析則使用Averagelinkeage算法,47對(duì)應(yīng)的代表結(jié)構(gòu)均為cluster分析方法得到的代表構(gòu)象(Representative structure）.在所有的分析中,水分子均已剔除.

為了計(jì)算富勒烯的結(jié)合能,我們運(yùn)用了分子力學(xué)-泊松波爾茲曼表面積(MM-PBSA）方法,并使用廣義Born模型(GB model）方法計(jì)算溶劑化效應(yīng).48MM-PBSA計(jì)算方法見下述公式(1）.體系的結(jié)合能ΔG等于復(fù)合物自由能Gcomplex減去對(duì)應(yīng)單體的自由能Gligand和Greceptor,故結(jié)合能包括(見下面公式(2））:真空中的范德華相互作用能ΔEvdW和靜電能ΔEcoul、極性和非極性溶劑化自由能(ΔGGB,ΔGsurf）以及振動(dòng)熵ΔS的貢獻(xiàn).在模擬中,由于富勒烯上的碳原子不帶電,故第二項(xiàng)靜電能為零;第三項(xiàng)通過(guò)GB方法計(jì)算得到,而第三項(xiàng)與第四項(xiàng)之和則為總的溶劑化效應(yīng).Amber的MM-PBSA方法中計(jì)算振動(dòng)熵的算法并不適用于本工作的體系,44且以前類似的工作中也略去這一項(xiàng)的貢獻(xiàn),33故本文中不予考慮.所有力場(chǎng)參數(shù)均被轉(zhuǎn)化為Amber格式以保持一致,并利用idecomp方法計(jì)算了每個(gè)殘基對(duì)結(jié)合能的貢獻(xiàn).49

3 結(jié)果與討論

3.1 結(jié)合的動(dòng)力學(xué)過(guò)程

在所有的模擬中,不論是否存在C60,Aβ的主鏈β結(jié)構(gòu)均沒有發(fā)生嚴(yán)重破壞,絕大多數(shù)主鏈間氫鍵在模擬的過(guò)程中保持穩(wěn)定.在所有的模擬中,富勒烯經(jīng)過(guò)不同的時(shí)間,最終均能夠到達(dá)多肽表面,并且與其緊密結(jié)合.在我們的工作中,當(dāng)富勒烯與多肽重原子之間的最近距離小于0.4 nm(略大于兩個(gè)碳原子的vdW半徑之和）并持續(xù)1 ns以上時(shí),認(rèn)為富勒烯已結(jié)合在多肽上.圖2展示了不同軌跡中二者結(jié)合所需的時(shí)間.為了便于對(duì)比,此圖中將不同軌跡按照結(jié)合所需時(shí)間的長(zhǎng)短進(jìn)行了排序.可以看出不同的模擬中,結(jié)合所需的時(shí)間差別很大,從約1 ns到大于30 ns不等.圖2中三種不同線型的曲線分別表示不同的初始構(gòu)象,可以看出結(jié)合的時(shí)間與系統(tǒng)的初始構(gòu)象沒有關(guān)系.這從一個(gè)方面說(shuō)明我們的模擬采樣較好.

圖2 不同模擬軌跡中C60結(jié)合到Aβ多肽上所用的時(shí)間Fig.2 Time for fullerene binding to Aβ hexamer in different simulated trajectories

