奶山羊乳房炎滅活疫苗的制備及免疫效果檢測

侯偉杰，張立強，高 洋，趙玄多，趙燕清，劉 方，高晶暉，張淼濤，陳德坤

（西北農(nóng)林科技大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，陜西楊凌712100）

奶山羊乳房炎常發(fā)生于泌乳期，在產(chǎn)前及干乳期有時也發(fā)生此?。?］。調(diào)查顯示，目前我國奶山羊隱性乳房炎的檢出率較高，陜西為45.5%，山東為50.9%，云南為35.6%，全國平均為43%左右［2］，與世界平均水平45%～50%［3］相當(dāng)。乳房炎不僅會降低乳產(chǎn)量和乳質(zhì)量，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，還會直接影響奶山羊的泌乳機能，導(dǎo)致乳腺失去泌乳性能，甚至造成羊只死亡，是對奶山羊養(yǎng)殖業(yè)危害最嚴(yán)重的疫病之一。傳統(tǒng)的抗生素療法，不僅造成耐藥菌株的大量產(chǎn)生，同時還帶來嚴(yán)重的食品安全隱患［4－6］。利用疫苗來控制傳染性疾病是一種經(jīng)典預(yù)防手段。利用疫苗防治奶山羊乳房炎不僅有助于降低乳腺感染程度，還可控制亞臨床乳房炎。奶山羊隱性乳房炎的主要病原菌是葡萄球菌和大腸埃希菌，其中葡萄球菌又分為金黃色葡萄球菌和凝固酶陰性葡萄球菌，后者包括表皮葡萄球菌和產(chǎn)色葡萄球菌［7］。據(jù)此，我們利用本實驗室分離保存的隱性乳房炎主要病原菌制備了滅活疫苗，并對疫苗的免疫效果進(jìn)行了評估。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗用動物 處于泌乳期20d左右成年莎能奶山羊。

1.1.2 菌株 大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、凝固酶陰性產(chǎn)色葡萄球菌、凝固酶陰性表皮葡萄球菌，均為西北農(nóng)林科技大學(xué)獸醫(yī)免疫學(xué)實驗室分離鑒定保存的奶山羊乳房炎病原菌。

1.1.3 主要試劑及培養(yǎng)基 普通瓊脂平板，LB液體培養(yǎng)基；辣根過氧化物酶標(biāo)二抗（兔抗羊IgGHRP）、可溶性單組分TMB底物溶液及蛋白定量試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；奶山羊隱性乳房炎診斷液由本實驗室制備（配方獲發(fā)明專利，授權(quán)號：ZL 200910024340.7）；氯化鈉，硫酸鋁鉀，氫氧化鈉，EDTA，無水乙醇等。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌懸液制備 將菌株分別接種于LB液體培養(yǎng)基，37℃、200r／min搖床培養(yǎng)12h～16h。取100μL培養(yǎng)菌液用平板菌落計數(shù)法計數(shù)，分別調(diào)整細(xì)菌濃度為：產(chǎn)色葡萄球菌和表皮葡萄球菌為5×109CFU／mL；大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌終濃度為2.5×109CFU／mL。

1.2.2 細(xì)菌滅活 向調(diào)整好濃度的菌液中加入終濃度為3mL／L的甲醛溶液。37℃、200r／min振蕩，大腸埃希菌滅活48h，葡萄球菌滅活96h后，取適量菌液涂LB平板，37℃培養(yǎng)24h，觀察平板有無菌落形成。將滅活的菌液以12 000r／min離心5 min，棄上清、收集菌體沉淀，最后用無菌生理鹽水重懸。

