犯罪現(xiàn)場中潛在血跡顯現(xiàn)方法的研究

佘 歆 黃耀鵬 陳文俊 殷仕玲

一、引言

被害人或犯罪分子只要出現(xiàn)開放性損傷，犯罪現(xiàn)場就會遺留血跡。由于一些因素的影響，如犯罪人沖洗犯罪現(xiàn)場，或者年代久遠(yuǎn)，事物變遷，沾有血跡的部位、物品無意識地被破壞，都會影響勘查人員發(fā)現(xiàn)潛在的血跡。傳統(tǒng)上，要憑借勘查人員的經(jīng)驗(yàn)，借助多種光源和光學(xué)儀器來搜索血跡，但這種方法只能搜尋到與周圍客體有一定反差的血痕①孫野：《命案現(xiàn)場中血跡的魯米諾和二氫熒光素搜尋方法探析》，《吉林公安高等?？茖W(xué)校學(xué)報(bào)》2006年第4期。，對于反差較弱或者根本沒有反差的潛在血跡就無能為力，且效率低下。有關(guān)資料表明，可以使用隱色龍膽紫、二氫熒光素、無色孔雀綠、氨基黑10B、四甲基聯(lián)苯胺和魯米諾等試劑與血液中的物質(zhì)作用，使?jié)撛谘E產(chǎn)生肉眼可以觀察到的顏色變化或熒光反應(yīng)，從而達(dá)到顯現(xiàn)的目的。隨著 DNA技術(shù)廣泛應(yīng)用，通過對血跡進(jìn)行檢驗(yàn)鑒定，可以直接認(rèn)定人身。因而潛在血跡顯現(xiàn)劑是否對后期DNA檢測產(chǎn)生影響，受到刑事技術(shù)人員的關(guān)注。本課題組研究了六種血跡顯現(xiàn)劑對不同潛在血跡在不同載體和背景下的顯現(xiàn)效果，以及對 DNA檢測的影響，為犯罪現(xiàn)場潛在血跡的發(fā)現(xiàn)提供最佳的顯現(xiàn)方法。

二、實(shí)驗(yàn)材料和儀器

1．血跡顯現(xiàn)主要試劑及儀器

熒光素、魯米諾、孔雀綠、TMB、龍膽紫、氨基黑10B等試劑，試劑均為分析純，試驗(yàn)用水均為二次去離子水；多波段光源、移液器、電子天平、加熱儀器、噴霧器、照相機(jī)等儀器。

2．試劑的配制

（1）隱色龍膽紫。將0.5g龍膽紫溶于100ml醋酸中，溶解后加入鋅粉和鋅粒各10g，攪拌后置室溫下自然脫色，至溶液變?yōu)闊o色。然后再加入8g鋅粒，以保持溶液的穩(wěn)定性。靜置24小時，取其上部清液備用。①公安部政治部：《血跡形態(tài)分析》，中國人民公安大學(xué)出版社2007年版，第95-98頁。

（2）二氫熒光素。將1克熒光素溶于100mL10%的氫氧化鈉溶液，加熱，加入10克鋅粉至達(dá)到沸點(diǎn)（注:鋅并不會溶解）。溶液的顏色在這一時段內(nèi)會逐漸消褪。將溶液冷卻并等到鋅粉沉淀。謹(jǐn)慎地將溶液倒出，并保持鋅粉不被倒出來。將1份倒出的溶液與19份去離子水完全混合，此為A液。B液為10%的過氧化氫溶液。②孫野：《命案現(xiàn)場中血跡的魯米諾和二氫熒光素搜尋方法探析》，《吉林公安高等?？茖W(xué)校學(xué)報(bào)》2006年第4期。

（3）無色孔雀綠。將2g孔雀綠、8g鋅粉、50ml冰醋酸混合加熱至完全脫色，取上述溶液25ml，與100mL乙醚和0.5mL30%過氧化氫溶液混合，充分?jǐn)嚢?，制成顯現(xiàn)液。③公安部政治部：《血跡形態(tài)分析》，中國人民公安大學(xué)出版社2007年版，第95-98頁。

