牛血清白蛋白色譜柱的制備及對阿司匹林的含量測定

唐玲利 韋室百 黃東萍 黃明立 阮 沖

1.廣西醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，廣西南寧 530021；2.廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部，廣西南寧 530021

分子生物色譜法（MBC）是20世紀(jì)80年代中后期逐漸發(fā)展起來的以酶、受體、抗體、傳輸?shù)鞍椎壬锎蠓肿訛楣潭ㄏ嗟囊活惿V法，是基于生物大分子的特異性相互作用原理進(jìn)行分離純化具有活性的化合物或測定生化參數(shù)的一項(xiàng)新興技術(shù)[1]。藥物作為一類重要的生物活性物質(zhì)與血漿蛋白存在可逆性的結(jié)合平衡，藥物分子通過血漿白蛋白的運(yùn)輸?shù)竭_(dá)受體部位發(fā)生藥理作用，而藥物分子在體內(nèi)與血漿蛋白的相互作用是其發(fā)揮藥理作用的前提，因此可以通過血漿白蛋白生物色譜篩選藥物中的活性成分。付強(qiáng)等[2]通過自制人血清白蛋白色譜柱成功對DL（±）色氨酸進(jìn)行了手性分離；Bentucci等[3]制備出的血清白蛋白色譜柱，不僅可篩選出藥物活性成分，還可通過體外實(shí)驗(yàn)反映藥物-血清白蛋白的相互作用。蔡漢寧等[4]制備出核心組蛋白色譜柱作用于其活性物質(zhì)，至少篩選出9種組蛋白作用蛋白。與傳統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)方法相比，分子生物色譜法具有高度專一性、分離速度更快、容易自動化操作、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)[5]。

由于人血清白蛋白價格昂貴，用于制備生物色譜柱成本太高，有學(xué)者利用牛血清白蛋白與人血清白蛋白結(jié)構(gòu)相似的特點(diǎn)，制備成牛血清白蛋白色譜柱用于中藥活性成分的分離測定。Tan等[6]通過制備的牛血清蛋白生物整體柱，成功的分離出當(dāng)歸的活性成分，并考察了當(dāng)歸提取液在該整體柱上保留的影響。本文主要通過將硅膠氨基功能化與BSA共價鍵結(jié)合合成BSA固定相，制備BSA生物色譜柱，并選擇了阿司匹林（ASP）作為與BSA結(jié)合的對象來驗(yàn)證BSA色譜柱的性能。ASP作為一種代表性藥物，不僅具有卓越的消炎、退熱、止痛能力，研究表明它還可以協(xié)同干擾素抑制肝細(xì)胞癌生長轉(zhuǎn)移[7]，抑制宮頸癌 Hela細(xì)胞增殖[8]，預(yù)防妊娠期高血壓[9]等。通過對ASP及其腸溶片的分離測定，可以進(jìn)一步探討生物色譜柱在藥物有效成分分離測定中的應(yīng)用前景。

1 儀器與材料

6010紫外可見分光度計（安捷倫科技公司，上海）；LC-10Tvp高效液相色譜儀（日本島津公司）；spectrum 100傅立葉變換紅外光譜儀（美國penkim Elmer儀器有限公司）；Bio-Rad垂直電泳槽、電泳儀（美國 Bio-Rad公司）。

3-氨基丙基三甲氧基硅烷（APTS）（97%，上海晶純試劑有限公司，批號：15122）；N，N′-琥珀酰亞胺碳酸酯（98%，阿拉丁公司，批號：25231）；考馬斯亮藍(lán)G250（沃凱，批號：WB20091102）；BSA（Solarbio）；硅膠Sepra Silica （粒徑 50 μm，phenomenex 美國）；ASP 標(biāo)準(zhǔn)品（Purity>99%）；ASP 腸溶片（50 mg/片，國藥準(zhǔn)字H43021814）；四甲基乙二胺（TEMED）、丙烯酰胺溶液、甲叉雙丙烯酰胺、過硫酸胺、Tris堿、甘氨酸、十二烷基硫酸鈉（SDS）均來自北京索萊寶。

2 方法與結(jié)果

2.1 BSA色譜柱的制備

取硅膠 2 g（平均粒徑為 50 μm，孔徑 46 ?（1 ?=0.1 nm），比表面積為518 m2/g），加入適量甲苯回流除去殘留水分，按10 μmol/m2加入3-氨丙基三甲基硅烷反應(yīng)8 h得到氨丙基硅膠，過濾，分別用甲苯和甲醇洗滌，真空干燥后置干燥器保存。取氨丙基硅膠2 g，加入乙腈 5 mL和 N，N′-琥珀酰亞胺碳酸酯 2 g，于30℃反應(yīng)24 h，過濾后分別用乙腈、甲醇洗滌得到活化硅膠。取制備得的活性硅膠1.5 g，加入到25 mmol/L（pH=6.6）的磷酸鹽緩沖液中，再加入適量 BSA，30℃下攪拌反應(yīng)20 h，過濾后依次用水及5%乙醇多次洗滌，得到BSA固定相。將制備好的BSA固定相用緩沖液勻漿后注入不銹鋼柱（4.5 nm×150 nm）中，并抽真空壓緊柱，制備得到BSA色譜柱。

