正交設(shè)計在花椰菜不育系叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)中的應(yīng)用

劉慶+朱世楊+張小玲+彭花崇+羅天寬

摘要：為給“甌雪60天”制種中核不育系母本9901A組培快繁提供依據(jù)，以9901A花球表面花枝為外植體，采用正交設(shè)計方法對培養(yǎng)基中TDZ、BA、NAA、2，4-D 4種激素濃度配比進(jìn)行篩選。結(jié)果表明：MS+6-BA0.5mg/L +NAA0.001mg/L芽誘導(dǎo)率最大，為94%，但每外植體平均誘導(dǎo)芽數(shù)為1.1個；MS+TDZ0.1mg/L+NAA0.001mg/L每外植體平均誘導(dǎo)芽數(shù)最大，為10個，但芽誘導(dǎo)率為50%。TDZ和NAA濃度適中促進(jìn)外植體平均芽數(shù)的誘導(dǎo)，過高則抑制外植體平均芽數(shù)的誘導(dǎo)；2，4-D 和6-BA總體表現(xiàn)為隨濃度增加而抑制外植體平均芽數(shù)的誘導(dǎo)。

關(guān)鍵詞：噻二唑苯基脲（TDZ）；花椰菜；誘導(dǎo)培養(yǎng)；正交設(shè)計

中圖分類號 S63 文獻(xiàn)標(biāo)識碼A文章編號1007-7731（2014）13-61-02

Application of Orthogonal Design in Multiple Shoots Induction of Cauliflower Male Sterile Lines

Liu Qing1，2 et al.

（1Wenzhou Academy of Agricultural Science，Wenzhou 325000，China；2Wenzhou Vocational College of Science and Technology，Wenzhou 325000，China）

Abstract：In order to provide a certain reference for rapid propagation of the female parent 9901A（genic male sterile lines） of "Ou xue 60 days"，concentrations of TDZ，BA，NAA，2，4-D on multiple shoots induction were screening by orthogonal design method.The results show that，the budding induction rate of MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.001mg/L was the highest （94%） with budding induction number 1.1 per explants；and the budding induction number of MS+TDZ0.1mg/L+NAA0.001mg/L was the highest（10 per plant）with budding induction rate 50%.It was suggested that TDZ and NAA had a promoting effect on budding induction with moderate concentration.The effect of 2，4-D and 6-BA on budding induction was reduced as the concentration increased.

Key words：Thidiazuron；Cauliflower；Induction culture；Orthogonal design

花椰菜雜種優(yōu)勢明顯，生產(chǎn)用種多為雜交種，主要通過自交不親和系和雄性不育系來雜交制種。利用自交不親和系制種成本高，雜交種純度難以保障，而利用雄性不育系雜交制種成本低，種子純度高?；ㄒ恕爱T雪60天”雜交制種母本9901A為隱性核基因控制的不育系，需應(yīng)用植物組織培養(yǎng)技術(shù)才能短期內(nèi)大量繁殖［1］。花椰菜組織培養(yǎng)中，培養(yǎng)基中的激素濃度的配比是關(guān)鍵。岳冬梅研究了6-BA、NAA、IBA的不同濃度配比對花椰菜叢生芽和生根誘導(dǎo)培養(yǎng)的影響［2］；吳麗芳等研究發(fā)現(xiàn)MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.3mg/L的培養(yǎng)基上誘導(dǎo)花椰菜不育系不定芽分化率達(dá)到96%［3］；許端祥等研究發(fā)現(xiàn)了花椰菜自交不親和系腋芽增殖培養(yǎng)基為MS+6-BA2mg/L+NAA0.1mg/L［4］。TDZ（噻二唑苯基脲）是一種植物生長調(diào)節(jié)劑，具有很強(qiáng)的細(xì)胞分裂素活性，在桑樹［5］、大豆［6］等植物組織培養(yǎng)已有研究應(yīng)用，但在花椰菜組織培養(yǎng)中的應(yīng)用研究尚未見報道。本文報道了TDZ、6-BA、NAA、2，4-D對“甌雪60天”母本9901A叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)的影響，為9901A快速繁殖提供參考。

1 材料與方法

1.1 外植體 以“甌雪60天”母本9901A采收期割球割下的花枝作為接種外植體。

1.2 培養(yǎng)基 MS基本培養(yǎng)基中按照L9（34）正交設(shè)計加入TDZ、6-BA、NAA、2，4-D作為誘導(dǎo)培養(yǎng)基（表1和表2）。所有培養(yǎng)基均為蔗糖3.0%，瓊脂0.7%，pH值5.8。