通過(guò)觀察所有的模擬軌跡,發(fā)現(xiàn)C60在靠近多肽的初期,會(huì)在其表面發(fā)生小幅度的滾動(dòng),有時(shí)還可以離開多肽.經(jīng)過(guò)若干次的嘗試過(guò)程,最終C60將到達(dá)某個(gè)位置與蛋白緊密結(jié)合.一旦到達(dá)這種結(jié)合狀態(tài),富勒烯的運(yùn)動(dòng)幅度將大大降低,通常只能在附近0.5 nm的幅度內(nèi)搖擺,不會(huì)再離開多肽表面.圖3展示了兩條不同的模擬軌跡中系統(tǒng)的構(gòu)象變化(a,b）及對(duì)應(yīng)軌跡中C60與多肽最近原子之間的距離.我們分別計(jì)算了多肽與富勒烯復(fù)合物體系(實(shí)線）和多肽(虛線）的均方根偏差(RMSD）,而參考結(jié)構(gòu)為最后5 ns模擬的cluster聚類代表結(jié)構(gòu).可以看出多肽的結(jié)構(gòu)一直處于平均約0.3 nm的漲落之中;整個(gè)體系的均方根偏差在開始時(shí)變動(dòng)幅度較大,而在后半段中則與代表多肽的紅線幾乎重合,這說(shuō)明結(jié)合前C60在不斷移動(dòng),而結(jié)合后則穩(wěn)定在其結(jié)合位點(diǎn)附近,只發(fā)生很小幅度的漲落.而從圖3(c,d）中可以看出,在最終結(jié)合前,富勒烯分子可以不止一次地靠近多肽,并且再次離開.這說(shuō)明C60在蛋白表面的結(jié)合是具有選擇性的,不夠好的結(jié)合位置將被拋棄.在所有的模擬中,這種緊密結(jié)合狀態(tài)至少可以穩(wěn)定存在5 ns.我們從每個(gè)初始構(gòu)象隨機(jī)選擇一條軌跡,在其結(jié)合到多肽之后,繼續(xù)延長(zhǎng)30 ns的模擬,結(jié)果顯示在這個(gè)時(shí)間尺度內(nèi)C60仍然不會(huì)離開多肽表面.因此我們認(rèn)為達(dá)到了這種穩(wěn)定結(jié)合態(tài)后,系統(tǒng)的狀態(tài)將趨于平衡,結(jié)合位點(diǎn)不會(huì)再發(fā)生大幅度變化,將該結(jié)合位置定義為C60結(jié)合的一個(gè)位點(diǎn).這說(shuō)明一定時(shí)間長(zhǎng)度的模擬即可表征這種結(jié)合態(tài),下文中針對(duì)結(jié)合態(tài)的分析均基于穩(wěn)定結(jié)合后的最后5 ns數(shù)據(jù).

3.2 結(jié)合位點(diǎn)的分類及結(jié)合能

本工作的關(guān)注點(diǎn)之一為采用分子動(dòng)力學(xué)模擬的方法研究富勒烯與Aβ的結(jié)合位點(diǎn),此外,兩者的結(jié)合機(jī)制也是研究的重點(diǎn).將所有30條模擬的結(jié)合態(tài)中C60每個(gè)時(shí)刻的質(zhì)心位置計(jì)算出來(lái),一起顯示在多肽表面,結(jié)果見圖4.圖中多肽結(jié)構(gòu)選取的是對(duì)照組中50 ns模擬的cluster中心結(jié)構(gòu),而每個(gè)C60的質(zhì)心則用一個(gè)紫色點(diǎn)顯示.可以看出結(jié)合位點(diǎn)具有下述特征.首先,結(jié)合位點(diǎn)并非隨機(jī)分布在多肽表面,而是集中在某幾類區(qū)域;其它位置則很少出現(xiàn)或完全沒有.如Aβ的核心疏水區(qū)(CHC）17-21號(hào)殘基、βturn位置附近(22-30號(hào)殘基）、C端的纖維生長(zhǎng)方向上等.這意味30個(gè)結(jié)合位點(diǎn)可以歸為有限的幾類.我們根據(jù)C60結(jié)合位置附近的氨基酸序號(hào),將其分為如下6類位點(diǎn):N-terminal 1-5位點(diǎn)、Y10-H14位點(diǎn)、CHC位點(diǎn)(16KLVFFA21）、Turn 24-26位點(diǎn)、Turn 27-31位點(diǎn)、C-terminal位點(diǎn)等.另有2條軌跡中的結(jié)合位置只出現(xiàn)了一次,分別位于F4H6附近及N端7號(hào)氨基酸附近,故不予歸類而統(tǒng)稱others.所有類型的結(jié)合位點(diǎn)均在圖4中用箭頭標(biāo)明.此處CHC位點(diǎn)與前人得到的結(jié)果是一致的,而由于對(duì)方使用的Aβ結(jié)構(gòu)中N端1-16號(hào)殘基并非β結(jié)構(gòu)的緣故,其N端區(qū)域的位點(diǎn)與我們的結(jié)果沒有可對(duì)照性.33

