角蛋白19片段單克隆抗體的制備及鑒定

張慧茹，翟晉豫，劉 珍，王雪琴，孟素香

（1.河南工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院，河南鄭州450001；2.河南省生物工程技術(shù)研究中心，河南鄭州450001）

細(xì)胞角蛋白19（cytokeratin 19，CK19）是一類存在于肺泡、腺泡、子宮內(nèi)膜等組織單層上皮細(xì)胞中的酸性蛋白質(zhì)，正常狀態(tài)下為寡聚體，其分子質(zhì)量為40ku，pI值為5.2，以非可溶的形式存在于細(xì)胞骨架中，當(dāng)細(xì)胞發(fā)生癌變后，CK19會(huì)隨著細(xì)胞的降解以可溶性片段的形式釋放到血液中。1992年，Bodenmuler H［1］利用細(xì)胞融合技術(shù)，制備出了2株單克隆抗體，即BM19.21和 KS19.1，經(jīng)免疫學(xué)測(cè)定，這兩種抗體可特異性地與CK19中的某些片段相結(jié)合。隨后，將這兩種抗體結(jié)合的抗原片段命名為CYFRA21－1，即目前所指的細(xì)胞角蛋白19片段。

國(guó)內(nèi)外大量研究報(bào)道指出，CYFRA21－1可作為口腔鱗狀細(xì)胞癌、宮頸鱗癌、肺癌、胰腺癌等上皮細(xì)胞腫瘤性疾病的標(biāo)志物［2－3］，通過檢測(cè) CYFRA21－1在血清中含量的變化，可用于癌癥患者上皮細(xì)胞癌的生長(zhǎng)狀況和患者愈后的分析。目前常用德國(guó)Roche、法國(guó)CIS等國(guó)外試劑盒進(jìn)行檢測(cè)。與國(guó)外產(chǎn)品相比，國(guó)內(nèi)研發(fā)的檢測(cè)試劑盒存在特異性差、靈敏度低等問題。因此，制備高效價(jià)特異性CYFRA21－1單克隆抗體，可為診斷檢測(cè)試劑盒的研發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

CYFRA21－1抗原為美國(guó)Cal Bioreagents公司產(chǎn)品；成年雌性Balb／c小鼠為鄭州大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心飼養(yǎng)；Quick AntibodyTM免疫佐劑為北京康碧泉生物科技有限公司產(chǎn)品；SP2／0小鼠骨髓瘤細(xì)胞由河南工業(yè)大學(xué)動(dòng)物生理實(shí)驗(yàn)室保存；HAT、PEG4000、RPMI－1640培養(yǎng)基均為 Gibco公司產(chǎn)品；牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）為上海尚寶生物科技有限公司產(chǎn)品；HRP－羊抗鼠IgG為Jackson公司產(chǎn)品；重組蛋白A親和層析柱為上海工碩生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；小鼠亞型鑒定試劑盒為北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 抗原免疫 取5只雌性 Balb／c小鼠，按Quick AntibodyTM免疫佐劑使用說明，在每只小鼠大腿肌肉注射抗原與佐劑等體積混合溶液，初次免疫抗原使用量為30μg／只，2周后進(jìn)行2次免疫，抗原使用量為30μg／只。7d后，采集尾血，以間接ELISA法檢測(cè)抗體效價(jià)。同時(shí)給對(duì)照小鼠按照相同免疫程序注射等體積PBS（pH7.2）溶液，獲得對(duì)照血清。融合前5d，尾靜脈注射50μg／只的抗原加強(qiáng)免疫。