表1 正交試驗(yàn)設(shè)計

[水平&A=TDZ

（mg/L）&B=2，4-D

（mg/L）&C=NAA

（mg/L）&D=6-BA

（mg/L）&1&0&0&0&0&2&0.1&0.01&0.001&0.5&3&1.0&0.1&0.01&5&]

1.3 誘導(dǎo)培養(yǎng) 取花球表面3mm厚花枝切成2～3mm小塊，接種于上述誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，每瓶接種5小塊，然后置于培養(yǎng)室培養(yǎng)（溫度24±2℃，每天光照12h）。接種時間2010年12月30日。

1.4 統(tǒng)計方法 接種50d后，統(tǒng)計芽誘導(dǎo)率和平均誘導(dǎo)芽數(shù)。芽誘導(dǎo)率（%）=誘導(dǎo)出芽的外植體數(shù)/接種的外植體數(shù)×100；平均誘導(dǎo)芽數(shù)（%）=誘導(dǎo)出的芽數(shù)/接種的外植體數(shù)×100。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度激素配比對花椰菜芽誘導(dǎo)率的影響 由表2可以看出，在設(shè)定的濃度水平上4種激素對花椰菜芽誘導(dǎo)率的影響，最主要的因素為因子A（TDZ濃度），極差最大，為16.0；其次是因子D（6-BA濃度），極差為15.4；再次是因子B（2，4-D濃度），極差為14.0；最次是因子C（NAA濃度），極差最小，為12.7。而各激素不同濃度水平的均值大小依此為：TDZ為0＞1.0＞0.1mg/L；2，4-D為0.1＞0.01＞0mg/L；NAA為0.01＞0＞0.001mg/L；6-BA為0.5＞5＞0mg/L。直觀分析結(jié)果表明，花椰菜芽誘導(dǎo)率最佳條件是A1B1C3D2，即培養(yǎng)基配方為MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.001mg/L。

表2 芽誘導(dǎo)率L9（34）正交試驗(yàn)結(jié)果與直觀分析

[試驗(yàn)號&A=TDZ（mg/L）&B=2，4-D

（mg/L）&C=NAA

（mg/L）&D=6-BA

（mg/L）&芽誘導(dǎo)率

（%）&1&1&1&3&2&94&2&1&2&1&1&82&3&1&3&2&3&86&4&2&1&2&1&50&5&2&2&3&3&76&6&2&3&1&2&88&7&3&1&1&3&76&8&3&2&3&2&84&9&3&3&2&1&88&k1&87.3&73.3&82&73.3&&k2&71.3&80.7&73.3&88.7&&k3&82.7&87.3&86&79.3&&R&16.0&14.0&12.7&15.4&&]

endprint

2.2 不同濃度激素配比對花椰菜平均誘導(dǎo)芽數(shù)的影響 由表3可以看出，在設(shè)定的濃度水平上，影響花椰菜平均誘導(dǎo)芽數(shù)最主要的因素為因子D（6-BA濃度），極差最大，為4.20；其次是因子A（TDZ濃度）和C（NAA濃度），極差均為2.93；最后是因子B（2，4-D濃度），極差為1.83。而各激素不同濃度水平的均值大小依此為：TDZ為0.1＞0＞1mg/L；2，4-D為0＞0.01＞0.1mg/L；NAA為0.001＞0＞0.01mg/L；6-BA為0＞5＞0.5mg/L。直觀分析結(jié)果表明，花椰菜平均誘導(dǎo)芽數(shù)最佳條件是A2B1C2D1，即培養(yǎng)基配方為MS+TDZ0.1mg/L+NAA0.001mg/L。

表3 平均誘導(dǎo)芽數(shù)L9（34）正交試驗(yàn)結(jié)果與直觀分析

[試驗(yàn)號&A=TDZ（mg/L）&B=2，4-D（mg/L）&C=NAA

（mg/L）&D=6-BA

（mg/L）&平均誘導(dǎo)芽數(shù)

（個/外植體）&1&1&1&3&2&1.1&2&1&2&1&1&4.9&3&1&3&2&3&2.3&4&2&1&2&1&10.0&5&2&2&3&3&1.3&6&2&3&1&2&2.3&7&3&1&1&3&1.3&8&3&2&3&2&1.2&9&3&3&2&1&2.3&k1&2.77&4.13&2.83&5.73&&k2&4.53&2.47&4.50&1.53&&k3&1.60&2.30&1.57&1.63&&R&2.93&1.83&2.93&4.20&&]