2.2 傅里葉紅外光譜（FTIR）驗(yàn)證活化硅膠功能基團(tuán)

用溴化鉀壓片法制備活化硅膠樣品，進(jìn)行FTIR分析。FTIR分析結(jié)果見圖1，硅膠（a）和活化硅膠（b）共有的吸收峰有：1099、1103 cm-1處的非對稱伸縮振動，指紋區(qū)800 cm-1的對稱伸縮振動和470 cm-1的彎曲振動，均為硅膠的主要結(jié)構(gòu)Si-O的特征譜帶；與硅膠（a）相比，活化硅膠（b）增加了伯胺（-NH2）的吸收峰 1402、1561 cm-1，2928 cm-1峰為亞甲基的不對稱變形振動峰，說明硅膠上中有亞甲基的存在，表明APTS已結(jié)合在硅膠上。由此可見，活化硅膠成功連接上了氨基功能基團(tuán)。

圖1 硅膠和活化硅膠的紅外光譜圖

2.3 BSA與活化硅膠結(jié)合量

按硅膠與 BSA 質(zhì)量比 8∶1、4∶1、2∶1、1∶1 進(jìn)行表面覆蓋率的測定。稱取四份硅膠，每份0.5000 g，分別與0.0625、0.1251、0.2500、0.5000 g BSA 反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后各取100 μL洗滌液采用考馬斯亮藍(lán)染色法[10]測定其中BSA含量，用BSA加入量與反應(yīng)剩余BSA量之差計算出結(jié)合量，按照下列公式計算出BSA的表面覆蓋率：表面覆蓋率=結(jié)合蛋白的物質(zhì)的量（μmol）/活化硅膠質(zhì)量（g）。結(jié)果顯示，活化硅膠與BSA質(zhì)量比為4∶1時，BSA結(jié)合量已基本達(dá)到飽和，加大劑量并不能明顯的增加鍵合量，表明BSA表面覆蓋率可能受空間位阻大小的影響。見圖2。

圖2 活化硅膠與BSA不同配比下的BSA表面覆蓋率

2.4 BSA固定相結(jié)合ASP研究

精密稱取 ASP 對照品 50 mg，用冰醋酸－甲醇（1∶10）溶液稀釋至50 mL，搖勻，得到ASP標(biāo)準(zhǔn)溶液。取ASP標(biāo)準(zhǔn)溶液 1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL 用冰醋酸－甲醇（1∶10）溶液稀釋至 10 mL，各取 10 μL 用于 HPLC。色譜條件：流動相：甲醇-20%冰醋酸（3∶1）；流速：1 mL/min；色譜柱：C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱溫：30℃；紫外檢測器，λ=237 nm。得到ASP標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：Y=97 941X+37 178，r=0.9997，其中 Y為峰面積，X為 ASP濃度（μg/μL）。

稱取一定量的硅膠和BSA固定相勻漿法分別填裝于兩根柱子中，精密稱定適量的ASP，用中性乙醇溶解后緩緩傾注入色譜柱中，用蒸餾水洗滌柱子，接收洗滌液，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算洗脫液中ASP含量，ASP加入量與洗脫液中ASP含量之差得到固定相對ASP的結(jié)合量，見圖3。對比硅膠固定相和BSA固定相對ASP的結(jié)合量，ASP與BSA固定相結(jié)合量明顯大于與硅膠固定相結(jié)合量，證明與ASP結(jié)合的主要是BSA而不是硅膠。

圖3 硅膠固定相、BSA固定相與阿司匹林結(jié)合量的比較

2.5 BSA色譜柱性能考察

2.5.1 BSA固定相的pH值穩(wěn)定性 分別配制pH=4.5、6.5、7.5、8.0 的 KH2PO4-K2HPO4溶液（25 mmol/L），用上述四種緩沖液各10 mL分別洗脫BSA色譜柱，接收洗脫液，測定洗脫液中BSA含量，考察BSA固定相在不同pH值緩沖液中的穩(wěn)定性。