1.2.2 間接ELISA檢測(cè)方法的建立 參照河南工業(yè)大學(xué)動(dòng)物生理實(shí)驗(yàn)室常規(guī)ELISA檢測(cè)體系，采用棋盤法建立間接ELISA檢測(cè)方法。調(diào)整CYFRA21－1抗原濃度分別為0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7μg／mL，37℃包被2h，洗滌1遍，每孔加入含10g／L BSA的PBST溶液150μL，37℃封閉2h后，拍干。將1 000倍稀釋的抗原免疫小鼠血清作為陽性、注射PBS的小鼠血清作為陰性分別加入，37℃溫育30min后，PBST洗滌5遍、拍干，將HRP－羊抗鼠IgG 稀釋4 000、5 000、6 000、7 000、8 000倍，按每孔100μL加入，37℃溫育30min，PBST洗滌5遍、拍干，加入TMB顯色劑，37℃下溫育20min，用2mol／L的H2SO4終止反應(yīng)，測(cè)定各孔450nm的吸光值，依據(jù)P／N值最大原則確立間接ELISA檢測(cè)方法的條件。

1.2.3 細(xì)胞融合及mAb篩選 挑選CYFRA21－1抗體效價(jià)高的小鼠作為融合用鼠進(jìn)行細(xì)胞融合。培養(yǎng)SP2／0骨髓瘤細(xì)胞至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，同時(shí)制備免疫小鼠的脾臟細(xì)胞懸液，分別計(jì)數(shù)后，以1∶5～1∶10的比例混合，用50%PEG 4 000進(jìn)行細(xì)胞融合。將融合細(xì)胞以2.0×106個(gè)／孔鋪在含飼養(yǎng)層的96孔板中，加入5μg／mL的HAT篩選培養(yǎng)液培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞。在培養(yǎng)第3天半量換液，6d以后全量換液，培養(yǎng)10d后，觀察雜交瘤細(xì)胞形成的克隆團(tuán)數(shù)目，統(tǒng)計(jì)融合率；第11天取含克隆團(tuán)細(xì)胞的培養(yǎng)上清液，采用間接ELISA法檢測(cè)克隆團(tuán)上清中的抗體效價(jià)。將抗體陽性孔的細(xì)胞以有限稀釋法進(jìn)行細(xì)胞的單克隆化，統(tǒng)計(jì)克隆率及陽性率，細(xì)胞單克隆化以所有細(xì)胞孔呈現(xiàn)100%陽性率為止。

1.2.4 小鼠腹水mAb的制備及純化 將篩選得到的單克隆細(xì)胞株以106個(gè)細(xì)胞／只注入小鼠腹腔制備腹水。待小鼠腹水生成至最大量，脫頸處死小鼠，收集腹水，以間接ELISA法檢測(cè)腹水抗體效價(jià)。采用辛酸硫酸銨法、蛋白A柱對(duì)腹水中的抗體進(jìn)行純化。

1.2.5 mAb的鑒定 以SDS－PAGE、紫外分光光度法檢測(cè)抗體純度和濃度；利用鼠抗體亞型鑒定試劑盒對(duì)單克隆抗體進(jìn)行亞型鑒定；采用阻斷ELISA法［2］測(cè)定 mAb的敏感性（IC50）。

1.2.6 特異性鑒定 參考孫敏華等［3－4］的研究方法建立雙抗體夾心ELISA檢測(cè)方法，分別檢測(cè)CK8、CK18、人絨毛促性腺激素（HCG）、人促卵泡素（FSH）是否與CYFRA21－1之間存在交叉反應(yīng)，檢驗(yàn)檢測(cè)方法的特異性。

2 結(jié)果

2.1 間接ELISA檢測(cè)方法的確立

采用棋盤法篩選，將包被抗原與酶標(biāo)抗體進(jìn)行倍比稀釋，按照P／N值最高、陽性的吸光度大于陰性對(duì)照2倍以上的原則，確定抗原包被濃度為0.4μg／mL、HRP－羊抗鼠IgG抗體稀釋6 000倍時(shí)為最佳的間接ELISA檢測(cè)條件。

2.2 小鼠pAb的檢測(cè)

