牛乳金黃色葡萄球菌分離株超抗原腸毒素基因分型研究

孫 穎，湯婷婷，鮑慶晗，郭海勇＊，崔京春

（1.吉林師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，吉林四平136000；2.大連民族學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，遼寧大連116600）

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）是引起人及動(dòng)物感染的重要病原菌之一，其中產(chǎn)超抗原毒素的葡萄球菌具有極強(qiáng)的致病性，引起人毒素性休克癥、化膿癥等多種疾病，尤其是耐藥菌株（MRSA）絕大部分可產(chǎn)生超抗原毒素，交叉污染傳播而又難以治療，對(duì)人類(lèi)健康造成了嚴(yán)重威脅；引起奶牛、羊的乳腺炎，給養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)了重大經(jīng)濟(jì)損失［1］。金黃色葡萄球菌能產(chǎn)生多種毒素，主要包括腸毒素（enterotoxins，SEs）、休克綜合征毒素－1（toxic－shock syndrome toxin－1，TSST－1）、剝落毒素（exfoliative toxins，ETs）和殺白細(xì)胞素（panton－valentine leukocidin，PVL），其中腸毒素是引起多種疾病及食物中毒的主要因子［2－3］。根據(jù)生物學(xué)特性和基因結(jié)構(gòu)相關(guān)性解析，目前已發(fā)現(xiàn)了SEA、SEB、SEC、SED、SEE、SEG－I及 SER－T 11 種 腸 毒 素，SE1J－Q、SE1U－X12種腸毒素類(lèi)似毒素和毒性休克綜合征毒素1 （TSST－1）等24種葡萄球菌超抗原毒素［4－7］。國(guó)內(nèi)外有較多奶牛乳腺炎金黃色葡萄球菌毒素基因流行情況的調(diào)查研究，從患乳腺炎奶牛乳樣中分離的金黃色葡萄球菌近80%產(chǎn)生超抗原毒素，但不同地區(qū)分離株所含超抗原毒素基因型不同，本研究根據(jù)金黃色葡萄球菌腸毒素基因（sea～see）、中毒性休克綜合征毒素基因（tst）及femA、femB基因設(shè)計(jì)合成引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢測(cè)四平地區(qū)某牛場(chǎng)患病牛乳金黃色葡萄球菌分離株毒素基因分型情況，對(duì)不同地區(qū)和來(lái)源的金黃色葡萄球菌菌株之間關(guān)系及分子流行病學(xué)的研究提供科學(xué)的理論依據(jù)，對(duì)及時(shí)有效控制金黃色葡萄球菌奶牛乳腺炎奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)株（ATCC12600）由大連吉翔農(nóng)業(yè)科技有限公司研究中心保藏提供；金黃色葡萄球菌834株（陽(yáng)性對(duì)照）由日本北里大學(xué)胡東良教授惠贈(zèng)；金黃色葡萄球菌分離株SP－3從患奶牛乳腺炎的乳樣中分離，由吉林師范大學(xué)微生物實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 試 劑 DNA Marker、ExTaq 聚 合 酶、dNTP、瓊脂糖等試劑均購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司；柱式基因組DNA抽提試劑盒購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司；EDTA、Tris－base等購(gòu)自北京鼎國(guó)生物技術(shù)公司；其他生化試劑均為國(guó)產(chǎn)或進(jìn)口分析純?cè)噭?/p>

1.1.3 儀器設(shè)備 MCV－131BNF 超凈臺(tái)為日本SANYO公司產(chǎn)品；SIGMA 1－14冷凍臺(tái)式離心機(jī)為Sigma公司產(chǎn)品；UV－1240紫外分光光度計(jì)為日本島津公司產(chǎn)品；全自動(dòng)數(shù)碼凝膠成像分析系統(tǒng)為BIO－RAD公司產(chǎn)品；MG25＋PCR擴(kuò)增儀為杭州朗基公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)合成 參照 Omoe等［8］報(bào)道設(shè)計(jì)合成金黃色葡萄球菌SEA－SEE及TSST－1等6種超抗原毒素基因及金黃色葡萄球菌特異基因femA和femB的PCR擴(kuò)增引物（表1），引物由寶生物工程（大連）有限公司合成。

表1 金黃色葡萄球菌超抗原特異引物序列及擴(kuò)增片段Table 1 Sequences and sizes of staphylococcal superantigen－specific primers