經(jīng)測定洗脫液中不含BSA，表明通過改變緩沖液的pH值并不能洗脫鍵合在硅膠上的BSA，該BSA色譜柱在pH 4.5～8.0之間穩(wěn)定性良好。

2.5.2 BSA固定相穩(wěn)定時間 配制濃度為 2、4、6、8、10 mg/mL的ASP標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，以BSA生物色譜做分離測定，繪制ASP標(biāo)準(zhǔn)曲線。色譜條件：流動相：pH 7.5磷酸鹽緩沖液；流速：0.5 mL/min；色譜柱：BSA生物色譜柱（4.5 nm×150 nm，50 μm）；紫外檢測器，λ=237 nm。得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：Y=694 217X-11 080，r=0.9996，其中 Y 為峰面積，X 為 ASP 濃度（μg/μL）。

通過ASP的含量變化評價BSA固定相穩(wěn)定時間：在BSA色譜柱制備完成后進(jìn)行測定，取2 mg/mL ASP標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)樣10 μL，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出ASP含量，前8天ASP含量變化不大，標(biāo)準(zhǔn)偏差：S1=0.3525，第9天開始 ASP含量急劇下降，考察到第10天，算出標(biāo)準(zhǔn)偏差：S2=7.238，結(jié)果見圖4。由此可看出：用自制的BSA色譜柱測定ASP標(biāo)準(zhǔn)品，在8 d內(nèi)測定結(jié)果相差不大，表明該色譜柱穩(wěn)定性較好。

圖4 BSA色譜柱穩(wěn)定時間考察

2.6 用BSA色譜柱分離阿司匹林腸溶片

取阿司匹林腸溶片10片，精密稱定，置研缽中，研細(xì)，稱取適量的粉末（約相當(dāng)于 ASP 0.2 g）于燒杯中，加無水乙醇40 mL溶解，用pH 7.5磷酸鹽緩沖液定容至100 mL，充分搖勻，快速過濾，棄去初濾液，取續(xù)濾液，即得到樣品溶液。按照“2.5.2”項(xiàng)下色譜條件上樣，進(jìn)樣量 15 μL，根據(jù)“2.5.2”項(xiàng)下標(biāo)準(zhǔn)曲線計算含量，求出標(biāo)示量。

阿司匹林腸溶片中ASP的分離效果見圖5，ASP保留時間為 （5.25±0.53）min，ASP 腸溶片保留時間5.10 min在此范圍。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算結(jié)果為阿司匹林腸溶片中ASP的含量為14.65 μg/片，標(biāo)示量為107.8%。由此看出，該BSA生物色譜柱能夠很好地在復(fù)雜樣品中分離并測定ASP。

3 討論

BSA是由17個雙硫鍵起穩(wěn)定作用的581個氨基酸組成的球蛋白，BSA生物色譜分離物質(zhì)的原理可能是比較容易與帶有苯環(huán)結(jié)構(gòu)的化合物結(jié)合[11]，劉文等[12]研究表明含有苯環(huán)結(jié)構(gòu)的抗結(jié)核藥對氨基水楊酸的希夫堿可以與BSA通過疏水作用相結(jié)合，除了ASP的藥理作用，它的結(jié)構(gòu)比較簡單且含一個苯環(huán)，因此本文選擇ASP來檢驗(yàn)BSA色譜柱的性能。本實(shí)驗(yàn)中，BSA鍵合固定相合成方法反應(yīng)條件溫和，試劑毒性小，能夠很好地結(jié)合ASP，且蛋白活性保持比較好，蛋白鍵合量較高，制備成的BSA生物色譜柱能夠從復(fù)雜樣品阿司匹林腸溶片中分離出ASP并測定其含量，可體外模擬人體生理?xiàng)l件下藥物與血清蛋白的作用。

圖5 ASP的BSA生物色譜圖

本文不足之處：對于驗(yàn)證BSA色譜柱分離鑒定藥物的特性是否與化合物含有苯環(huán)有關(guān)，可以考慮多選擇幾種含有苯環(huán)和不含苯環(huán)的藥物進(jìn)行對比研究；穩(wěn)定性的考察時間可以延長到BSA色譜柱完全失去活性至不能結(jié)合ASP，并進(jìn)一步分析原因。

在人體內(nèi)藥物與藥物、藥物與蛋白質(zhì)之間的相互作用難以觀察和論證，但通過應(yīng)用生物色譜技術(shù)，可以直接觀察藥物與生物活性物質(zhì)的相互作用，因?yàn)橐环N藥物對生物活性物質(zhì)的影響或者是對另一種藥物的影響，可以通過結(jié)合率和色譜保留的變化方面反映出來，對于探討藥物作用機(jī)制、條件更加直觀方便；對于應(yīng)用生物色譜柱分析其他大分子化合物結(jié)合血清白蛋白的情況有較高的價值，有利于推進(jìn)藥物學(xué)的研究進(jìn)程。

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