加強(qiáng)免疫后第7天采集小鼠尾血，采用間接ELISA法檢測(cè)血清的抗體效價(jià)。檢測(cè)結(jié)果如表1所示。以大于陰性O(shè)D值（不足0.05按照0.05計(jì)算）2.1倍為效價(jià)檢測(cè)最低水平判斷，結(jié)果表明，2號(hào)、3號(hào)小鼠血清的抗體效價(jià)達(dá)到2×105，較其余小鼠高，選擇這2只小鼠為脾細(xì)胞的來源鼠。

2.3 細(xì)胞融合及其克隆化篩選

細(xì)胞融合第10天，統(tǒng)計(jì)細(xì)胞克隆團(tuán)數(shù)目，融合率達(dá)到84.17%。融合第11天檢測(cè)培養(yǎng)液上清，篩選得到4株分泌高效價(jià)抗體的陽性雜交瘤細(xì)胞株，分別命名2F9、3H5、7C3、6F11。結(jié)果如表2所示。

3H5經(jīng)4次克隆化到達(dá)100%克隆率，其余經(jīng)3次克隆化達(dá)到100%的克隆率。

2.4 mAb效價(jià)的檢測(cè)

將4株單克隆細(xì)胞株注入小鼠腹腔，7d～14d收集腹水，采用倍比稀釋法，用間接ELISA方法檢測(cè)腹水效價(jià)，結(jié)果見圖1。

結(jié)果顯示，4株單抗2F9、3H5、7C3、6F11腹水中抗體效價(jià)分別為2.56×105、5.12×105、5.12×105、2.56×105。

表2 雜交瘤細(xì)胞株的克隆Table 2 Coloning of hybridoma cells

圖1 mAb腹水效價(jià)（1 000×）Fig.1 The titration of monocolonial antibody in ascites（1 000×）

2.5 mAb的純化及濃度測(cè)定

利用辛酸硫酸銨法、蛋白A層析柱純化腹水抗體。經(jīng)SDS－PAGE證實(shí)，4株單克隆抗體電泳均形成2條大小分別約為55ku和25ku的條帶，符合鼠源抗體特點(diǎn)（圖2）。將純化后的抗體蛋白稀釋100倍后，經(jīng)紫外分光光度測(cè)定吸光度值，依據(jù)蛋白濃度與吸光度值的關(guān)系計(jì)算抗體蛋白濃度（表3）。

圖2 純化后抗體SDS－PAGE檢測(cè)Fig.2 Detection of purified antibodies by SDS－PAGE

2.6 mAb的亞型鑒定

用抗體亞型檢測(cè)試劑盒對(duì)4株mAb的抗體亞型進(jìn)行鑒定，4株mAb的亞型均為IgG1類。

2.7 mAb的敏感性測(cè)定

采用阻斷ELISA方法，測(cè)定4株mAb的IC50結(jié)果見表4。繪制各株mAb抗體的抑制曲線。

表3 紫外分光光度測(cè)定純化的抗體蛋白濃度Table 3 Detection of purified antibody concentration by ultraviolet spectrometry mg／mL

表4 mAb的敏感性測(cè)定Table 4 Sensitivity detection of mAb

由圖3計(jì)算，2F9的回歸方程為y＝－0.353 4x＋0.507 9，R2＝0.989 7，2F9 的 IC50為1.03ng／mL；3H5的回歸方程為y＝－0.419 8x＋0.581 8，R2＝0.980 5，3H5的IC50為1.53ng／mL；7C3的回歸方程為y＝－0.381 1x＋0.559 6，7C3的IC50為1.40ng／mL；6F11 的 回 歸 方 程 為 y＝－0.412 5x＋0.535 5，6F11的IC50為1.21ng／mL，說明4株單克隆抗體的敏感性均較好，滿足試劑盒單克隆抗體要求。

2.8 單克隆抗體特異性鑒定

為驗(yàn)證獲得的4株單抗特異性，與角蛋白家族CK8、CK18及人血清中存在的CYFRA21－1類似物人絨毛促性腺激素（HCG）、人促卵泡素（FSH）進(jìn)行間接ELISA法檢測(cè)后對(duì)比顯示，篩選獲得的4株單克隆抗體與其他各類物質(zhì)間的交叉反應(yīng)率均小于0.1%，說明其特異性較好（表5）。