圖3 Aβ-fullerene體系的均方根偏差及Aβ和C60最小距離(d min）隨時(shí)間演化Fig.3 Time evolution of RMSD ofAβ-fullerene complex and the minimum distance between Aβ and C60(d min）

圖4 所有的結(jié)合位點(diǎn)上C60的質(zhì)心位置分布Fig.4 Positions of fullerene′s mass center at all binding sites

其次,結(jié)合位點(diǎn)的分布表明了結(jié)合位點(diǎn)的振動(dòng)范圍.在多數(shù)模擬軌跡中,C60的擺動(dòng)幅度極小,如CHC位點(diǎn)及C-terminal位點(diǎn);而N-terminal位點(diǎn)看似擺動(dòng)幅度較大,實(shí)則是多肽末端自身的振動(dòng)所導(dǎo)致的,故該位點(diǎn)實(shí)際的擺動(dòng)幅度與CHC位點(diǎn)類似;有趣的是Turn端兩個(gè)位點(diǎn)及Y10-H14位點(diǎn),富勒烯的晃動(dòng)幅度明顯高于其它位點(diǎn).C60的擺動(dòng)方向沿著纖維的生長(zhǎng)方向,由于淀粉樣聚集體結(jié)構(gòu)中的重復(fù)性,當(dāng)其擺動(dòng)時(shí),C60在肽鏈間的相同位置平移,這種平移運(yùn)動(dòng)并不需要克服大的能量勢(shì)壘.

另外,通過(guò)觀察所有軌跡,發(fā)現(xiàn)除一條軌跡外,幾乎不存在結(jié)合后結(jié)合位置跨位點(diǎn)的移動(dòng).在僅有的一個(gè)例外中,觀察到富勒烯從C-terminal位點(diǎn)緩慢轉(zhuǎn)移到了CHC位點(diǎn),并穩(wěn)定于此.考慮到C-terminal位點(diǎn)與CHC位點(diǎn)在空間位置上距離較近,這一結(jié)果并不意外.沒有出現(xiàn)大規(guī)模的跨位點(diǎn)轉(zhuǎn)移行為一方面說(shuō)明了位點(diǎn)分類的合理性,另一方面也暗示各個(gè)結(jié)合位點(diǎn)之間存在一定的能量勢(shì)壘,C60想要從一個(gè)結(jié)合的好的位置通過(guò)表面滾動(dòng)到達(dá)另一個(gè)較好的位點(diǎn),要跨越的能量代價(jià)較大,故極少觀察到這種現(xiàn)象.

為了進(jìn)一步理解各個(gè)結(jié)合位點(diǎn)之間的差異,同時(shí)分析各種相互作用在結(jié)合機(jī)制中所起的作用,我們計(jì)算了所有位點(diǎn)的結(jié)合能,結(jié)果見表1.在所有的位點(diǎn)中,范德華作用對(duì)于穩(wěn)定結(jié)合起主導(dǎo)作用,而因?yàn)樵O(shè)定所有C60上的碳原子電荷為零,故二者間沒有直接靜電作用項(xiàng).溶劑的效應(yīng)由GB作用(ΔGGB）和表面能(ΔGsurf）共同構(gòu)成,總值大于零,這與富勒烯的強(qiáng)疏水性是吻合的.從總的結(jié)合能可以看出結(jié)合最強(qiáng)的兩個(gè)位點(diǎn)為Turn 27-31和CHC位點(diǎn);其它類的兩個(gè)位點(diǎn)的結(jié)合能也較強(qiáng).N-terminal、Y10-H14及C-terminal這三個(gè)位點(diǎn)的結(jié)合能則很接近,Turn 24-26位點(diǎn)最弱.另外結(jié)合能的均方差較小,這表明每個(gè)位點(diǎn)分類中的各個(gè)軌跡之間的結(jié)合能相近,從另一個(gè)方面再次論證了位點(diǎn)分類的合理性.在前人的工作中,33CHC位點(diǎn)是結(jié)合能最強(qiáng)的位點(diǎn),這與我們的結(jié)論是基本吻合的,而數(shù)值上的不同則歸因于所使用的力場(chǎng)之間的巨大差異.