4 結(jié)論與討論

應(yīng)用正交設(shè)計可以大量減少試驗(yàn)次數(shù)，提高試驗(yàn)效率和結(jié)果的準(zhǔn)確性，已經(jīng)廣泛用于植物組織培養(yǎng)研究［7］。本研究發(fā)現(xiàn)，在各激素所選的濃度范圍內(nèi)，對于花椰菜芽誘導(dǎo)率作用大小依此為TDZ＞6-BA＞2，4-D＞NAA；各激素不同濃度對芽誘導(dǎo)率的影響表現(xiàn)為：芽誘導(dǎo)率隨著2，4-D的提高而提高，隨著TDZ、NAA濃度的提高呈現(xiàn)先下降再上升，隨著6-BA濃度的提高呈現(xiàn)先上升再下降。直觀分析認(rèn)為，MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.001mg/L有利于提高芽誘導(dǎo)率，為94%，但每外植體平均誘導(dǎo)芽數(shù)為1.1個。

本研究還發(fā)現(xiàn)，在各激素所選的濃度范圍內(nèi)，對于花椰菜平均誘導(dǎo)芽數(shù)的作用大小依次為6-BA＞TDZ= NAA＞2，4-D；其中TDZ和NAA濃度適中促進(jìn)外植體平均芽數(shù)的誘導(dǎo)，過高則抑制外植體平均芽數(shù)的誘導(dǎo)；2，4-D和6-BA總體表現(xiàn)為隨濃度增加而抑制外植體平均芽數(shù)的誘導(dǎo)。直觀分析認(rèn)為，MS+TDZ0.1mg/L+NAA0.001mg/L有利于提高平均誘導(dǎo)芽數(shù)，每外植體平均誘導(dǎo)芽數(shù)為10個，但芽誘導(dǎo)率僅50%。

綜上所述，通過正交設(shè)計優(yōu)化篩選出芽誘導(dǎo)率最高的培養(yǎng)基為MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.001mg/L，平均誘導(dǎo)芽數(shù)最高的培養(yǎng)基為MS+TDZ0.1mg/L+NAA0.001mg/L，兩者并不一致。這是由于實(shí)驗(yàn)中叢生芽形成途徑有經(jīng)過愈傷組織分化和直接誘導(dǎo)形成2種途徑，并且各激素不同濃度水平變化對愈傷組織誘導(dǎo)和叢生芽分化的影響效果也不一樣，有待于進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)

［1］張小玲，唐征，劉慶，等.花椰菜雄性不育突變株的發(fā)現(xiàn)及利用［J］.核農(nóng)學(xué)報，2012，26（3）：450-453.

［2］岳冬梅.花椰菜的組織快繁［J］.遼寧農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，4：50.

［3］吳麗芳，蔣亞蓮，張藝萍，等.花椰菜雄性不育系組織快繁及無糖培養(yǎng)技術(shù)［J］.北方園藝，2009（6）：57-58.

［4］許端祥，方淑桂，陳文輝.花椰菜自交不親和系組培快繁技術(shù)研究［J］.福建農(nóng)業(yè)科技，2006，5：32-34.

［5］黃艷紅，牟志美，樊金會，等.噻二唑苯基脲對桑樹愈傷組織誘導(dǎo)的影響［J］.蠶業(yè)科學(xué)，2006，32（1）：103-105.

［6］聶王星，於丙軍.TDZ和6-BA對大豆子葉節(jié)再生體系中叢生芽誘導(dǎo)的效應(yīng)［J］.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2012，35（4）：130-134.

［7］陳政，李程斌，何家寶，等.正交設(shè)計在驅(qū)蚊草組織培養(yǎng)中的應(yīng)用［J］.安徽師范大學(xué)學(xué)報，2008，31（4）：364-367.

（責(zé)編：張宏民）

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2.2 不同濃度激素配比對花椰菜平均誘導(dǎo)芽數(shù)的影響 由表3可以看出，在設(shè)定的濃度水平上，影響花椰菜平均誘導(dǎo)芽數(shù)最主要的因素為因子D（6-BA濃度），極差最大，為4.20；其次是因子A（TDZ濃度）和C（NAA濃度），極差均為2.93；最后是因子B（2，4-D濃度），極差為1.83。而各激素不同濃度水平的均值大小依此為：TDZ為0.1＞0＞1mg/L；2，4-D為0＞0.01＞0.1mg/L；NAA為0.001＞0＞0.01mg/L；6-BA為0＞5＞0.5mg/L。直觀分析結(jié)果表明，花椰菜平均誘導(dǎo)芽數(shù)最佳條件是A2B1C2D1，即培養(yǎng)基配方為MS+TDZ0.1mg/L+NAA0.001mg/L。