1.2.2 金黃色葡萄球菌基因組DNA的提取及純度分析 取4℃保存的3株金黃色葡萄球菌斜面分別劃線(xiàn)接種到卵黃甘露醇高鹽瓊脂平板上，37℃培養(yǎng)24h，選取單菌落接種至胰胨大豆胨肉湯培養(yǎng)基中，37℃搖床培養(yǎng)20h，按照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒說(shuō)明提取各菌株的基因組DNA。用紫外分光光度計(jì)分別測(cè)定DNA稀釋溶液在波長(zhǎng)260nm和280nm處的吸光度值，計(jì)算OD260／OD280的平均值。

1.2.3 金黃色葡萄球菌femA、femB基因及毒素基因的PCR擴(kuò)增 以金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)株（ATCC12600）、金黃色葡萄球菌834株及金黃色葡萄球菌分離株基因組DNA為模板，進(jìn)行金黃色葡萄球菌各型腸毒素基因PCR擴(kuò)增，同時(shí)設(shè)置以滅菌水為模板的陰性對(duì)照組。反應(yīng)體系為50μL，DNA模板2μL，Mg2＋（25mmol／L）4μL，dNTP（各2.5 mmol／L）4μL，上游引物（10μmol／L）2μL，下游引物（10μmol／L）2μL，TaqDNA 聚合酶（0.5U）0.5 μL，10× ExTaqbuffer 5μL，無(wú)菌水補(bǔ)至50μL。反應(yīng)條件：95℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃60 s，30個(gè)循環(huán)；72℃10min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)10g／L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 金黃色葡萄球菌基因組DNA的純度分析

將提取的各菌株基因組DNA適當(dāng)稀釋后分別用紫外分光光度計(jì)測(cè)各菌株基因組DNA樣品的OD260、OD280，經(jīng)計(jì)算各基因組DNA的OD260／OD280的平均值均在1.825～1.848之間，表明提取的總DNA純度較高，沒(méi)有蛋白和RNA的污染。

2.2 金黃色葡萄球菌分離株femA、femB基因PCR擴(kuò)增結(jié)果

以金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)株（ATCC12600）、834株及SP－3分離株的基因組DNA為模板，進(jìn)行femA、femB基因的PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖1A和圖1B。femA和femB基因是金黃色葡萄球菌染色體固有基因，是其特異的表達(dá)基因且高度保守。從圖1可以看出，金黃色葡萄球菌對(duì)照株和分離株均擴(kuò)增出大小為134bp的femA特征帶和大小為651bp的femB特征帶，滅菌水陰性對(duì)照組無(wú)條帶出現(xiàn)，因此SP－3分離株可鑒定為金黃色葡萄球菌。

2.3 金黃色葡萄球菌分離株超抗原腸毒素基因檢測(cè)結(jié)果

以SP－3分離株的DNA為模板，分別加入SEA－SEE、TST各組PCR引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果如圖2所示。金黃色葡萄球菌對(duì)照菌株和SP－3分離株經(jīng)PCR擴(kuò)增，凝膠電泳分析其攜帶超抗原毒素基因型結(jié)果見(jiàn)表2［8－9］。由電泳結(jié)果分析，金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)株ATCC12600和陰性對(duì)照組均無(wú)擴(kuò)增出特征條帶，不攜帶超抗原毒素基因。而攜帶sec（271 bp）、tst－1（447bp）基因的金黃色葡萄球菌834株均出現(xiàn)清晰的陽(yáng)性條帶，并且各條帶大小與實(shí)際相符。金黃色葡萄球菌SP－3分離株攜帶多種超抗原腸毒素基因，共檢出sea、sec、sed和tst－1 4種超抗原腸毒素基因。

圖1 金黃色葡萄球菌femA、femB基因PCR擴(kuò)增Fig.1 PCR amplication of femA and femB gene of S.aureus

圖2 金黃色葡萄球菌SP－3分離株超抗原毒素基因PCR擴(kuò)增Fig.2 PCR amplication of sea－see and tst－1genes fromS.aureus SP－3isolate

表2 金黃色葡萄球菌SP－3分離株攜帶超抗原毒素基因型Table 2 Genotypes of the S.aureus SP－3isolate harboring superantigenic toxins