圖3 4株mAb的抑制曲線Fig.3 Inhibition curves of 4mAb strains

表5 CYFRA21－1與類似物的交叉反應(yīng)性Table 5 The cross－reactivity of CYFRA21－1with its analogs

3 討論

眾多研究表明，細(xì)胞角蛋白19（CK19）可作為檢測(cè)上皮性實(shí)體癌血源性微轉(zhuǎn)移的靶基因，血清中CYFRA21－1的含量可作為肺癌、食管癌等相關(guān)上皮細(xì)胞癌變的診斷參考指標(biāo)之一［5－6］。但國(guó)內(nèi)針對(duì)檢測(cè) CYFRA21－1的試劑盒報(bào)道并不多見［7］。王彪等［8］采用時(shí)間分辨熒光免疫法制備CYFRA21－1試劑盒，通過分析比較1 057例血清CYFRA21－1濃度發(fā)現(xiàn)，正常人血清中CYFRA21－1的濃度在0ng／mL～4.0ng／mL；張忠英等［9］隨機(jī)調(diào)查70名正常人血清中 CYFRA21－1的濃度，確定其參考值為1.84ng／mL±0.65ng／mL，因此設(shè)定正常人血清CYFRA21－1的均值為3.36ng／mL，與Roch公司提供的參考值≤3.3ng／mL接近；閔鐘云等［10］在研究喉癌病例時(shí)發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組血清CYFRA21－1濃度為2.43ng／mL±1.09ng／mL，而喉癌組CYFRA21－1的濃度為5.16ng／mL±3.64ng／mL。從上述研究中可以看出，人血清中CYFRA21－1的含量較低，且隨著疾病的發(fā)生出現(xiàn)微量的變化，因此，需要制備靈敏性較高的單克隆抗體才能適用于血清CYFRA21－1的檢測(cè)。

小細(xì)胞肺癌主要表達(dá)CK18，有時(shí)可有CK8和CK19表達(dá)，而肺腺癌發(fā)病過程中有CK7、CK8、CK18和CK19的同時(shí)表達(dá)，鱗癌時(shí)也有大量角蛋白因子表達(dá)［11］，為此檢測(cè) CYFRA21－1與代表性角蛋白因子CK8、CK18的交叉反應(yīng)；人絨毛促性腺激素（HCG）、人促卵泡素（FSH）是血清中 CYFRA21－1的主要類似物［7］。因此，測(cè)定其與 CK8、CK18、HCG、FSH的交叉反應(yīng)，以確定4株單抗的反應(yīng)特異性。

本研究采用Quick AntibodyTM免疫佐劑，比常規(guī)免疫3次～4次減少了一半，不僅節(jié)省抗原、減少免疫乳化的操作，且多克隆抗體產(chǎn)生快、效價(jià)高，該佐劑的使用為細(xì)胞融合提供了優(yōu)質(zhì)的候選小鼠。在高融合率的保證下，通過單克隆化篩選獲得4株分泌高效價(jià)單克隆抗體的細(xì)胞株，將細(xì)胞株注入腹腔制備腹水，常規(guī)方法純化抗體后，獲得的4株單克隆抗體IC50在1.0ng／mL～1.5ng／mL之間，能夠滿足正常人血清中低水平CYFRA21－1含量檢測(cè)的需要。

本試驗(yàn)采用Quick AntibodyTM免疫佐劑與CYFRA21－1抗原混合的方式免疫小鼠，采取產(chǎn)生高效價(jià)多克隆抗體的小鼠脾臟與骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞融合，篩選獲得4株高效價(jià)、敏感性強(qiáng)的IgG1型CYFRA21－1單克隆抗體，為后期制備CYFRA21－1檢測(cè)試劑盒奠定了基礎(chǔ)。

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