為了進(jìn)一步驗(yàn)證模擬不受初始構(gòu)象的影響,我們將三種初始構(gòu)象所得到各個(gè)結(jié)合位點(diǎn)的數(shù)量列出,結(jié)果見圖5,可以看出從不同初始構(gòu)象出發(fā)能得到同一個(gè)位點(diǎn),從同一個(gè)初始構(gòu)象出發(fā)可得到多類位點(diǎn),說(shuō)明結(jié)合位點(diǎn)對(duì)初始構(gòu)象的依賴性不大.這進(jìn)一步說(shuō)明了模擬采樣的結(jié)果較好.

3.3 富勒烯對(duì)Aβ42核心疏水區(qū)間結(jié)構(gòu)的影響

Kim和Lee32的實(shí)驗(yàn)工作中觀測(cè)到了C60對(duì)Aβ聚集有抑制效果.因此我們的目的并非僅限于分析結(jié)合位點(diǎn),而是期望能夠理解其抑制聚集的機(jī)制.他人的模擬工作中,限于分子對(duì)接方法的局限性,并不能全面回答這一問題.33在我們的模擬工作中雖然沒有看到C60大規(guī)模破壞Aβ結(jié)構(gòu)的現(xiàn)象,然而,在CHC位點(diǎn)的一條軌跡中,我們觀察到了富勒烯擠入CHC位置附近疏水口袋的趨勢(shì).為了更加詳細(xì)地研究這個(gè)現(xiàn)象,我們將CHC位點(diǎn)的五條模擬軌跡在C60結(jié)合后延長(zhǎng)了20 ns.如圖6(a-d）所示,當(dāng)碳球結(jié)合到CHC位點(diǎn)后,碳球逐漸擠入兩層β片之間,與位于從F19到I32的整個(gè)β-turn區(qū)域的氨基酸均有或多或少的接觸,尤其是側(cè)鏈方向朝向內(nèi)部的F19、A21、K28、A30及I32,并降低這一帶殘基二級(jí)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性.通過(guò)分析碳球的溶劑可及表面積,可以發(fā)現(xiàn)C60在～1.5 ns時(shí)結(jié)合到該位點(diǎn),之后富勒烯通過(guò)不斷調(diào)整位置,擠入多肽CHC區(qū)域,期間伴隨著其SASA的變化,最后溶劑可及表面積穩(wěn)定在約1.2 nm2,如圖6(e）中的紅線所示.可見富勒烯確實(shí)有擠入Aβ結(jié)構(gòu)內(nèi)部的趨勢(shì).從圖6(c,d）中可以看出,在20和30 ns時(shí)C60對(duì)多肽turn端結(jié)構(gòu)的破壞作用大于10 ns時(shí)的,turn處的幾個(gè)殘基偏離附近的多肽而靠向富勒烯分子.并非所有CHC位點(diǎn)均存在這種現(xiàn)象,通過(guò)計(jì)算另外四條CHC位點(diǎn)軌跡中C60的SASA(圖6(e）中的藍(lán)、黑、灰、綠線）,可以看出其它模擬中C60的SASA在結(jié)合后保持穩(wěn)定,并沒有顯著降低趨勢(shì).