3 討論

金黃色葡萄球菌是引起奶牛乳腺炎的主要傳染性病原菌，常常通過(guò)各種傳播途徑在牛群中傳播，引起奶產(chǎn)量下降，影響乳品質(zhì)。同時(shí)也是引起細(xì)菌性食物中毒的主要病原菌，且在整個(gè)細(xì)菌性食物中毒案例中位居前列。金黃色葡萄球菌攜帶多種腸毒素，隨著對(duì)其生物學(xué)特性和基因水平的探索，發(fā)現(xiàn)了許多新型的金黃色葡萄球菌腸毒素，而且腸毒素之間可以水平傳播［10］，與金黃色葡萄球菌的致病性有一定的相關(guān)性；另外，超抗原腸毒素基因的分布與菌株的來(lái)源也存在一定的相關(guān)性［11］。因此，金黃色葡萄球菌超抗原腸毒素的檢測(cè)與分型，為金黃色葡萄球菌奶牛乳腺炎的防治和監(jiān)控金黃色葡萄球菌毒素引起的食物中毒及追溯污染源提供了理論依據(jù)。

金黃色葡萄球菌femA或femB基因?yàn)槠涮禺愋詸z測(cè)靶基因，在金黃色葡萄球菌中高度保守［12］，利用femA或femB基因作為金黃色葡萄球菌陽(yáng)性對(duì)照的PCR方法已有很多報(bào)道，本研究建立的PCR方法檢測(cè)SP－3分離株存在femA和femB基因，證實(shí)SP－3分離株為金黃色葡萄球菌。femA和femB基因是MRSA所特有的mecA基因的輔助調(diào)控基因，在與mecA基因協(xié)同才能表達(dá)對(duì)甲氧西林的耐藥性具有重要的作用。因此，檢測(cè)femA基因或femB基因可作為金黃色葡萄球菌快速鑒定及耐藥性的判斷。

同一金黃色葡萄球菌菌株可以檢測(cè)到多種腸毒素基因型，且并存的頻率較高。本研究分離的SP－3株經(jīng)檢測(cè)，共檢出sea、sec、sed和tst－1 4種超抗原腸毒素基因，這與夏勝超等［13］從隱性乳腺炎乳樣中分離的12.3%（7／57）陽(yáng)性菌株攜帶毒素情況一致。Larsen H D等［14］報(bào)道sec、sed 和tst－1 是奶牛乳腺炎金黃色葡萄球菌產(chǎn)生的重要毒素，而安福生等［15］報(bào)道sea、sec和tst－1是奶牛乳腺炎金黃色葡萄球菌產(chǎn)生的重要毒素，均少于SP－3分離株攜帶的毒素種類(lèi)，表明本地區(qū)奶牛乳腺炎金黃色葡萄球菌具有較強(qiáng)的致病性，與奶牛乳腺炎患病率較高相符，金黃色葡萄球菌分離株攜帶腸毒素基因比例比較高，且含有多種不同類(lèi)型的腸毒素基因。謝秀蘭等［16］報(bào)道了寧夏地區(qū)奶牛隱性乳腺炎金黃色葡萄球菌分離株腸毒素基因的檢出率及種類(lèi)多于臨床型乳腺炎，SEA－SEE均被檢出，但未檢測(cè)TSST－1超抗原毒素。國(guó)內(nèi)外研究報(bào)道已經(jīng)從生牛乳及乳制品金黃色葡萄球菌分離株中檢測(cè)出 SEA－SEE、SEG－SEI、SElJ、SElQ、SER 及 TSST－1 等 多 種 超 抗 原 毒素［17－19］，涵蓋了目前發(fā)現(xiàn)的多種金黃色葡萄球菌腸毒素，不同地域的分離菌株攜帶腸毒素基因型存在一定的差異，為防治金黃色葡萄球菌奶牛乳腺炎帶來(lái)困難。目前本課題組正加大樣本數(shù)量，對(duì)四平地區(qū)及其他地區(qū)乳源金黃色葡萄球菌的分離及其腸毒素的檢測(cè)，為降低奶牛乳腺炎的患病率，確保乳源的安全奠定基礎(chǔ)。今后將進(jìn)一步開(kāi)展多地區(qū)動(dòng)物及動(dòng)物性食品金黃色葡萄球菌超抗原毒素基因分型，為深入研究毒素基因的分布與菌株來(lái)源的相關(guān)性奠定基礎(chǔ)，為防控人和動(dòng)物金黃色葡萄球菌感染提供更可靠的理論依據(jù)。

［1］ 郭海勇，郭偉生，崔京春，等.理化因素對(duì)葡萄球菌無(wú)毒誘變超抗原GST－mTSST－1免疫活性的影響［J］.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，32（2）：48－51.