1.2.3 疫苗的制備 將滅活的產(chǎn)色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、大腸埃希菌和金黃色葡萄球菌按照其在隱性乳房炎乳汁中的比例混合，然后按6∶1（V／V）與本實驗室制備的鋁膠鹽佐劑充分混勻，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 免疫試驗 免疫前，用隱性乳房炎快速診斷試劑對泌乳期20d左右的81只奶山羊進(jìn)行普查。根據(jù)普查結(jié)果，將奶山羊進(jìn)行如下分組：10只乳房炎陰性奶山羊作為對照組，試驗中不做任何處理。另外71只奶山羊按照免疫途徑不同分成2組，頸部皮下免疫組（35只）和腹股溝免疫組（36只），其中頸部皮下免疫組35只奶山羊有21只乳房炎陰性、14只患隱性乳房炎；腹股溝免疫組的36只奶山羊有26只乳房炎陰性、10只患隱性乳房炎。免疫時，兩組的免疫劑量均為2mL／只。首免后間隔14d，以同樣的劑量和部位再次進(jìn)行免疫。

1.2.5 樣本采集 在免疫前及第1次免疫后10、24、60、180d采取所有羊的乳汁和血液樣本。分離乳清和血清，保存于－20℃用于后續(xù)測定。

1.2.6 抗體效價測定 參照文獻(xiàn)［8］的方法，制備病原菌的可溶性蛋白，并用蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度后包被96孔酶標(biāo)板，用棋盤滴定法確定ELISA反應(yīng)的最佳條件，以陽性樣本吸光值減去空白對照后，值大于且最接近1.0的為最佳包被濃度。用建立的ELISA法測定乳清、血清中各種病原菌抗體效價。P／N≥2.1判為陽性，否則判為陰性。

1.2.7 隱性乳房炎檢測 分別在第1次免疫后的10、24、60、180d用奶山羊乳房炎快速診斷液檢測各組隱性乳房炎奶山羊數(shù)目。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌滅活效果

大腸埃希菌滅活48h，葡萄球菌滅活96h后，取100μL菌液涂LB平板，37℃，培養(yǎng)24h后，觀察，平板上無菌落形成，表明細(xì)菌滅活完全徹底。

2.2 乳中各病原抗體測定結(jié)果

大腸埃希菌、表皮葡萄球菌、產(chǎn)色葡萄球菌可溶性蛋白的最佳包被濃度分別為15、15、20μg／mL；金黃色葡萄球菌則需用全菌進(jìn)行包被，最佳包被濃度為1×109CFU／mL（50mL／L戊二醛）。

經(jīng)過兩次免疫，在一免后10d～60d范圍內(nèi)，兩個免疫組乳中針對各病原菌抗體效價均顯著高于對照組（P＜0.05），針對各病原菌的抗體效價均在24d達(dá)到峰值，約為對照組的16倍左右，在60d時抗體效價約為對照組的8倍左右。此外，檢測結(jié)果顯示，頸部皮下和腹股溝兩種免疫途徑對乳中抗體效價影響不明顯（圖1～圖4）。

2.3 血中病原菌抗體測定結(jié)果

免疫后血中大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌及產(chǎn)色葡萄球菌抗體效價在24d達(dá)到峰值，約為對照組的100倍，其中頸部皮下免疫組中大腸埃希菌和產(chǎn)色葡萄球菌抗體效價在10d～60d范圍內(nèi)均顯著高于對照組（P＜0.05）（圖5、圖6、圖8）；表皮葡萄球菌血中抗體效價僅經(jīng)頸部皮下免疫時在首免后24d顯著高于對照組（P＜0.05）（圖7）；在其他時間點同對照組相比兩免疫組抗體效價有增加，但增加不明顯。此外，頸部皮下和腹股溝兩種免疫途徑對血中抗體效價影響不明顯。

圖1 乳中大腸埃希菌抗體效價Fig.1 Milk antibody titers against E.coli

圖2 乳中金黃色葡萄球菌抗體效價Fig.2 Milk antibody titers against S.aureus

圖3 乳中表皮葡萄球菌抗體效價Fig.3 Milk antibody titers aginst S.epidermidis

圖5 血中大腸埃希菌抗體效價Fig.5 Serum antibody titers against E.coli

圖6 血中金黃色葡萄球菌抗體效價Fig.6 Serum antibody titers against S.aureus

2.4 隱性乳房炎檢出結(jié)果

在整個試驗過程中，對照組的奶山羊隱性羊乳房炎均未檢出。在免疫后10d～24d期間，兩個免疫組隱性乳房炎奶山羊檢出率均迅速下降；但24d后，腹股溝免疫組的隱性乳房炎檢出率開始快速回升；60d時，檢出率基本與免疫前水平持平。相比之下，頸部皮下免疫組的檢出率雖然也從24d后開始回升，但升幅較慢，直到180d，該組的檢出率還明顯低于免疫前水平（圖9）。結(jié)果表明，本研究制備的乳房炎疫苗對奶山羊隱性乳房炎有一定的治療效果，尤其是經(jīng)頸部皮下免疫時效果更顯著。