表3 平均誘導(dǎo)芽數(shù)L9（34）正交試驗(yàn)結(jié)果與直觀分析

[試驗(yàn)號&A=TDZ（mg/L）&B=2，4-D（mg/L）&C=NAA

（mg/L）&D=6-BA

（mg/L）&平均誘導(dǎo)芽數(shù)

（個/外植體）&1&1&1&3&2&1.1&2&1&2&1&1&4.9&3&1&3&2&3&2.3&4&2&1&2&1&10.0&5&2&2&3&3&1.3&6&2&3&1&2&2.3&7&3&1&1&3&1.3&8&3&2&3&2&1.2&9&3&3&2&1&2.3&k1&2.77&4.13&2.83&5.73&&k2&4.53&2.47&4.50&1.53&&k3&1.60&2.30&1.57&1.63&&R&2.93&1.83&2.93&4.20&&]

4 結(jié)論與討論

應(yīng)用正交設(shè)計可以大量減少試驗(yàn)次數(shù)，提高試驗(yàn)效率和結(jié)果的準(zhǔn)確性，已經(jīng)廣泛用于植物組織培養(yǎng)研究［7］。本研究發(fā)現(xiàn)，在各激素所選的濃度范圍內(nèi)，對于花椰菜芽誘導(dǎo)率作用大小依此為TDZ＞6-BA＞2，4-D＞NAA；各激素不同濃度對芽誘導(dǎo)率的影響表現(xiàn)為：芽誘導(dǎo)率隨著2，4-D的提高而提高，隨著TDZ、NAA濃度的提高呈現(xiàn)先下降再上升，隨著6-BA濃度的提高呈現(xiàn)先上升再下降。直觀分析認(rèn)為，MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.001mg/L有利于提高芽誘導(dǎo)率，為94%，但每外植體平均誘導(dǎo)芽數(shù)為1.1個。

本研究還發(fā)現(xiàn)，在各激素所選的濃度范圍內(nèi)，對于花椰菜平均誘導(dǎo)芽數(shù)的作用大小依次為6-BA＞TDZ= NAA＞2，4-D；其中TDZ和NAA濃度適中促進(jìn)外植體平均芽數(shù)的誘導(dǎo)，過高則抑制外植體平均芽數(shù)的誘導(dǎo)；2，4-D和6-BA總體表現(xiàn)為隨濃度增加而抑制外植體平均芽數(shù)的誘導(dǎo)。直觀分析認(rèn)為，MS+TDZ0.1mg/L+NAA0.001mg/L有利于提高平均誘導(dǎo)芽數(shù)，每外植體平均誘導(dǎo)芽數(shù)為10個，但芽誘導(dǎo)率僅50%。

綜上所述，通過正交設(shè)計優(yōu)化篩選出芽誘導(dǎo)率最高的培養(yǎng)基為MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.001mg/L，平均誘導(dǎo)芽數(shù)最高的培養(yǎng)基為MS+TDZ0.1mg/L+NAA0.001mg/L，兩者并不一致。這是由于實(shí)驗(yàn)中叢生芽形成途徑有經(jīng)過愈傷組織分化和直接誘導(dǎo)形成2種途徑，并且各激素不同濃度水平變化對愈傷組織誘導(dǎo)和叢生芽分化的影響效果也不一樣，有待于進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)

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［2］岳冬梅.花椰菜的組織快繁［J］.遼寧農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，4：50.

［3］吳麗芳，蔣亞蓮，張藝萍，等.花椰菜雄性不育系組織快繁及無糖培養(yǎng)技術(shù)［J］.北方園藝，2009（6）：57-58.

［4］許端祥，方淑桂，陳文輝.花椰菜自交不親和系組培快繁技術(shù)研究［J］.福建農(nóng)業(yè)科技，2006，5：32-34.

［5］黃艷紅，牟志美，樊金會，等.噻二唑苯基脲對桑樹愈傷組織誘導(dǎo)的影響［J］.蠶業(yè)科學(xué)，2006，32（1）：103-105.

［6］聶王星，於丙軍.TDZ和6-BA對大豆子葉節(jié)再生體系中叢生芽誘導(dǎo)的效應(yīng)［J］.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2012，35（4）：130-134.

［7］陳政，李程斌，何家寶，等.正交設(shè)計在驅(qū)蚊草組織培養(yǎng)中的應(yīng)用［J］.安徽師范大學(xué)學(xué)報，2008，31（4）：364-367.