（4）氨基黑10B。將1g氨基黑10B溶于5ml醋酸和95ml無水乙醇的混合溶液，此為A液。B液為100ml醋酸與900ml無水乙醇的混合溶液。

（5）四甲基聯(lián)苯胺（TMB）。1gTMB溶于100ml無水乙醇，此為A液。B液為30%過氧化氫。④公安部政治部：《血跡形態(tài)分析》，中國人民公安大學(xué)出版社2007年版，第95-98頁。

（6）魯米諾。將5g無水碳酸鈉溶于100ml蒸餾水中，再加入魯米諾1g，制成儲存液，棕色瓶中冷藏避光保存。使用時取出部分溶液，按照100:6的體積比加入30%過氧化氫溶液配制成魯米諾工作液。

3． DNA檢測主要試劑及儀器

SiO2懸濁液、Tris-HCl、EDTA、SLS、HiDi、Liz 500等試劑；中國東勝龍 ETC-811加熱儀、美國AB公司 9700擴(kuò)增儀、美國AB 公司3500XL檢測儀等儀器；擴(kuò)增使用美國AB公司 Identifiler Plus試劑盒。

三、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容

1．樣本的制備

（1）血樣的制備。血液樣本均來自同一人同一時期抽取的血液。血液沒有受到任何形式的抗凝血劑或其他污染物污染。血液抽取完畢后立即稀釋，分別制作未稀釋血樣以及稀釋程度（血液：水）分別為1:10、1:100、1:500、1:1000的血樣。

（2）實(shí)驗(yàn)樣本的制備。實(shí)驗(yàn)所用載體可分為滲透性和非滲透性兩大類。非滲透性載體采用淺色瓷磚和深色瓷磚，滲透性載體采用淺色布和深色布。將上述五種不同濃度的血樣分別滴加在四種載體上，并在每種載體上標(biāo)記血樣濃度，一共制作七組這樣的樣本。1至6組分別使用隱色龍膽紫、二氫熒光素、無色孔雀綠、氨基黑10B、四甲基聯(lián)苯胺、魯米諾六種方法進(jìn)行顯現(xiàn)，第7組為空白對照組。

2．血跡的顯現(xiàn)

（1）隱色龍膽紫。滴加隱色龍膽紫溶液至第1組中各載體上，再滴加10滴30%過氧化氫溶液（使兩溶液充分接觸反應(yīng)），等待幾秒鐘，拍照記錄。

（2）二氫熒光素。將A液裝入1號噴霧器、B液裝入2號噴霧器，將1號噴霧器內(nèi)的溶液在距離載體30~45cm處噴灑于第2組中各載體上。用相同的方式噴灑兩次。等待幾秒鐘，再噴灑2號噴霧器內(nèi)的液體。用多波段光源照射于第2組上各個載體，并用裝有黃色濾光鏡相機(jī)拍照記錄。

（3）無色孔雀綠。將無色孔雀綠顯現(xiàn)液涂抹于第3組中各載體上，等待幾秒鐘，拍照記錄。

（4）氨基黑10B。用A液充分涂抹于第4組中各載體上，再用B液漂洗，拍照記錄。

（5）四甲基聯(lián)苯胺。將A液與B液以5:1混合，將混合液滴加于第5組中各載體上，等待幾秒鐘，拍照記錄。

（6）魯米諾。暗室中，將魯米諾工作液裝入噴霧器，將噴霧器內(nèi)的溶液在距離載體30~45cm處噴灑于第6組中各載體上，迅速拍照記錄。

3．DNA檢測

（1）血跡及DNA的提取。分別對六種顯現(xiàn)方法在淺布、深布、淺瓷和深瓷四種載體上處理過的不同濃度的血跡進(jìn)行提取，氨基黑10B在滲透性載體上的除外。其中對于滲透性載體（淺色布、深色布）上的血跡采用剪取原物的提取方法，對于非滲透性載體（淺色瓷磚、深色瓷磚）上的血跡采用棉簽擦拭的方法。對空白組采用相同方法處理。將提取好的血跡通過硅珠法進(jìn)行 DNA提?。ㄏ?、洗滌、洗脫）。①鄭秀芬：《法醫(yī)DNA分析》，中國人民公安大學(xué)出版社2002年版，第43-44頁。