圖7 血中表皮葡萄球菌抗體效價Fig.7 Serum antibody titers against S.epidermidis

圖8 血中產(chǎn)色葡萄球菌抗體效價Fig.8 Serum antibody titers against S.chromogenes

圖9 不同免疫組隱性乳房炎檢出率Fig.9 Subclinical mastitis rate in different immune groups

3 討論

在泌乳早期，機體由于受到圍產(chǎn)期內(nèi)代謝改變［9－11］、巨噬細(xì)胞吞噬功能損傷及中性粒細(xì)胞活性下降［12－13］、抗體濃度及亞型變化［14］等的影響，乳腺的免疫保護(hù)作用會明顯下降。此階段乳腺更易被病原菌入侵而發(fā)生乳房炎。因此本研究選擇泌乳20d左右的奶山羊作為試驗對象，以更準(zhǔn)確地反應(yīng)疫苗的免疫效果。國內(nèi)外大量的研究結(jié)果表明，乳汁體細(xì)胞數(shù)（Somatic cell，SC）在乳腺感染病原微生物后呈顯著升高的特點，并且感染越嚴(yán)重，SC數(shù)量就越高［15］。因此，測定乳汁SC并據(jù)此判定山羊隱性乳房炎，是當(dāng)前國內(nèi)外普遍采用的方法，也是最常用的方法。相對于奶牛而言，奶山羊乳汁中的體細(xì)胞數(shù)普遍偏高，并且正常奶山羊乳汁體細(xì)胞數(shù)量變化范圍更大，更容易受到物理性因素的影響［16］，因而奶牛體細(xì)胞數(shù)的檢測標(biāo)準(zhǔn)不適用于奶山羊。本實驗室研發(fā)的奶山羊隱性乳房炎快速診斷液已獲發(fā)明專利授權(quán)，通過大量的試驗比對，該診斷液檢測準(zhǔn)確率高，檢測結(jié)果可靠，方法簡便。因而，本研究中，我們采用自行研制的奶山羊隱性乳房炎診斷液作為判定工具。

我們前期的乳房炎調(diào)查結(jié)果顯示，奶山羊隱性乳房炎的病原菌主要以凝固酶陰性表皮葡萄球菌（占26%）、凝固酶陰性產(chǎn)色葡萄球菌（占20%）、金黃色葡萄球菌（占15%）、大腸埃希菌（占18%）［2］為主。因此，只要奶山羊?qū)@4種病原菌產(chǎn)生較強的抵抗力，即可大大降低乳房炎的發(fā)病率。據(jù)此，本研究以這4種菌為材料制備滅活疫苗。

為了測定疫苗的有效保護(hù)期，本研究進(jìn)行了為期180d的抗體檢測。結(jié)果表明，該苗刺激機體產(chǎn)生的抗體持續(xù)時間長。通過對頸部皮下和腹股溝皮下兩種不同的免疫途徑的比較，發(fā)現(xiàn)不同免疫部位對機體抗體產(chǎn)生的影響較小，基于此，我們推薦采取頸部皮下免疫，以便于生產(chǎn)實踐操作。