表1 富勒烯在每個(gè)位點(diǎn)的結(jié)合能Table 1 Binding energy of fullerene at each binding site

圖5 從不同初始構(gòu)象出發(fā)得到的各結(jié)合位點(diǎn)軌跡數(shù)目Fig.5 Counts of trajectories leading to different binding sites,starting from different initial states

這一鉆孔現(xiàn)象為我們提供了一種抑制聚集機(jī)制的可能解釋:即由于CHC位點(diǎn)上氨基酸的疏水性,多肽能與C60之間產(chǎn)生極佳的結(jié)合性.當(dāng)C60結(jié)合到該位點(diǎn)時(shí),擠入該疏水口袋會(huì)提供更好的疏水匹配,減少疏水表面積,從而提高溶劑分子的構(gòu)象熵.且二者之間的結(jié)合很緊密,因此不會(huì)大幅度降低側(cè)鏈間的疏水堆積效應(yīng).考慮到CHC區(qū)域?qū)β聚集的關(guān)鍵作用,50C60擠入這一位置將會(huì)對(duì)原纖維的生長(zhǎng)產(chǎn)生阻礙效應(yīng).

圖6 C60擠入Aβ原纖維核心疏水區(qū)域的趨勢(shì)Fig.6 Tendency for C60to insert into the CHC region of Aβ protofibril

圖7 C60對(duì)Aβ蛋白N端β片結(jié)構(gòu)的破壞Fig.7 Disruption of the β-sheet structure of Aβ peptides′N-terminal region by C60

3.4 富勒烯對(duì)蛋白N端二級(jí)結(jié)構(gòu)的破壞

在所有三十條模擬中,沒有觀察到大幅度的Aβ二級(jí)結(jié)構(gòu)破壞.然而在N-terminal位點(diǎn)的某條軌跡中,發(fā)現(xiàn)了富勒烯對(duì)Aβ結(jié)構(gòu)的局部破壞現(xiàn)象,其結(jié)果見圖7.其中圖7(a-d）展示了不同時(shí)刻系統(tǒng)的構(gòu)象,在t=21 ns時(shí),C60開始結(jié)合到該位點(diǎn),此時(shí)2-6號(hào)的氨基酸仍然保持其β二級(jí)結(jié)構(gòu);隨著時(shí)間演進(jìn),C60將Aβ最外側(cè)的鏈逐漸拉開,一個(gè)個(gè)的破壞其鏈間的主鏈氫鍵,從而破壞其β結(jié)構(gòu),從t=29 ns時(shí)刻可以看到這種破壞作用已經(jīng)開始發(fā)生,對(duì)氫鍵有了一定程度的破壞.為了進(jìn)一步觀察這種破壞效應(yīng),將該模擬延長(zhǎng)了30 ns,結(jié)果發(fā)現(xiàn)這個(gè)時(shí)間尺度內(nèi)破壞效應(yīng)沒有進(jìn)一步增加的趨勢(shì).圖7(e）中展示了最外側(cè)Aβ1-10號(hào)殘基的β片百分比隨時(shí)間的變化,在尚未有直接作用前,3-10號(hào)殘基均以β片構(gòu)象為主,而富勒烯與多肽結(jié)合后,3-5號(hào)殘基的β片依次隨時(shí)間降低,最終完全破壞;而7-9號(hào)殘基的β結(jié)構(gòu)亦略有下降.而在30-60 ns時(shí)間段,β結(jié)構(gòu)沒有顯著的變化.

這一β結(jié)構(gòu)破壞過(guò)程完整地展示了一種富勒烯破壞Aβ聚集體結(jié)構(gòu)的機(jī)制:首先結(jié)合至Aβ聚集體生長(zhǎng)面的N端殘基,進(jìn)而與N端殘基的鏈間氫鍵競(jìng)爭(zhēng),逐步破壞氫鍵,拉開β片;破壞幾個(gè)氫鍵后,就擠入兩條肽鏈之間,阻止氫鍵的復(fù)原.由于Aβ自身結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性和短模擬時(shí)間的局限性,模擬尚不能采樣到破壞整條Aβ的二級(jí)結(jié)構(gòu)的事件,這可能與模擬中所采用的富勒烯的低濃度有關(guān),在實(shí)驗(yàn)中,當(dāng)C60的濃度很低時(shí),其抑制聚集的效果亦不顯著.可以推想隨著富勒烯濃度的增高,多個(gè)C60會(huì)同時(shí)結(jié)合到這一位點(diǎn),必將大大增強(qiáng)對(duì)主鏈氫鍵的破壞作用,同時(shí)多個(gè)C60的結(jié)合可以更有效地阻止β結(jié)構(gòu)的復(fù)原.這一抑制機(jī)制很可能與上節(jié)中CHC位點(diǎn)的機(jī)制相輔相成,從不同路徑破壞Aβ自身的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性,從而發(fā)揮其抑制聚集的效應(yīng).