（2）PCR擴(kuò)增及檢測。使用Identifiler Plus試劑盒分別對各組提取待用的DNA模板進(jìn)行28循環(huán)擴(kuò)增后進(jìn)行結(jié)果檢測，并通過GeneMapper ID-X軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

四、結(jié)果與討論

1．不同方法的顯現(xiàn)效果比較

分別使用隱色龍膽紫、二氫熒光素、無色孔雀綠、氨基黑10B、四甲基聯(lián)苯胺、魯米諾六種方法對淺布、深布、淺瓷和深瓷四種載體上的不同濃度的血跡進(jìn)行顯現(xiàn)，顯現(xiàn)結(jié)果見表 1。結(jié)果中+++、++、+、-、o的效果見圖1。

2．DNA檢測結(jié)果

分別對隱色龍膽紫、二氫熒光素、無色孔雀綠、四甲基聯(lián)苯胺、魯米諾這五種顯現(xiàn)方法在淺布、深布、淺瓷和深瓷四種載體上處理過的不同濃度的血跡以及氨基黑10B在淺瓷和深瓷兩種載體上處理過的不同濃度的血跡進(jìn)行提取。其中，對于滲透性載體（淺色布、深色布）上的血跡采用剪取原物的提取方法，對于非滲透性載體（淺色瓷磚、深色瓷磚）上的血跡采用棉簽擦拭的方法。將提取好的血跡通過硅珠法進(jìn)行DNA提取，并使用Identifiler Plus試劑盒進(jìn)行28循環(huán)擴(kuò)增后進(jìn)行結(jié)果檢測，未經(jīng)顯現(xiàn)劑處理的空白組中某一樣本的DNA圖譜，見圖2。通過GeneMapper ID-X軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，各組分析結(jié)果，見表2。

對未經(jīng)顯現(xiàn)劑處理的空白組通過相同方法進(jìn)行 DNA檢測，得出在淺布、深布、淺瓷和深瓷四種載體上未處理過的不同濃度的血跡均能通過以上方法檢測出16個有效位點(diǎn)。檢出有效位點(diǎn)的統(tǒng)計(jì)，排除了位點(diǎn)熒光強(qiáng)度較低、出峰不全、有雜峰干擾等情況。

表1 各組血跡的顯現(xiàn)結(jié)果

圖1 不同顯現(xiàn)效果說明

3．討論

圖2 未經(jīng)顯現(xiàn)劑處理的血液在淺瓷上稀釋程度為1∶100的DNA圖譜

表2 各組DNA檢驗(yàn)的位點(diǎn)數(shù)

圖3 二氫熒光素和魯米諾的顯現(xiàn)效果

（1）血跡濃度對顯現(xiàn)效果的影響。從表1可以看出，除氨基黑10B由于無法脫色不能在滲透性載體上使用外，未稀釋血跡采用另外五種方法的顯現(xiàn)效果都非常明顯。對于稀釋后的血跡，在滲透性和非滲透性載體上稀釋程度大于1:100時顯現(xiàn)效果均有明顯下降的趨勢，但是二氫熒光素和魯米諾在稀釋程度為1:1000時仍有較好的顯現(xiàn)效果（見圖3），這是因?yàn)闊晒夂突瘜W(xué)發(fā)光的靈敏度比較高。

（2）載體背景對顯現(xiàn)效果的影響。載體背景對六種顯現(xiàn)方法的效果均有影響，淺色背景下的顯現(xiàn)效果明顯優(yōu)于深色背景。這是由于六種顯現(xiàn)方法中，隱色龍膽紫、無色孔雀綠、氨基黑10B、四甲基聯(lián)苯胺都是使有血跡部位分別呈藍(lán)紫色、翠綠色、藍(lán)黑色和藍(lán)綠色，因此，深色背景對這些顏色有干擾。而二氫熒光素和魯米諾是使有血跡部位產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光，因此，背景顏色對這兩種方法的顯現(xiàn)效果影響較小。