（責(zé)編：張宏民）

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2.2 不同濃度激素配比對花椰菜平均誘導(dǎo)芽數(shù)的影響 由表3可以看出，在設(shè)定的濃度水平上，影響花椰菜平均誘導(dǎo)芽數(shù)最主要的因素為因子D（6-BA濃度），極差最大，為4.20；其次是因子A（TDZ濃度）和C（NAA濃度），極差均為2.93；最后是因子B（2，4-D濃度），極差為1.83。而各激素不同濃度水平的均值大小依此為：TDZ為0.1＞0＞1mg/L；2，4-D為0＞0.01＞0.1mg/L；NAA為0.001＞0＞0.01mg/L；6-BA為0＞5＞0.5mg/L。直觀分析結(jié)果表明，花椰菜平均誘導(dǎo)芽數(shù)最佳條件是A2B1C2D1，即培養(yǎng)基配方為MS+TDZ0.1mg/L+NAA0.001mg/L。

表3 平均誘導(dǎo)芽數(shù)L9（34）正交試驗(yàn)結(jié)果與直觀分析

[試驗(yàn)號&A=TDZ（mg/L）&B=2，4-D（mg/L）&C=NAA

（mg/L）&D=6-BA

（mg/L）&平均誘導(dǎo)芽數(shù)

（個/外植體）&1&1&1&3&2&1.1&2&1&2&1&1&4.9&3&1&3&2&3&2.3&4&2&1&2&1&10.0&5&2&2&3&3&1.3&6&2&3&1&2&2.3&7&3&1&1&3&1.3&8&3&2&3&2&1.2&9&3&3&2&1&2.3&k1&2.77&4.13&2.83&5.73&&k2&4.53&2.47&4.50&1.53&&k3&1.60&2.30&1.57&1.63&&R&2.93&1.83&2.93&4.20&&]

4 結(jié)論與討論

應(yīng)用正交設(shè)計可以大量減少試驗(yàn)次數(shù)，提高試驗(yàn)效率和結(jié)果的準(zhǔn)確性，已經(jīng)廣泛用于植物組織培養(yǎng)研究［7］。本研究發(fā)現(xiàn)，在各激素所選的濃度范圍內(nèi)，對于花椰菜芽誘導(dǎo)率作用大小依此為TDZ＞6-BA＞2，4-D＞NAA；各激素不同濃度對芽誘導(dǎo)率的影響表現(xiàn)為：芽誘導(dǎo)率隨著2，4-D的提高而提高，隨著TDZ、NAA濃度的提高呈現(xiàn)先下降再上升，隨著6-BA濃度的提高呈現(xiàn)先上升再下降。直觀分析認(rèn)為，MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.001mg/L有利于提高芽誘導(dǎo)率，為94%，但每外植體平均誘導(dǎo)芽數(shù)為1.1個。

本研究還發(fā)現(xiàn)，在各激素所選的濃度范圍內(nèi)，對于花椰菜平均誘導(dǎo)芽數(shù)的作用大小依次為6-BA＞TDZ= NAA＞2，4-D；其中TDZ和NAA濃度適中促進(jìn)外植體平均芽數(shù)的誘導(dǎo)，過高則抑制外植體平均芽數(shù)的誘導(dǎo)；2，4-D和6-BA總體表現(xiàn)為隨濃度增加而抑制外植體平均芽數(shù)的誘導(dǎo)。直觀分析認(rèn)為，MS+TDZ0.1mg/L+NAA0.001mg/L有利于提高平均誘導(dǎo)芽數(shù)，每外植體平均誘導(dǎo)芽數(shù)為10個，但芽誘導(dǎo)率僅50%。

綜上所述，通過正交設(shè)計優(yōu)化篩選出芽誘導(dǎo)率最高的培養(yǎng)基為MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.001mg/L，平均誘導(dǎo)芽數(shù)最高的培養(yǎng)基為MS+TDZ0.1mg/L+NAA0.001mg/L，兩者并不一致。這是由于實(shí)驗(yàn)中叢生芽形成途徑有經(jīng)過愈傷組織分化和直接誘導(dǎo)形成2種途徑，并且各激素不同濃度水平變化對愈傷組織誘導(dǎo)和叢生芽分化的影響效果也不一樣，有待于進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)

［1］張小玲，唐征，劉慶，等.花椰菜雄性不育突變株的發(fā)現(xiàn)及利用［J］.核農(nóng)學(xué)報，2012，26（3）：450-453.

［2］岳冬梅.花椰菜的組織快繁［J］.遼寧農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，4：50.

［3］吳麗芳，蔣亞蓮，張藝萍，等.花椰菜雄性不育系組織快繁及無糖培養(yǎng)技術(shù)［J］.北方園藝，2009（6）：57-58.

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（責(zé)編：張宏民）

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