疫苗保護(hù)效果評估主要包括兩個內(nèi)容，即免疫指標(biāo)測定和免疫保護(hù)試驗（又稱攻毒試驗）。本研究制備的乳房炎疫苗為胞外寄生菌滅活疫苗，抗體在抗胞外菌感染中具有重要作用，因此我們測定的免疫指標(biāo)是針對細(xì)菌的抗體效價。由于人工攻毒試驗在攻毒劑量、攻毒途徑、時間選擇等因素上都無法完全模擬自然感染，故而同居感染試驗結(jié)果最能夠反應(yīng)疫苗免疫效果。本研究的疫苗免疫試驗全部在奶山羊養(yǎng)殖場進(jìn)行，所用奶山羊在免疫前其隱性乳房炎的平均檢出率在30%左右，表明其飼養(yǎng)環(huán)境中存在大量乳房炎病原菌。因此，在這種環(huán)境中進(jìn)行疫苗免疫試驗，并統(tǒng)計試驗期間各組奶山羊乳房炎的檢出率，統(tǒng)計結(jié)果能夠更確切的反應(yīng)疫苗免疫效果。本研究結(jié)果表明，我們制備的乳房炎滅活疫苗，經(jīng)頸部皮下免疫接種后能夠獲得較理想的免疫效果。此外，一般的疫苗僅具有預(yù)防作用，接種對象也僅限于正常健康個體。而本研究制備的疫苗，還可免疫接種患隱性乳房炎的奶山羊，并且對隱性乳房炎有較好的治療效果，具有很好的推廣價值。

［1］ 趙會茹，王正新.奶山羊乳房炎的診治［J］.畜牧獸醫(yī)雜志2010（4）：128－132.

［2］ 姚運亮.我國奶山羊主要養(yǎng)殖省份隱性乳房炎的調(diào)查及病原菌多重PCR檢測方法的建立［D］.陜西楊凌：西北農(nóng)林科技大學(xué)，2013.

［3］ Bergonier D，Berthelot X.New advances in epizootiology and control of ewe mastitis［J］.Livest Produc Sci，2003，79（1）：1－16.

［4］ 周慶民，薄俊平，馮萬宇，等.抗生素在奶牛臨床上的使用現(xiàn)狀［J］.奶牛養(yǎng)殖，2009（6）：56－59.

［5］ 劉 琴.我國牛奶中抗生素殘留現(xiàn)狀分析及對策［J］.當(dāng)代畜牧，2005（6）：1－2.

［6］ 郭 軍，劉艷輝，李翠枝.乳及乳制品的抗生素和其他獸藥殘留問題［J］.中國乳品工業(yè)，2004，32（9）：28－32.

［7］ 姚運亮，田婷婷，許君艷，等.關(guān)中奶山羊隱性乳房炎病原菌的分離鑒定［J］.動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展2013，34（4）：116－119.

［8］ 牟 珊，李成山，陳德坤.關(guān)中奶山羊乳房炎滅活疫苗的制備及其免疫效果測定［J］.動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2011，32（11）：76－80.

［9］ Waller K P.Mammary gland immunology around parturition［J］.Biol Mammary Gland：Springer，2002（480）：231－245.

［10］ Preisler M T，Weber P S，Tempelman R J，et al.Glucocorticoid receptor expression profiles in mononuclear leukocytes of periparturient Holstein cows［J］.J Dairy Sci，2000（83）：38－47.

［11］ Kehrli M E，Burton J L，Nonnecke B J，et al.Effects of stress on leukocyte trafficking and immune responses：implications for vaccination［J］.Adv Vet Med，1999（41）：61－81.

［12］ Cai T－Q，Weston P G，Lund L A，et al.Association between neutrophil functions and periparturient disorders in cows［J］.Am J Vet Res，1994（55）：934－943.

［13］ Dosogne H，Vangroenweghe F，Barrio B，et al.Decreased number and bactericidal activity against Staphylococcus aureus of the resident cells in milk of dairy cows during early lactation［J］.J Dairy Res，2001（68）：539－549.

［14］ Mallard B A，Dekkers J C，Ireland M J，et al.Alteration in immune responsiveness during the peripartum period and its ramification on dairy cow and calf health［J］.J Dairy Sci，1998（81）：585－595.

［15］ Poutrel B，De Crémoux R，Ducelliez M，et al.Control of intramammary infections in goats：impact on somatic cell counts［J］.J Anim Sci，1997，75（2）：566－570.

［16］ Bergonier D，De Crémoux R，Rupp R，et al.Mastitis of dairy small ruminants［J］.Vet Res，2003，34（5）：689－716.