（3）其他因素的干擾。案發(fā)現(xiàn)場的環(huán)境較為復(fù)雜，在實(shí)際顯現(xiàn)過程中，會受到各種因素的影響，通過這六種方法顯現(xiàn)后即使結(jié)果呈陽性，也不能確定該位置一定存在血跡。隱色龍膽紫、無色孔雀綠和四甲基聯(lián)苯胺的顯現(xiàn)原理主要是血液中存在的過氧化氫酶及血卟啉使過氧化氫釋放出初生態(tài)氧，從而氧化隱色龍膽紫、無色孔雀綠和四甲基聯(lián)苯胺，使有血跡部位呈現(xiàn)不同顏色顯出。因此，現(xiàn)場只要存在能釋放出初生態(tài)氧的物質(zhì)，對血跡顯現(xiàn)都有一定干擾，例如四甲基聯(lián)苯胺能與果汁發(fā)生顯色反應(yīng)。氨基黑10B是一種生物染色劑，對血液中的蛋白質(zhì)進(jìn)行染色。因此，即使現(xiàn)場物質(zhì)被氨基黑10B染呈藍(lán)黑色，也并不能確定其就是血跡。二氫熒光素和魯米諾的顯現(xiàn)原理主要是過氧化氫在血液中鐵元素催化下分解，從而與二氫熒光素和魯米諾兩者反應(yīng)產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光。如魯米諾與次氯酸漂白劑也能產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光。①石美森：《生物學(xué)證據(jù)研究與應(yīng)用》，法律出版社2012年版，第3-6頁。因此，還需要將現(xiàn)場初步顯現(xiàn)的疑似血跡提取后進(jìn)行確證試驗(yàn)以確定其為血跡。

（4）六種顯現(xiàn)方法對DNA檢測的影響。從表2可以看出，在非滲透性載體上，經(jīng)過四甲基聯(lián)苯胺顯現(xiàn)后的血跡的DNA檢測結(jié)果最好，缺失的位點(diǎn)最少，其次為氨基黑10B、二氫熒光素和魯米諾。滲透性體載體上血跡的DNA檢測效果普遍不如非滲透性載體上血跡的DNA檢測效果，其中經(jīng)過魯米諾顯現(xiàn)后的血跡的DNA檢測效果最好。

（5）各種顯現(xiàn)方法的局限性。六種顯現(xiàn)方法都有一定的局限性。隱色龍膽紫、無色孔雀綠和四甲基聯(lián)苯胺的顯現(xiàn)效果不佳；氨基黑10B由于無法脫色不能在滲透性載體上使用；二氫熒光素保存期限較短，必須現(xiàn)配現(xiàn)用；魯米諾必須在黑暗的環(huán)境下使用且發(fā)光時間短暫，難以拍照記錄。六種顯現(xiàn)方法都會對后期 DNA檢測造成不同程度的影響。因此，實(shí)際案發(fā)現(xiàn)場中應(yīng)首先使用多種強(qiáng)光源搜尋疑有血跡的部位，非滲透性載體上會留下血跡的輪廓，滲透性載體上血跡往往會滲入其中。而這六種顯現(xiàn)方法應(yīng)作為其他方法無法發(fā)現(xiàn)潛在血跡的前提下最后的選擇。

五、結(jié)論

研究結(jié)果表明，現(xiàn)場潛在血跡可以通過隱色龍膽紫、無色孔雀綠、氨基黑10B、四甲基聯(lián)苯胺、二氫熒光素和魯米諾試劑進(jìn)行顯現(xiàn)，顯現(xiàn)效果以后兩項(xiàng)為佳，不僅可以有效的顯現(xiàn)稀釋程度為1:1000的血跡，而且能排除載體背景的干擾；通過大量實(shí)驗(yàn)比較了六種潛在血跡顯現(xiàn)劑對后期DNA檢測影響情況，六種顯現(xiàn)劑在不同程度上對 DNA檢測均有一定的影響，其中以魯米諾試劑影響較小，比較適合應(yīng)用于犯罪現(xiàn)場潛在血跡的顯現(xiàn)。