［2］ XieY P，He Y P，Gehring A，et al.Genotypes and toxin gene profiles of Staphylococcus aureus clinical isolates from China［J］.PLoS One，2011，6（12）：e28276.

［3］ Argudín M A，Mendoza M C，González－Hevia M A，et al.Genotypes，exotoxin gene content，and antimicrobial resistance of Staphylococcus aureus strains recovered from foods and food handlers［J］.Appl Environ Microbiol，2012，78（8）：2930－2935.

［4］ Vasconcelos N G，Pereira V C，Araújo Júnior J P，et al.Mo－lecular detection of enterotoxins E，G，H and I in Staphylococcus aureus and coagulase－negative staphylococci isolated from clinical samples of newborns in Brazil［J］.J Appl Microbiol，2011，111（3）：749－762.

［5］ Yu C C，Wan W L，Chin M F，et al.PCR detection of staphylococcal enterotoxins（SEs）N，O，P，Q，R，U，and survey of SE types in Staphylococcus aureus isolates from food－poisoning cases in Taiwan［J］.Int J Food Microbiol，2008，121（1）：66－73.

［6］ Ono H K，Omoe K，Imanishi K，et al.Identification and characterization of two novel staphylococcal enterotoxins，types S and T［J］.Infect Immun，2008，76（11）：4999－5005.

［7］ Cheung G Y C，Otto M.The potential use of toxin antibodies as a strategy for controlling acute Staphylococcus aureus infections［J］.Expert Opin Ther Tar，2012，16（6）：601－612.

［8］ Omoe K，Hu D L，Takahashi Omoe H，et al.Comprehensive analysis of classical and newly described staphylococcal superantigenic toxin genes in Staphylococcus aureus isolates［J］.FEMS Microbiol Lett，2005，246（2）：191－198.

［9］ 崔京春，郭海勇，張 獻(xiàn)，等.人體表金黃色葡萄球菌超抗原毒素基因型系統(tǒng)分析［J］.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2013，44（8）：81－86.

［10］ Le Maréchal C，Seyffert N，Jardin J，et al.Molecular basis of virulence in Staphylococcus aureus mastitis［J］.PLoS One，2011，6（11）：e27354.

［11］ 史 紅，王 娟，鄭增忍，等.金黃色葡萄球菌耐藥性及腸毒素分型研究［J］.動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2012，33（6）：87－90.

［12］ Giannouli S，Labrou M，Kyritsis A，et al.Detection of mutations in the FemXAB protein family in oxacillin－susceptible mecA－positive Staphylococcus aureus clinical isolates［J］.J Antimicrob Chemother，2010 ，65（4）：626－633.

［13］ 夏勝超，吳聰明，王紹琛，等.奶牛乳房炎病例中金黃色葡萄球菌毒素基因的檢測(cè)［J］.中國(guó)獸醫(yī)雜志，2007，43（4）：23－24.

［14］ Larsen H D，Aarestrup F M，Jensen N E.Geographical variation in the presence of genes encoding superantigenic exotoxins and beta－h(huán)emolysin among Straphylococcus aureus isolated from bovine mastitis in Europe and USA［J］.Vet Microbiol，2002，85（1）：61－67.

［15］ 安福生，董玉蘭，馬保臣.奶牛乳腺炎金黃色葡萄球菌超抗原的檢測(cè)［J］.中國(guó)獸醫(yī)雜志，2008，44（3）：9－11.

［16］ 謝秀蘭，劉溪源，王建東，等.乳源金黃色葡萄球菌9種腸毒素基因的檢測(cè)［J］.動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2014，35（7）：25－28.

［17］ 王 娟，黃秀梅，劉書(shū)科，等.牛奶中金黃色葡萄球菌的耐藥性及其腸毒素分型研究［J］.中國(guó)獸醫(yī)雜志，2013，49（3）：30－32.

［18］ Hummerjohann J，Naskova J，Baumgartner A，et al.Enterotoxin－producing Staphylococcus aureus genotype B as a major contaminant in Swiss raw milk cheese［J］.J Dairy Sci，2014，97（3）：1305－1312.

［19］ Rahimi E.Enterotoxigenicity of Staphylococcus aureus isolated from traditional and commercial dairy products marketed in Iran［J］.Braz J Microbiol，2013，44（2）：393－399.