3.5 富勒烯在淀粉樣纖維表面的溝槽滾動(dòng)機(jī)制

由于淀粉樣纖維中結(jié)構(gòu)單元的重復(fù)性,聚集蛋白或多肽能夠形成具有周期性的表面形貌.當(dāng)某些位置的氨基酸主鏈及側(cè)鏈處于一種特定的構(gòu)象時(shí),將形成沿著生長(zhǎng)軸方向的溝槽,其大小恰好可以容納富勒烯分子.我們?cè)贏β42聚集體表面的Turn 27-31位點(diǎn)和Y10-H14位點(diǎn)觀察到了這一溝槽,見圖8(a,c）.在Turn 27-31位點(diǎn)N27、K28及G29的主鏈形成一個(gè)很好的彎曲,配合N27指向外側(cè)的側(cè)鏈,恰好產(chǎn)生一個(gè)能夠容納C60的弧形區(qū)域.由于G29、A30都是沒有側(cè)鏈或側(cè)鏈很小的殘基,且甘氨酸具有很強(qiáng)的主鏈構(gòu)象柔性,故這一位置主鏈的柔軟和側(cè)鏈的缺失為形成半徑合適的溝槽提供了很好的幫助.而在Y10-H14位點(diǎn),則通過(guò)指向兩側(cè)的Y10和V12的側(cè)鏈形成這一溝槽,H14的側(cè)鏈則從旁輔助.Y10與V12均具有很強(qiáng)的疏水性,且Y10的側(cè)鏈芳香環(huán)能夠與富勒烯直接接觸,通過(guò)芳香環(huán)堆積作用形成較強(qiáng)的相互作用,故這一位點(diǎn)的溝槽更多的是靠側(cè)鏈的疏水作用及特異相互作用實(shí)現(xiàn)的.

通過(guò)觀察模擬軌跡,發(fā)現(xiàn)在這兩個(gè)位點(diǎn)的模擬中,C60的晃動(dòng)幅度比其它位點(diǎn)要大,可以在同一氨基酸位置從鏈二到鏈五來(lái)回?cái)[動(dòng),從圖4位點(diǎn)分布中可以證實(shí)這一點(diǎn),在這兩個(gè)位點(diǎn)大量紫色的點(diǎn)沿著纖維生長(zhǎng)方向排布在多肽表面,形成狹長(zhǎng)的帶狀分布,而與其它位點(diǎn)的質(zhì)心分布形式大不相同.為了進(jìn)一步分析這種溝槽內(nèi)的滾動(dòng)現(xiàn)象,我們分析了每個(gè)殘基所有位點(diǎn)的平均結(jié)合能,見圖8(e）,其中紅色的區(qū)域表示結(jié)合能強(qiáng),藍(lán)色則反之.可以看出在Y10-H14及N27-I31殘基位置形成了獨(dú)特的縱向帶狀條紋.為了便于理解,圖8(b）和(d）中將對(duì)應(yīng)位點(diǎn)附近每個(gè)殘基按照其平均結(jié)合能著色,對(duì)應(yīng)氨基酸的側(cè)鏈已標(biāo)明.一個(gè)有趣的現(xiàn)象是在這兩個(gè)位點(diǎn)中,處于中部的肽鏈對(duì)應(yīng)殘基的結(jié)合能強(qiáng)于兩側(cè)末端肽鏈,這表明位于這一溝槽內(nèi)的富勒烯滾動(dòng)時(shí),將不傾向于到達(dá)末端而是偏好于停留在中部.末端這一能量勢(shì)壘將阻止C60從纖維的中部跨越到生長(zhǎng)面上,從而隔離開這兩個(gè)位點(diǎn)與生長(zhǎng)面上的位點(diǎn),如CHC和C-terminal位點(diǎn).

圖8 C60結(jié)合到Aβ原纖維表面的溝槽部位的傾向Fig.8 Tendency of C60binding to the groove on the surface of Aβ protofibril

這種沿著蛋白表面溝槽滾動(dòng)的現(xiàn)象是淀粉樣聚集蛋白所獨(dú)有的特征;因?yàn)橹挥兄芷谥貜?fù)性的結(jié)構(gòu),才能形成可延伸的重復(fù)側(cè)鏈排布,從而形成這種溝槽.C60作為典型的完全對(duì)稱的球狀小分子,在周期性側(cè)鏈形成的表面溝槽內(nèi)滾動(dòng)時(shí),幾乎不存在能量勢(shì)壘,從而能夠很輕易地移動(dòng).考慮到所有的淀粉樣聚集蛋白均能在表面形成或多或少的各種半徑的溝槽,這一特殊的“溝槽滾動(dòng)機(jī)制”具有普遍意義,并在預(yù)測(cè)其它聚集多肽與碳球類衍生物的聚集行為及結(jié)合位點(diǎn)時(shí)提供一定的幫助.

4 結(jié)論

本工作采用分子動(dòng)力學(xué)模擬系統(tǒng)地研究了富勒烯在Aβ42聚集體表面的結(jié)合過(guò)程,并得到了多類結(jié)合位點(diǎn).C60與Aβ的結(jié)合并不是隨機(jī)的,而是在經(jīng)歷一系列嘗試過(guò)程后,最終找到某個(gè)穩(wěn)定的結(jié)合位點(diǎn).絕大多數(shù)情況下結(jié)合后C60將穩(wěn)定在結(jié)合位點(diǎn)附近,而某幾類位點(diǎn)中富勒烯能夠沿著纖維生長(zhǎng)軸方向大幅度滾動(dòng).共得到六類主要結(jié)合位點(diǎn),其中CHC位點(diǎn)及Turn 27-31位點(diǎn)具有最強(qiáng)的結(jié)合穩(wěn)定性.二者之間的結(jié)合通過(guò)范德瓦爾斯相互作用穩(wěn)定,而溶劑化效應(yīng)則起相反作用.

在兩個(gè)位點(diǎn)中觀察到了C60對(duì)Aβ二級(jí)結(jié)構(gòu)的破壞.其一位于核心疏水區(qū)域,C60具有擠入多肽兩片β片中間的趨勢(shì),從而降低附近殘基的β結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性,這一位點(diǎn)不但在前人的結(jié)果中也發(fā)現(xiàn)過(guò),并且早已被認(rèn)為對(duì)聚集過(guò)程具有重要作用;其二位于N端末尾,C60能夠破壞纖維生長(zhǎng)端Aβ的3-5號(hào)殘基的主鏈氫鍵,從而破壞其β片結(jié)構(gòu),這一直接破壞過(guò)程對(duì)于理解富勒烯抑制Aβ聚集機(jī)制提供了很好的解釋.實(shí)際過(guò)程中兩種機(jī)制很可能相輔相成,共同發(fā)揮抑制聚集的作用.

另外,發(fā)現(xiàn)了富勒烯與淀粉樣多肽聚集體結(jié)合的一種特殊機(jī)制,即溝槽滾動(dòng)機(jī)制.由于淀粉樣聚集體的結(jié)構(gòu)重復(fù)性,蛋白表面沿纖維生長(zhǎng)方向能形成特定形貌的溝槽,而富勒烯因其結(jié)構(gòu)的對(duì)稱性,能夠在槽內(nèi)滾動(dòng).這一機(jī)制有助于預(yù)測(cè)富勒烯在其它淀粉樣肽聚集體表面的結(jié)合位點(diǎn)及其結(jié)合行為.

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